一种骨修复膜及其制备方法与流程

本发明属于生物医用材料领域，具体涉及一种骨修复膜及其制备方法。

背景技术：

骨膜是由微血管化的结缔组织组成，覆盖在除关节外的皮质骨表面，其厚度与年龄和物种有关(例如，小鼠胫骨约为40μm，人胫骨约为100μm，猪下颌骨约为200μm)。传统上常将骨膜分为浅表的纤维层和深面的形成层,两层间并无截然分界。纤维层较厚，由成纤维细胞、血管网络和取向(沿着骨骼生长的方向)的胶原纤维组成，较薄的形成层直接附着在皮质骨的表面并含有多种骨类细胞。由于与血管结合，骨膜可被视为骨骼的“脐带”(维持皮质骨70-80％的血液供应)。因此，如果其发生破损，骨骼的营养供应就会被切断。

由于创伤、肿瘤和先天性疾病引起的临界尺寸的骨缺损的病例日趋增多，这必然会对骨膜产生损伤。有研究表明，从骨髓中去除骨祖细胞对骨生成的影响很小，而去除骨膜会导致新骨形成减少73％，新血管的生成减少10倍。因此，骨膜不仅在骨的发育中起重要作用，而且在治疗骨缺损中也是不可或缺的。然而，自体骨膜和异体骨膜在不同程度上仍存在来源有限、损伤供体部位及免疫排斥反应等问题，这为开发具有与天然骨膜相似结构和功能且可作为天然骨膜再生支架的人工骨修复膜提供了动力。

目前与本

技术实现要素：
相关但具有实质性差别的专利有：①公开号为cn106975106a的专利介绍一种双层骨修复膜材料及其制备方法。采用静电纺丝工艺，制备具有不同功能性的双层膜结构，包括添加抗菌药物的外层和添加促成骨物质的内层。该专利所述的双层骨修复膜能够促进骨缺损的修复和抑制骨缺损发生后易出现的细菌性感染及炎症。该专利所述的膜的孔径为2-6μm，能够有效的阻止软组织向骨缺损部位的侵入，但是因孔径较小，不足于骨类细胞及新血管的长入(一般需几十微米)，进而不利于天然骨膜的再生。②公开号为cn104474589a的专利介绍了一种引导组织再生膜及其制备方法与应用。采用静电纺丝工艺，制备了双层膜结构，包括降解时间较长的生物纤维制得的致密层及另一层为由降解时间不同的生物纤维混合制得的潜在疏松层，潜在疏松层植入体内后，部分生物纤维快速降解，使该膜的孔径增大，利于细胞的长入。但是由于单纯的静电纺膜力学性能不足，只能应用于非承重部位软组织的再生及一些小尺寸的骨缺损治疗中。另外，上述两个专利所述的修复膜均不具备再生具有独特结构的天然骨膜的能力，且均需要外加固定装置(如固定钉)进行固定，这对膜整体的性能有着很大的损伤。因此，进一步优化设计人工骨修复的结构具有重要意义。

发明内容

本发明所解决的技术问题是提供一种骨修复膜，该人工骨修复膜不仅可作为天然骨膜再生的支架，同时具备促进骨组织再生的诱导功能。

为了解决上述问题，本发明提供了一种骨修复膜，其特征在于，包括活性层、屏障层和固定层，所述屏障层位于活性层与固定层之间，所述的活性层和固定层为静电纺丝纤维膜，所述的屏障层为浇铸膜，所述的固定层中的静电纺丝纤维取向排列，所述的活性层中含有活性成分。

进一步地，所述的活性层具有骨诱导性能，所述的屏障层能够阻止软组织长入并增强膜整体力学性能，所述的固定层能够利用长入的软组织对膜整体起到固定作用，所述活性层与骨缺损部位接触，所述固定层与软组织接触。

优选地，所述的活性层、屏障层和固定层的复合方法包括：将固定层放在漏斗内，将浇铸液浇铸在固定层上，将活性层铺在浇铸液上，抽滤，直至浇铸液固化形成屏障层。

优选地，所述的活性层中的静电纺丝纤维的延伸方向随机，纤维直径为500～1500nm，孔隙率为75～95％，平均孔径为30～60μm，厚度为30～60μm。

优选地，所述的屏障层为浇铸膜，平均孔径为为0.5～10μm，孔隙率为50～80％，厚度为30～60μm。

优选地，所述的固定层中纤维的直径为500～1500nm，孔隙率为75～95％，平均孔径为20～40μm，厚度为40～80μm。

优选地，所述活性层和固定层可选自一种或多种的天然可降解材料，一种或多种合成可降解材料，或两种可降解材料的组合。

优选地，所述的天然可降解聚合物包括但不限于：胶原、壳聚糖、明胶、丝素蛋白、透明质酸；所述合成可降解聚合物包括但不限于：pla、plla、pga、plga、pgs、phb。

优选地，所述的活性成分包括但不限于：羟基磷灰石、磷酸三钙、生物活性玻璃、二氧化硅、微量金属氧化物(氧化镁、氧化锌等)。

优选地，所述屏障层的材质可选用一种或多种仅在50～100℃条件下能溶解于水的可降解聚合物。

更优选地，所述的仅在50～100℃条件下能溶解于水的可降解聚合物包括但不限于：聚乙烯醇(pva)、聚丙烯酰胺(pam)、明胶。

本发明还提供了上述骨修复膜的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：制备活性层：

将可降解聚合物溶于溶剂中，磁力搅拌1～12h，得到聚合物溶液，将活性成分加入聚合物溶液中，超声波分散3～6h，制得含活性成分的均质静电纺丝液，静电纺丝后，将得到的纳米纤维膜真空干燥，得到骨修复膜的活性层；

步骤2：制备固定层：

将可降解聚合物溶于溶剂中，磁力搅拌1～12h，得到聚合物溶液，静电纺丝后，将得到的纳米纤维膜真空干燥，得到骨修复膜的固定层；

步骤3：屏障层及活性层、屏障层与固定层的复合：

将仅在50～100℃条件下能溶于水的可降解聚合物在50～100℃条件下溶解于水中，磁力搅拌1～12h，得到聚合物溶液，将制孔剂加入聚合物溶液中，超声波分散3～6h，制得含制孔剂的均质浇铸液；将活性层和固定层裁剪成与布氏漏斗直径相同的圆形膜，将裁剪好的固定层放在布氏漏斗中滤纸的上面，将含制孔剂的均质浇铸液均匀的浇铸在固定层上，再将裁剪好的活性层铺在浇铸液上；用循环水式真空泵进行抽滤，直至屏障层固化，得到三层复合膜；将制得的三层复合膜浸泡在去离子水中，将制孔剂完全浸出，然后真空干燥，进行环氧乙烷处理，得到骨修复膜。

优选地，所述步骤1与步骤2中可降解聚合物为天然可降解聚合物、合成可降解聚合物或两种可降解聚合物的组合物。

更优选地，所述的天然可降解聚合物包括但不限于：胶原、壳聚糖、明胶、丝素蛋白、透明质酸；所述合成可降解聚合物包括但不限于：pla、plla、pga、plga、pgs、phb。

优选地，所述步骤1与步骤2中溶剂为无水乙醇、二氯甲烷、三氯甲烷、四氢呋喃、六氟异丙醇、甲醇、甲酸、乙酸、二甲基亚砜、n,n-二甲基甲酰胺、丙酮中一种或两种以上组合。

优选地，所述步骤1与步骤2中聚合物溶液中可降解聚合物质量分数为1～20％(w/v)。

优选地，所述步骤1中活性成分为羟基磷灰石、磷酸三钙、生物活性玻璃、二氧化硅、微量金属氧化物(氧化镁、氧化锌等)中的一种，粒径为10～500nm，且含量是可降解聚合物的5～30％(w/w)。

优选地，所述步骤1中静电纺丝工艺为：采用平板接收装置，在纺丝电压10～30kv，接收距离12～25cm，给进速度0.5～3ml/h，喷丝头直径0.2～0.8mm，温度20～40℃，相对湿度10～60％的条件下进行静电纺丝。

优选地，所述步骤1中真空干燥时间为6～24h，温度为40～60℃。

优选地，所述步骤1中纳米纤维膜的纤维直径为500～1500nm，孔隙率为75～95％，平均孔径为30～60μm，厚度为30～60μm。

优选地，所述步骤2中静电纺丝工艺为：采用滚筒接收装置，滚筒转速为400～1000rpm，在纺丝电压10～30kv，接收距离12～25cm，给进速度0.5～3ml/h，喷丝头直径0.2～0.8mm，温度20～40℃，相对湿度10～60％的条件下进行静电纺丝。

优选地，所述步骤2中真空干燥时间为6～24h，温度为40～60℃。

优选地，所述步骤2中纳米纤维膜的直径为500～1500nm，孔隙率为75～95％，平均孔径为20～40μm，厚度为40～80μm。

优选地，所述步骤3中仅在50～100℃条件下能溶解于水的可降解聚合物为聚乙烯醇(pva)、聚丙烯酰胺(pam)、明胶中的一种或两种组合物。

优选地，所述步骤3中聚合物溶液中仅在50～100℃条件下能溶于水的可降解聚合物的质量分数为5～20％(w/v)。

优选地，所述步骤3中制孔剂为氯化钠或氯化锂，粒径为0.5～10μm，且含量与可降解聚合物的质量比为5:1～10:1。

优选地，所述步骤3中循环水式真空泵的真空度为0.01～0.03mpa。

优选地，所述步骤3中屏障层为浇铸膜，平均孔径为0.5～10μm，孔隙率为50～80％，厚度为30～60μm。

优选地，所述步骤3中真空干燥时间为6～24h，温度为40～60℃，环氧乙烷灭菌处理时间12h或24h。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

(1)本发明所制备的双重功能的人工骨修复膜具有同时再生天然骨组织及骨膜组织的优异性能。植入后，与骨缺损部位接触的活性层能够募集骨类细胞，在加速骨修复的同时再生天然骨膜的形成层；与软组织接触的固定层允许成纤维细胞长入，在利用渗入到层内部的软组织达到固定膜整体作用的同时再生天然骨膜的纤维层；位于中间的屏障层，孔径较小，在维持营养物质传输的同时阻止软组织的渗入，并对整个骨修复膜的力学性能起到增强作用。

(2)本发明采用溶液浇铸和真空抽滤的方式将活性层及固定层进行复合的同时形成屏障层，一体化成型，提高各层间的结合牢度的同时增强膜整体的力学性能。

(3)本发明所制备的双重功能人工骨修复膜的活性层具有募集骨类细胞，加速骨组织再生的同时形成天然骨膜的形成层。

(4)本发明所制备的双重功能人工骨修复膜的固定层具有固定膜整体的特殊功能，避免外加固定装置，简化手术过程。同时，固定层取向的微观结构，有利于软组织的取向生长，具有再生天然骨膜取向纤维层的功能。

(5)本发明的人工骨修复膜具有三层膜结构，所述的三层膜结构由静电纺丝技术结合溶液浇铸技术在真空抽滤的辅助下复合而成。植入后，与骨缺损部位接触的活性层能够募集骨类细胞，在加速骨修复的同时再生天然骨膜的形成层；与软组织接触的固定层允许成纤维细胞长入，在利用渗入到层内部的软组织达到固定膜整体作用的同时再生天然骨膜的纤维层；位于中间的屏障层，孔径较小，在维持营养物质传输的同时阻止软组织的渗入，并对整个骨修复膜的力学性能起到增强作用。

附图说明

图1为骨修复膜结构示意图。

图2为实施例1的骨修复膜中活性层的sem照片。

图3为实施例1的修复膜中中屏障层的sem照片。

图4为实施例1的骨修复膜中固定层的sem照片。

图5为实施例1的骨修复膜截面的sem照片。

附图标记说明：1为活性层，2为屏障层，3为固定层。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

本发明各实施例中采用autosoeb-iq型bet(氮吸附)来测试活性层、屏障层与固定层的孔径分布及孔隙率。

本发明各实施例采用的试剂及细胞如下：plga(sigma-aldrich739960)；壳聚糖(国药集团化学试剂有限公司69047436)；pva(国药集团化学试剂有限公司30153160)；pla(上海阿拉丁生化科技股份有限公司p169115)；phb(sigma-aldrich363502)；pam(sigma-aldrich767379)；plla(sigma-aldrich764698)；明胶(国药集团化学试剂有限公司10010326)；pgs(制备方法参考文献radmm,khorasanisn,mobarakehlg,etal.fabricationandcharacterizationoftwo-layerednanofibrousmembraneforguidedboneandtissueregenerationapplication[j].materialsscienceandengineering:c,2017:s0928493117303053)；大鼠骨髓间充质干细胞(中国科学院干细胞库scsp-402)；l929成纤维细胞(中国科学院干细胞库gnm28)；mtt试剂盒(碧云天生物技术研究所c0009)。

实施例1

如图1所示，本实施例提供了一种骨修复膜，具有三层膜结构，包括具有骨诱导性能的活性层1、阻止软组织长入并增强膜整体力学性能的屏障层2及利用长入的软组织对膜整体起到固定作用的固定层3；所述活性层1与骨缺损部位接触，所述固定层3与软组织接触，所述屏障层2位于活性层1与固定层3之间。所述的活性层1和固定层3为静电纺丝纤维膜，所述的屏障层2为浇铸膜，所述的固定层3中的静电纺丝纤维取向排列，所述的活性层1中含有活性成分。

植入后，与骨缺损部位接触的活性层1能够募集骨类细胞，在加速骨修复的同时再生天然骨膜的形成层；与软组织接触的固定层3允许成纤维细胞长入，在利用渗入到层内部的软组织达到固定膜整体作用的同时再生天然骨膜的纤维层；位于中间的屏障层2，孔径较小，在维持营养物质传输的同时阻止软组织的渗入，并对整个骨修复膜的力学性能起到增强作用。

所述骨修复膜的制备步骤具体如下：

步骤1：制备活性层1：

步骤a)将0.6g的plga(la/ga＝50/50，分子量为6.5万)溶解在8ml三氯甲烷和甲醇组成的二元溶剂体系中，溶剂体系比为：v三氯甲烷:v甲醇＝3:1，磁力搅拌12h，得到质量分数为7.5％(w/v)澄清透明的聚合物溶液；将0.06g的磷酸三钙(粒径为50～100nm)加入聚合物溶液中，超声波分散6h，制得含磷酸三钙的均质静电纺丝液；

步骤b)采用平板接收装置，在纺丝电压18kv，接收距离16cm，给进速度1ml/h，喷丝头直径0.67mm，温度25℃，相对湿度30％的条件下进行静电纺丝，得到纤维直径为600～900nm、孔隙率为87.3％、平均孔径为34.3μm及厚度为47.2μm的纳米纤维膜；将得到的纳米纤维膜置于真空干燥箱中40℃干燥12h，得到骨修复膜的活性层1，所述的活性层中的纤维的延伸方向随机；

步骤2：制备固定层3：

步骤a)将1.2g壳聚糖(高分子量，脱乙酰度为90％)溶解在8ml浓度为98％的乙酸溶液中，磁力搅拌4h，得到质量分数为15％(w/v)澄清透明的聚合物溶液；

步骤b)采用滚筒接收装置，滚筒转速为500rpm，在纺丝电压12kv，接收距离15cm，给进速度0.8ml/h，喷丝头直径0.33mm，温度25℃，相对湿度30％的条件下进行静电纺丝，得到纤维直径为500～800nm、孔隙率为78.6％、平均孔径为24.2μm及厚度为62.4μm的纳米纤维膜；将得到的纳米纤维膜置于真空干燥箱中40℃干燥12h，得到骨修复膜的固定层3，所述的固定层中的纤维取向排列；

步骤3：屏障层2的制备及活性层1、屏障层2与固定层3的复合：

步骤a)将0.015g的pva(分子量12.5万)在100℃下溶解于0.15ml水中，磁力搅拌10h，得到质量分数为10％(w/v)的聚合物溶液，将0.15g氯化钠(粒径为0.5～1.3μm)加入聚合物溶液中，超声波分散3h，制得含氯化钠的均质浇铸液；

步骤b)将活性层1和固定层3裁剪成与布氏漏斗内直径(d＝60mm)相同的圆形膜；将裁剪好固定层3放在布氏漏斗中滤纸的上面，将步骤a)制备好的浇铸液均匀的浇铸在固定层3上，再将裁剪好的活性层1铺在浇铸液上；用循环水式真空泵(真空度为0.01mpa)进行抽滤，直至屏障层固化，得到三层复合膜，屏障层平均孔径为0.9μm，孔隙率为77.4％，厚度为46.8μm；

步骤c)将制得的三层复合膜浸泡在去离子水中，每隔6h进行一次换水，直到制孔剂完全浸出，沥滤后的水在滴入agno3后没有白色沉淀产生；

步骤d)制备完成后，将三层复合膜置于真空干燥箱中40℃干燥24h，然后进行环氧乙烷灭菌处理24h，最终得到骨修复膜。

最后，制备得到的骨修复膜的厚度为156.4μm，使用yg(b)026h型-电子织物强力机进行拉伸实验，取试样1％应变下的应力值为其拉伸初始模量，测得其拉伸初始模量为24.86mpa。分别在制得骨修复膜的活性层1和固定层3种植成骨细胞和成纤维细胞，成骨细胞为spraguedawley(sd)大鼠骨髓间充质干细胞，成纤维细胞为l929成纤维细胞。种植方法：首先将骨修复膜裁剪成直径为14mm的圆形，然后放置于24孔板孔底部，每个孔只能种植一种细胞(活性层1面朝上，则种植大鼠骨髓间充质干细胞；固定层3面朝上，则种植l929成纤维细胞)。种植后培养条件：37℃，5％二氧化碳培养箱中，种植密度为1万个/孔。采用mtt法测定细胞活性，72h后成骨细胞的细胞活性为109％。对成纤维细胞培养了72小时后的骨修复膜进行dapi染色，然后再对骨修复膜进行切割，采用电镜拍摄骨修复膜的截面，测量成纤维细胞向内迁移的距离，成纤维细胞向内渗透迁移平均为17.5μm。

实施例2

如图1所示，本实施例提供了一种骨修复膜，具有三层膜结构，包括具有骨诱导性能的活性层1、阻止软组织长入并增强膜整体力学性能的屏障层2及利用长入的软组织对膜整体起到固定作用的固定层3；所述活性层1与骨缺损部位接触，所述固定层3与软组织接触，所述屏障层2位于活性层1与固定层3之间。所述的活性层1和固定层3为静电纺丝纤维膜，所述的屏障层2为浇铸膜，所述的固定层3中的静电纺丝纤维取向排列，所述的活性层1中含有活性成分。

植入后，与骨缺损部位接触的活性层1能够募集骨类细胞，在加速骨修复的同时再生天然骨膜的形成层；与软组织接触的固定层3允许成纤维细胞长入，在利用渗入到层内部的软组织达到固定膜整体作用的同时再生天然骨膜的纤维层；位于中间的屏障层2，孔径较小，在维持营养物质传输的同时阻止软组织的渗入，并对整个骨修复膜的力学性能起到增强作用。

所述骨修复膜的制备步骤具体如下：

步骤1：制备活性层1：

步骤a)将0.5g的pla(分子量5.2万)和0.5g的phb(分子量37万)溶解在8ml二氯甲烷和n,n-二甲基甲酰胺组成的二元溶剂体系中，溶剂体系比为：v二氯甲烷:vn,n-二甲基甲酰胺＝8:2，磁力搅拌24h，得到质量分数为12.5％(w/v)澄清透明的聚合物溶液；将0.15g的羟基磷灰石(粒径为100～300nm)加入聚合物溶液中，超声波分散6h，制得含羟基磷灰石的均质静电纺丝液；

步骤b)采用平板接收装置，在纺丝电压15kv，接收距离20cm，给进速度1ml/h，喷丝头直径0.4mm，温度25℃，相对湿度55％的条件下进行静电纺丝，得到纤维直径为600～800nm、孔隙率为84.6％、平均孔径为47.6μm及厚度为54.4μm的纳米纤维膜；将得到的纳米纤维膜置于真空干燥箱中40℃干燥12h，得到骨修复膜的活性层1，所述的活性层中的纤维的延伸方向随机；

步骤2：制备固定层3：

步骤a)将1.0g的pgs(分子量1.2万)和0.2g的壳聚糖(高分子量，脱乙酰度为90％)溶解在8ml浓度为98％的乙酸溶液中，磁力搅拌4h，得到质量分数为15％(w/v)澄清透明的聚合物溶液；

步骤b)采用滚筒接收装置，滚筒转速为800rpm，在纺丝电压10kv，接收距离12cm，给进速度1ml/h，喷丝头直径0.6mm，温度25℃，相对湿度30％的条件下进行静电纺丝，得到纤维直径为500～900nm、孔隙率为82.7％、平均孔径为29.3μm及厚度为58.1μm的纳米纤维膜；将得到的纳米纤维膜置于真空干燥箱中40℃干燥12h，得到骨修复膜的固定层3，所述的固定层中的纤维取向排列；

步骤3：屏障层2的制备及活性层1、屏障层2与固定层3的复合：

步骤a)将0.015g的pam(分子量15万)在60℃下溶解于0.1ml水中，磁力搅拌8h，得到质量分数为15％(w/v)的聚合物溶液，将0.12g氯化锂(粒径为1.0～4.0μm)加入聚合物溶液中，超声波分散3h，制得含氯化锂的均质浇铸液；

步骤b)将活性层1和固定层3裁剪成与布氏漏斗内直径(d＝60mm)相同的圆形膜；将裁剪好固定层3放在布氏漏斗中滤纸的上面，将步骤a)制备好的浇铸液均匀的浇铸在固定层3上，再将裁剪好的活性层1铺在浇铸液上；用循环水式真空泵(真空度为0.02mpa)进行抽滤，直至屏障层固化，得到三层复合膜，屏障层平均孔径为3.5μm，孔隙率为65.8％，厚度为48.8μm；

步骤c)将制得的三层复合膜浸泡在去离子水中，每隔6h进行一次换水，直到制孔剂完全浸出，沥滤后的水在滴入agno3后没有白色沉淀产生；

步骤d)制备完成后，将三层复合膜置于真空干燥箱中40℃干燥24h，然后进行环氧乙烷灭菌处理24h，最终得到骨修复膜。

最后，制备得到的骨修复膜的厚度为161.3μm，使用yg(b)026h型-电子织物强力机进行拉伸实验，取试样1％应变下的应力值为其拉伸初始模量，测得其拉伸初始模量为19.24mpa，分别在制得骨修复膜的活性层1和固定层3种植成骨细胞和成纤维细胞，成骨细胞为spraguedawley(sd)大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化而来，成纤维细胞为l929细胞。首先将骨修复膜裁剪成直径为14mm的圆形，然后放置于24孔板孔底部，每个孔只能种植一种细胞(活性层1面朝上，则种植大鼠骨髓间充质干细胞；固定层3面朝上，则种植l929成纤维细胞)。种植后培养条件：37℃，5％二氧化碳培养箱中，种植密度为1万个/孔。采用mtt法测定细胞活性，72h后成骨细胞的细胞活性为123％。对成纤维细胞培养了72小时后的骨修复膜进行dapi染色，然后再对骨修复膜进行切割，采用电镜拍摄骨修复膜的截面，测量成纤维细胞向内迁移的距离，成纤维细胞向内渗透迁移平均为25.4μm。

实施例3

如图1所示，本实施例提供了一种骨修复膜，具有三层膜结构，包括具有骨诱导性能的活性层1、阻止软组织长入并增强膜整体力学性能的屏障层2及利用长入的软组织对膜整体起到固定作用的固定层3；所述活性层1与骨缺损部位接触，所述固定层3与软组织接触，所述屏障层2位于活性层1与固定层3之间。所述的活性层1和固定层3为静电纺丝纤维膜，所述的屏障层2为浇铸膜，所述的固定层3中的静电纺丝纤维取向排列，所述的活性层1中含有活性成分。

植入后，与骨缺损部位接触的活性层1能够募集骨类细胞，在加速骨修复的同时再生天然骨膜的形成层；与软组织接触的固定层3允许成纤维细胞长入，在利用渗入到层内部的软组织达到固定膜整体作用的同时再生天然骨膜的纤维层；位于中间的屏障层2，孔径较小，在维持营养物质传输的同时阻止软组织的渗入，并对整个骨修复膜的力学性能起到增强作用。

所述骨修复膜的制备步骤具体如下：

步骤1：制备活性层1：

步骤a)将0.64g的plla(分子量2万)和0.16g的壳聚糖(高分子量，脱乙酰度为90％)溶解在8ml二氯甲烷溶液中，磁力搅拌12h，得到质量分数为10％(w/v)澄清透明的聚合物溶液；将0.16g的氧化镁(粒径为80～200nm)加入聚合物溶液中，超声波分散6h，制得含氧化镁的均质静电纺丝液；

步骤b)采用平板接收装置，在纺丝电压15kv，接收距离15cm，给进速度2ml/h，喷丝头直径0.5mm，温度25℃，相对湿度40％的条件下进行静电纺丝，得到纤维直径为800～1200nm、孔隙率为90.3％、平均孔径为53.4μm及厚度为58.7μm的微纳米纤维膜；将得到的纳米纤维膜置于真空干燥箱中50℃干燥12h，将得到的纳米纤维膜置于真空干燥箱中50℃干燥12h，得到骨修复膜的活性层1所述的活性层中的纤维的延伸方向随机；

步骤2：制备固定层3：

步骤a)将0.96g的phb(分子量37万)溶解在8ml浓度为98％的乙酸溶液中，磁力搅拌8h，得到质量分数为12％(w/v)澄清透明的聚合物溶液；

步骤b)采用滚筒接收装置，滚筒转速为1000rpm，在纺丝电压12kv，接收距离17cm，给进速度0.8ml/h，喷丝头直径0.4mm，温度25℃，相对湿度30％的条件下进行静电纺丝，得到纤维直径为600～800nm、孔隙率为80.4％、平均孔径为31.3μm及厚度为69.4μm的纳米纤维膜；将得到的纳米纤维膜置于真空干燥箱中50℃干燥12h，得到骨修复膜的固定层3，所述的固定层中的纤维取向排列；

步骤3：制备屏障层2的制备及活性层1、屏障层2与固定层3的复合：

步骤a)将0.01g的明胶(粘度≥15mm²/s)与0.01g的pam(分子量15万)在80℃下溶解于0.1ml水中，磁力搅拌6h，得到质量分数为20％(w/v)的聚合物溶液，将0.12g氯化钠(粒径为2.0～8.0μm)加入聚合物溶液中，超声波分散3h，制得含氯化钠的均质浇铸液；

步骤b)将活性层1和固定层3裁剪成与布氏漏斗内直径(d＝60mm)相同的圆形膜；将裁剪好固定层3放在布氏漏斗中滤纸的上面，将步骤a)制备好的浇铸液均匀的浇铸在固定层3上，再将裁剪好的活性层1铺在浇铸液上；用循环水式真空泵(真空度为0.02mpa)进行抽滤，直至屏障层固化，得到三层复合膜，屏障层平均孔径为6.9μm，孔隙率为72.9％，厚度为50.0μm；

步骤c)将制得的三层复合膜浸泡在去离子水中，每隔6h进行一次换水，直到制孔剂完全浸出，沥滤后的水在滴入agno3后没有白色沉淀产生；

步骤d)制备完成后，将三层复合膜置于真空干燥箱中50℃干燥24h，然后进行环氧乙烷灭菌处理24h，最终得到骨修复膜。

最后，制备得到的骨修复膜的厚度为178.1μm，使用yg(b)026h型-电子织物强力机进行拉伸实验，取试样1％应变下的应力值为其拉伸初始模量，测得其拉伸初始模量为14.73mpa。分别在制得骨修复膜的活性层1和固定层3种植成骨细胞和成纤维细胞，成骨细胞为spraguedawley(sd)大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化而来，成纤维细胞为l929细胞。种植方法：首先将骨修复膜裁剪成直径为14mm的圆形，然后放置于24孔板孔底部，每个孔只能种植一种细胞(活性层1面朝上，则种植大鼠骨髓间充质干细胞；固定层3面朝上，则种植l929成纤维细胞)。种植后培养条件：37℃，5％二氧化碳培养箱中，种植密度为1万个/孔。采用mtt法测定细胞活性，72h后成骨细胞的细胞活性为134％。对成纤维细胞培养了72小时后的骨修复膜进行dapi染色，然后再对骨修复膜进行切割，采用电镜拍摄骨修复膜的截面，测量成纤维细胞向内迁移的距离，成纤维细胞向内渗透迁移平均为19.8μm。