一种虫草素在制备预防口蹄疫病毒感染的药物中的应用的制作方法

本发明涉及兽用药物技术领域，具体涉及一种虫草素在制备预防口蹄疫病毒感染的药物中的应用。

背景技术：

口蹄疫病毒是一类小rna病毒科的一种无包膜单股正链rna病毒。现已发现该病毒包括a型、o型、c型、亚洲i型和南非ⅰ、ⅱ、ⅲ型等7种血清型，同时各血清型又分为多个亚型。由该病毒导致的口蹄疫，主要感染猪、牛等偶蹄类动物，常在口、鼻、蹄等部位形成水泡并伴随发热、跋行等临床症状。口蹄疫传播途径多、流行范围广和传染性强，目前在多个国家频繁暴发，已严重威胁全球畜牧业的发展，并对世界经济和人类社会造成了巨大影响。它被世界动物卫生组织列为a类动物疫病名单之首，我国也将该病排在一类动物传染病名单的第一位，同时也是《国家中长期动物疫病防治规划(2012-2020年)》中的三个单列病种之一。目前，疫苗免疫是防控口蹄疫的主要手段，然而疫苗的使用存在“免疫窗口期”即它不能在7天之内对动物提供保护。因此，为了弥补“免疫窗口期”，急需开发新型有效的抗病毒药物。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供虫草素(cordycepin)在制备预防口蹄疫病毒感染的药物中的应用。所述应用能够为进一步控制口蹄疫的传播提供一类高效、安全且质量可控的抗口蹄疫病毒药物。

本发明提供了虫草素在制备预防口蹄疫病毒感染的药物中的应用。

优选的是，所述口蹄疫病毒包括a型口蹄疫病毒和o型口蹄疫病毒。

优选的是，所述虫草素在所述药物中的浓度＞800μmol/l。

本发明提供了虫草素在制备预防口蹄疫病毒感染的药物中的应用。虫草素对a型口蹄疫病毒和o型口蹄疫病毒诱导的细胞病变均有抑制作用，抑制病毒的复制。细胞试验显示，虫草素细胞毒性低，对a型口蹄疫病毒和o型口蹄疫病毒的复制均具有抑制作用；进一步的实验证实，虫草素只是在fmdv复制早期起作用，而进入病毒复制后期时则不能阻止病毒的复制。虫草素能够作为一种有效的抗口蹄疫病毒成分。

附图说明

图1为本发明实施例1中不同浓度的cordycepin对ibrs-2细胞的细胞毒性图；

图2为本发明实施例1中不同浓度的cordycepin对o型fmdv感染ibrs-2细胞的抑制作用图；

图3为本发明实施例1中不同浓度的cordycepin对a型fmdv感染ibrs-2细胞的抑制作用图；

图4为本发明实施例1中不同浓度的cordycepin对o型fmdv感染ibrs-2细胞中的fmdvmrna抑制作用图；

图5为本发明实施例1中不同浓度的cordycepin对o型fmdv感染ibrs-2细胞中的fmdvvp1蛋白抑制作用图；

图6为本发明实施例1中ifa检测不同浓度的cordycepin对o型fmdv感染细胞的fmdv蛋白表达抑制作用图；

图7为本发明实施例1中q-pcr检测cordycepin对fmdv吸附、穿入阶段中的mrna抑制作用图；

图8为本发明实施例1中cordycepin在不同时间段对病毒感染细胞的fmdvmrna表达水平抑制作用图；

图9为本发明实施例1中cordycepin在不同时间段对病毒感染细胞的vp1蛋白表达水平抑制作用图。

具体实施方式

本发明提供了虫草素在制备预防口蹄疫病毒感染的药物中的应用。在本发明中，所述口蹄疫病毒包括a型口蹄疫病毒和o型口蹄疫病毒。虫草素对a型口蹄疫病毒和o型口蹄疫病毒诱导的细胞病变均有抑制作用，抑制病毒的复制，虫草素只是在fmdv复制早期起作用，而进入病毒复制后期时则不能阻止病毒的复制。本发明对虫草素的来源没有特殊的限定，采用本领域常规市售产品即可。

在本发明中，所述虫草素在所述药物中的浓度优选＞800μmol/l。

下面结合具体实施例对本发明所述的一种虫草素在制备预防口蹄疫病毒感染的药物中的应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

实施例1

1.实验材料

1.1细胞、病毒和药物

ibrs-2细胞由本课题组保存；fmdv(o/my98/by/2010和a/gdmm/cha/2013)由国家口蹄疫参考实验室保存并提供；cordycepin购自mce公司，以dmso进行配制。

1.2试剂

dmem、胎牛血清fbs、胰蛋白酶培养基购自gibco公司；mts检测试剂盒购自abcam公司；trizol购自invitrogen公司；sybrpremixextaq^ⅱ试剂盒均购自宝生物工程(大连)有限公司；ripa裂解液、bca法蛋白定量试剂盒、sds-page凝胶配制试剂盒、ecl购自碧云天公司；bsa、pvdf膜购自biorad公司；吐温-20购自上海生工生物工程公司；tritonx-100、dmso购自sigma公司；小鼠抗β-actin多克隆抗体、hrp标记抗兔或抗鼠igg抗体均购自abcam公司；兔抗o型fmdvvp1多克隆抗体由国家口蹄疫参考实验室郑海学博士惠赠；兔抗o型fmdv高免血清由国家口蹄疫参考实验室周广青惠赠。

2.实验方法和结果

2.1cordycepin在ibrs-2细胞上的毒性实验：

采用mts法测定cordycepin对ibrs-2细胞的细胞毒性。待铺到96孔板ibrs-2细胞生长满单层后，弃掉细胞上层培养液，用新鲜的dmem洗3次，最后加入用含2％fbs的dmem培养液梯度稀释好的cordycepin100μl，以cordycepin的配制溶液相应dmso浓度作为阴性对照孔，以不作任何处理作细胞对照孔。放入37℃持续培养72h，弃掉上层细胞培养液，用新鲜的dmem洗三次，再加入100μl新鲜的dmem，每孔加入20μlmts溶液。37℃孵育4h后在酶标仪上测490nm处的吸光度值，根据公式“细胞活性率＝(od药物-od空白)/(od阴性-od空白)×100％”计算出不同浓度的cordycepin对ibrs-2细胞的毒性。实验独立重复三次。

实验结果如图1所示：mts结果显示，随着药物浓度的不断增加，细胞的活性率仍在80％以上，说明cordycepin对ibrs-2细胞毒性极低。

2.2cordycepin在ibrs-2细胞上抗口蹄疫病毒活性的评价：

将含10％fbs的dmem完全培养基上生长良好的ibrs-2细胞铺到96孔板，待ibrs-2细胞生长满单层后，弃掉细胞上层培养液，用新鲜的dmem洗3次，接种fmdvo/my98/by/2010(moi＝1)。1h后，去掉病毒液，用新鲜的dmem洗3次，加入用含2％fbs的dmem培养液梯度稀释好的cordycepin100μl，以cordycepin的配制溶液相应dmso浓度作为病毒对照孔，以无cordycepin、无病毒的作细胞对照孔。放入37℃持续培养24h，弃掉上层细胞培养液，用新鲜的dmem洗三次，再加入100μl新鲜的dmem，每孔加入20μlmts溶液。37℃孵育4h后在酶标仪上测490nm处的吸光度值，根据公式“细胞活性率＝(od药物-od空白)/(od阴性-od空白)×100％”计算出不同浓度cordycepin的抗病毒作用。同时收集不同组上清液，q-pcr和westernblot分别检测fmdv2b基因的mrna和fmdvvp1蛋白水平。按照trizol说明书提取细胞的rna，按照sybrpremixextaqⅱ操作说明书进行荧光定量pcr，β-actin作为内参基因。用于检测fmdv2b基因mrna特异的引物序列为：

fmdv-for,5’-caacaaaacacggacccgac-3’(seqidno.1)；

fmdv-rev,5’-ttgtaccagggtttggcctc-3’(seqidno.2)；

β-actin的引物序列为：

β-actinfor,5’-gaccaccttcaactcgatca-3’(seqidno.3)；

β-actin-rev,5’-gtgttggcgtagaggtcctt-3’(seqidno.4)。反应体系为：sybrpremixextaq:12.5μl，上游引物：1μl，下游引物：1μl，cdna：1μl，灭菌水：9.5μl，反应程序为：95℃预变性30s；95℃变性5s，56退火30s，72℃延伸30s，40个循环。根据2^-△△ct方法计算样品相对于内参基因的表达量。用蛋白裂解液提取蛋白，应用bca法测定提取的蛋白浓度。配制12％的分离胶进行蛋白sds-page变性电泳，电泳2h后，将蛋白电转印至pvdf膜上。转膜2h完毕后，把膜置入新鲜配制的5％脱脂奶粉进行封闭1h。封闭结束后，将膜置入兔抗o型fmdvvp1多克隆抗体(1:3000)，小鼠抗β-actin多克隆抗体(1:4000)中，4℃冰箱孵育过夜。用tbst洗膜5次，每次10min，之后把膜放入相应二抗hrp标记山羊抗兔igg,hrp标记山羊抗小鼠igg(1:3000)，室温孵育1h，tbst洗膜5次，每次10min，最后利用ecl化学发光法显影检测fmdvvp1蛋白。为了研究cordycepin对其他口蹄疫病毒亚型是否具有抑制作用，利用fmdva/gdmm/cha/2013(moi＝1)感染细胞，mts法测定其抗病毒活性。

实验结果如图2～5所示：用mts检测cordycepin对fmdv是否具有抗fmdv病毒活性，在分别加入不同浓度的药物情况下结果显示在浓度大于600μmol时，cordycepin可提供ibrs-2细胞60％以上的保护(图2)，并且抑制fmdvmrna表达水平(图4)以及vp1蛋白(图5)的表达。而当浓度低于800μmol，cordycepin则不能提供细胞有效的保护。同样，当用a型口蹄疫病毒感染细胞时，600μmol及以上浓度的cordycepin能有效的保护ibrs-2细胞(图3)，说明cordycepin对a型fmdv也有抗病毒活性。

2.3间接免疫荧光检测感染细胞组中fmdv蛋白的表达情况

将密度为3×10⁵/孔ibrs-2细胞铺到12孔板，待ibrs-2细胞生长满单层后，弃掉细胞上层培养液，用新鲜的dmem洗3次，接种fmdvo/my98/by/2010(moi＝1)。1h后，去掉病毒液，用新鲜的dmem洗3次，加入用含2％fbs的dmem培养液梯度稀释好的cordycepin100μl，以cordycepin的配制溶液相应dmso浓度作为病毒对照孔，放入37℃持续培养12h。弃掉上层细胞培养液，pbs清洗2次，4％多聚甲醛固定细胞15min，弃掉多聚甲醛，加入甲醇作用5min，用pbs漂洗3次，每次5min，加入封闭液(10％fbs，0.3％tritonx-100，89.7％pbs)封闭10min，之后加入用封闭液稀释好的一抗(1:100)，室温孵育1h，pbs漂洗3次，每次5min，加入用封闭液稀释好的二抗(1:200)，室温孵育1h，pbs漂洗5次，每次5min。最后每孔加入300μldapi进行染色，作用5min，pbs漂洗2次，每次5min，荧光显微镜观察结果。

实验结果如图6所示：未处理感染病毒后的ibrs-2细胞及用600μmol及以下浓度的cordycepin处理过的病毒感染组可见大量的特异性荧光，而其他处理组的ibrs-2细胞中则有少量的荧光。这一结果进一步的证实了cordycepin在ibrs-2细胞上的抗口蹄疫病毒活性呈现剂量依赖性。

2.4fmdv抑制病毒复制阶段的检测

将ibrs-2细胞铺至24孔板中，待细胞长满单层后，弃掉培养液。在病毒的吸附阶段：每孔加入fmdv病毒液(moi＝1)。然后向每孔中加入不同浓度的cordycepin，使其终浓度分别为800、1000μmol，设立不加入药物的阴性对照组，将细胞板放入4℃冰箱作用1h，只允许病毒附着于细胞表面。弃去病毒液，用dmem洗去未结合的病毒，每孔加入400μl培养液，放入-80℃冰箱反复冻融3次，收集病毒液，10000r/min离心10min去除细胞碎片，上清液用于检测mrna表达水平情况。在病毒穿入阶段：每孔加入200μl的fmdv病毒液，将细胞放入37℃温箱1h，允许病毒吸附细胞表面，用dmem洗去未结合的病毒，然后向每孔中加入不同浓度的cordycepin200μl，使cordycepin的终浓度分别为800、1000μmol，同时设立不加药物的阴性对照组，将细胞板放入37℃温箱培养1h，去掉药物，用dmem洗去残留的药物，加入含有2％fbs的维持液，放入37℃温箱继续培养24h，收集上清检测mrna表达水平情况。

实验结果如图7所示：在病毒的吸附(attachment)阶段，分别用不同浓度的cordycepin和fmdv病毒液处理细胞，在培养箱中共同作用1h，结果显示无论用不同浓度的cordycepin处理细胞，病毒的mrna表达水平与未处理组无明显差别，所以cordycepin不会对fmdv吸附细胞的过程产生影响。在病毒的穿入(entry)阶段，各药物处理组的mrna和未经药物处理的阴性对照组相比没有明显差别，说明cordycepin不会影响病毒进入细胞的能力。

2.5cordycepin对口蹄疫病毒感染ibrs-2细胞抑制时间的评价：

将在含10％fbs的dmem完全培养基上生长良好的ibrs-2细胞铺到12孔板，待ibrs-2细胞生长满单层后，弃掉细胞上层培养液，用新鲜的dmem洗3次，接种fmdvo/my98/by/2010(moi＝1)。1h后，去掉病毒液，用新鲜的dmem洗3次，加入用含2％fbs的dmem培养液，此时作为0h。在病毒感染后0h，2h，4h，8h，16h分别向不同孔中加入cordycepin，使其的终浓度为1000μmol。同时设立不加药物的阴性对照。37℃co2恒温细胞培养箱中培养24h。收集不同组上清液，q-pcr和westernblot分别检测fmdvmrna和vp1蛋白水平。

实验结果如图8～9所示：在病毒感染后不同时间段用cordycepin处理细胞，结果显示，在fmdv复制的0～8h内，与阴性对照相比，fmdvmrna水平(图8)和vp1蛋白水平(图9)明显抑制。而在16h时cordycepin的抑制作用并不明显，说明cordycepin只是在fmdv复制早期起作用，而进入病毒复制后期时则不能阻止病毒的复制。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>中国农业科学院兰州兽医研究所

<120>一种虫草素在制备预防口蹄疫病毒感染的药物中的应用

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

caacaaaacacggacccgac20

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

ttgtaccagggtttggcctc20

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

gaccaccttcaactcgatca20

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<211>20

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<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

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