特纳卡树皮萃取物用于预防皮肤老化的用途的制作方法

本发明是关于一种植物萃取物的用途，特别是关于一种特纳卡树皮萃取物用于制备预防皮肤老化的组合物的用途。

背景技术：

皮肤提供个体对抗阳光中紫外线(ultraviolet，uv)辐射、病原体、摩擦力等环境因子的第一阶段保护。皮肤由外向内依序包含表皮层、主要由结缔组织构成的真皮层、及皮下组织。表皮层包含最外侧的角质层并且不断更新。表皮层与真皮层间存在持续分裂的细胞，例如皮肤纤维母细胞(skinfibroblasts)、角质细胞(keratinocytes)、及黑色素细胞(melanocytes)。真皮层含有胶原蛋白(collagen)、弹力蛋白(elastin)、及玻尿酸(hyaluronicacid)等分子，其赋予肌肤弹性和支撑力量。随着年龄增长，皮肤会出现皱纹、细纹、松弛、凹陷、毛孔粗大、黑色素沉淀等老化现象。这些皮肤老化现象的形成与诸多因素有关，例如真皮层内的胶原蛋白、弹力蛋白、及玻尿酸等分子的含量随年龄增加而减少，暴露于高量的紫外线(主要是紫外线a)会导致皮肤细胞死亡或核酸分子损伤。

市面上用以改善前述皮肤老化现象的方法包含直接注射胶原蛋白或玻尿酸至真皮层，以口服方式补充胶原蛋白或玻尿酸，及使用防晒品以减少紫外线所致皮肤伤害等。然而，注射至皮肤的胶原蛋白或玻尿酸易随时间被体内酵素分解，导致必须定期施打该些物质，花费甚巨。以口服方式补充胶原蛋白或玻尿酸会造成该些大分子在肠胃道中被消化为小分子的胺基酸或单醣，尽管身体能利用这些胺基酸或单醣合成蛋白质或多醣，但不必然形成胶原蛋白或玻尿酸，因此补充胶原蛋白或玻尿酸的实质效果有限。此外，防晒品含有的化学物质可能引发光敏性，以致该些化学物质与紫外线的结合对皮肤产生不良影响，例如皮疹或更严重的晒伤。

有鉴于此，开发一种成分天然、可直接施用于皮肤、又能有效减缓皮肤老化的组合物，以维持皮肤健康及降低皮肤病变的发生，实有其必要。

技术实现要素：

缘此，本发明的一目的在提供一种特纳卡(tanaka)树皮萃取物用于制备预防皮肤老化的组合物的用途，其中该特纳卡树皮萃取物是以一溶剂萃取一特纳卡树皮而获得。

在本发明的一实施例中，该溶剂为水、醇、或醇水混合物，该溶剂与该特纳卡树皮的重量比为20：1至1：1，且该萃取步骤是在50℃至80℃进行。

在本发明的一实施例中，该特纳卡树皮萃取物是一特纳卡树皮的水萃取物，其浓度为至少0.5mg/ml。

在本发明的一实施例中，该特纳卡树皮萃取物提升一皮肤细胞对紫外线的抵抗力，减少一皮肤细胞中的一核酸分子的损伤，或改善皮肤纹理与减少斑点。

在本发明的一实施例中，本发明组合物的形式为粉末状、颗粒状、液状、胶状或膏状的剂型。

鉴于特纳卡树皮萃取物有效抑制促成皮肤老化的环境因子的作用，如紫外线诱导皮肤纤维母细胞死亡、核酸分子因氧化压力而损伤，特纳卡树皮萃取成物可用于制备预防皮肤老化的组合物。

以下将配合图式进一步说明本发明的实施方式，下述所列举的实施例是用以阐明本发明的发明特点及应用，而非以限定本发明的范围，任何熟习此技艺者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可做些许更动与润饰，因此本发明的保护范围当视后附的申请专利范围所界定者为准。

附图说明

图1显示特纳卡树皮萃取物提升皮肤纤维母细胞对紫外线a(uva)照射的抵抗力；

图2显示特纳卡树皮萃取物减少过氧化氢(h2o2)所致皮肤纤维母细胞内活性氧物质的累积；

图3显示特纳卡树皮萃取物减少过氧化氢(h2o2)所致皮肤纤维母细胞内核酸分子的损伤；

图4显示连续四周施用含1％特纳卡树皮萃取物的精华液或安慰剂于受试者脸部皮肤后，其皮肤纹理的改善率；

图5显示连续四周施用含1％特纳卡树皮萃取物的精华液或安慰剂于受试者脸部皮肤后，其皮肤上棕色斑点相对量的变化。

具体实施方式

定义

本文中所使用数值为近似值，所有实验数据皆表示在20％的范围内，较佳为在10％的范围内，最佳为在5％的范围内。

本发明提供一种特纳卡树皮萃取物用于制备预防皮肤老化的组合物的用途。以下实施例中揭露特纳卡树皮萃取物或包含该萃取物的组合物能减少紫外线照射所致皮肤纤维母细胞的死亡，减少皮肤细胞中核酸分子的损伤，及改善皮肤纹理与减少斑点。

材料与方法

材料

自thermofisherscientific公司购买含earle’s平衡盐溶液的eagle’s最低基本培养基(eagle’sminimumessentialmedium，简称mem培养基)，胎牛血清(fetalbovineserum，fbs)，非必需胺基酸，碳酸氢钠，丙酮酸钠，及磷酸缓冲盐溶液(phosphatebufferedsaline，pbs)。自amersco公司购买用于细胞存活分析的3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基四氮唑溴化物(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide，mtt)。自echochemical公司购买二甲基亚砜(dimethylsulfoxide，dmso)。自sigma公司购买过氧化氢及二氯二氢荧光素二乙酸酯(2,7-dichloro-dihydro-fluoresceindiacetate，dcfh-da)。该dcfh-da使用前是溶于dmso以配制为5mg/mldcfh-da溶液。

细胞培养

以下实施例使用购自食品工业研究所生物资源保存及研究中心(bioresourcecollectionandresearchcenter，bcrc)的人类皮肤纤维母细胞ccd-966sk(bcrc60153)进行体外实验。人类皮肤纤维母细胞在37℃、5％二氧化碳的条件下培养于添加10％fbs、0.1mm非必需胺基酸、1.5g/l碳酸氢钠、1mm丙酮酸钠的mem培养基，以下称细胞培养基。

mtt分析

细胞存活率是以mtt分析测定。简言之，将mtt溶液(4mg/mlmtt溶于pbs溶液)依15μl/孔添加至96孔盘中的细胞，于37℃反应4小时。移除反应液后，将dmso依50μl/孔添加至细胞并震荡反应10分钟以溶解所生成的甲(formazan)结晶。最终，使用elisa读盘机(enzyme-linkedimmunosorbentassayreader；biotek)测量该细胞混合物在570nm的吸光值(o.d.570)。

统计分析

各实验资料的统计上显著差异是以excel软件的学生t(student'sttest)检定判定。

实施例1

特纳卡树皮萃取物的制备

本实施例举例说明特纳卡树皮萃取物的制备方法。首先，将特纳卡树皮(tanaka，又名limoniaacidissima)洗净及干燥，以切割、研磨或其它类似方式使该树皮粗碎成片状、粒状、或粉状。其次，以水物为溶剂对该片状、粒状、或粉状的特纳卡树皮进行萃取，该溶剂与该特纳卡树皮的重量比为20：1至1：1，萃取温度为介于50℃至80℃，较佳为60℃至70℃。萃取时间约为0.5至3小时。经该萃取步骤所得特纳卡树皮萃取物冷却至室温后，经由400目(mesh)的滤网过滤以移除残余固体物。该过滤后的特纳卡树皮萃取物可进一步在45℃至70℃进行减压浓缩而获得一浓缩产物。为获得固态的特纳卡树皮萃取物，可将前述经减压浓缩的特纳卡树皮萃取物以喷雾干燥方式去除溶剂，因此获得特纳卡树皮萃取物粉末。

实施例2

特纳卡树皮萃取物抑制紫外线照射所致皮肤纤维母细胞死亡

为检验特纳卡树皮萃取物保护皮肤对抗紫外线照射的效果，利用细胞存活分析(mtt分析)评估经过紫外线a照射的人类皮肤纤维母细胞ccd-966sk在特纳卡树皮萃取物处理后的细胞存活率。简言之，将5×10³个ccd-966sk细胞接种于含有200μl细胞培养基的96孔盘的各孔，在37℃下培养24小时后，移除细胞培养基，并添加含有1mg/ml特纳卡树皮水萃取物的细胞培养基至细胞以作为实验组，其于37℃下再培养24小时。其后，将该细胞置于紫外线照射箱(vilber)中以接受12j/cm²紫外线a(波长315–400nm)照射1小时，此辐射剂量会造成半数细胞死亡。为供比较，另设置一组经前述剂量紫外线a照射但以不含特纳卡树皮水萃取物的细胞培养基处理的细胞以作为负控制组，及设置一组未予紫外线a照射且仅以不含特纳卡树皮水萃取物的细胞培养基处理的细胞以作为空白对照组。最终，进行mtt分析及依下列公式计算各组细胞(四重复实验)的细胞存活率：

细胞存活率＝各组的o.d.570/空白对照组的o.d.570×100％

图1显示ccd-966sk细胞在前述不同处理后的细胞存活率；图中*及***分别表示相对于负控制组的p＜0.05及p＜0.001。依据图1，负控制组相比空白对照组有显著降低的细胞存活率，显示紫外线a照射会造成皮肤纤维母细胞大量死亡。然而，相比负控制组，特纳卡树皮水萃取物的处理却使实验组细胞的存活率明显上升16.7％，说明特纳卡树皮萃取物能提升皮肤细胞对紫外线的抵抗力。

实施例3

特纳卡树皮萃取物减少皮肤纤维母细胞中的活性氧物质的累积

为探讨特纳卡树皮萃取物对皮肤细胞中氧化压力的调节作用，利用荧光探针dcfh-da配合流式细胞仪(flowcytometry；beckman)，测定人类皮肤纤维母细胞ccd-966sk经特纳卡树皮萃取物处理后，其在氧化刺激下的活性氧物质(reactiveoxygenspecies，ros)含量变化。简言之，将2×10⁵个ccd-966sk细胞接种于含有2ml细胞培养基的6孔培养盘的各孔，在37℃下培养24小时后，移除该培养基。其后，该细胞在37℃下依序以2ml含有0.5或1mg/ml特纳卡树皮水萃取物的细胞培养基处理1小时，以5μg/mldcfh-da溶液处理细胞15分钟，再以1mm过氧化氢处理1小时。使用pbs溶液清洗该细胞二次后，于暗处以200μl胰蛋白酶处理细胞5分钟，再收集细胞与培养基以离心方式(400xg，10分钟)移除上清液。由此所得细胞沉淀物以pbs溶液清洗一次及再次悬浮，并使用流式细胞仪侦测细胞的荧光强度。进行荧光侦测的激发波长为450-490nm，放射波长为510-550nm。由于dcfh-da进入细胞后会先被水解为dcfh(二氯二氢荧光素)，再被活性氧物质氧化为可发出绿色荧光的dcf(二氯荧光素)，经dcfh-da处理的细胞的荧光强度可反映细胞内活性氧物质含量。为供比较，另设置一组先后经过氧化氢及不含特纳卡树皮水萃取物的细胞培养基处理的细胞以作为负控制组，及设置一组未予过氧化氢而仅以不含特纳卡树皮水萃取物的细胞培养基处理的细胞以作为空白对照组。

图2显示ccd-966sk细胞在前述不同处理后的活性氧物质相对含量(％)，以负控制组细胞的活性氧物质含量界定为100％；图中***表示相对于负控制组的p＜0.001。依据图2，负控制组相比空白对照组呈现明显较高的活性氧物质含量，显示过氧化氢处理会导致细胞内活性氧物质的累积。然而，相比负控制组，0.5或1mg/ml特纳卡树皮水萃取物的处理使细胞内活性氧物质降低约60％，显示特纳卡树皮水萃取物具有清除活性氧物质的能力。

实施例4

特纳卡树皮萃取物减少细胞内核酸分子的损伤

为检验特纳卡树皮萃取物对皮肤细胞内核酸分子的保护作用，依类似实施例3所述方法处理人类皮肤纤维母细胞ccd-966sk，并利用单细胞胶体电泳(singlecellgelelectrophoresis，scge)分析细胞经过不同处理后的染色体核酸分子的受损情况。简言之，设置三组ccd-966sk细胞，第一组细胞先以1mm过氧化氢处理1小时，再以含有0.5或1mg/ml特纳卡树皮水萃取物的细胞培养基处理1小时；第二组细胞先后给予氧化氢及不含特纳卡树皮水萃取物的细胞培养基(负控制组)；第三组细胞未予过氧化氢而仅以不含特纳卡树皮水萃取物的细胞培养基处理(空白对照组)。其后，收集该三组细胞以进行单细胞胶体电泳，并测量染色胶体中的核酸分子拖尾长度。由于断裂的核酸分子会在细胞电泳后呈现拖尾现象，该拖尾的长度可用于定量核酸分子的损伤程度。

图3显示上述各组ccd-966sk细胞于电泳后的核酸拖尾相对长度(％)，以空白对照组的核酸分子拖尾长度界定为100％；图中***表示相对于空白对照组的p＜0.001，^###表示相对于负控制组的p＜0.001。依据图3，负控制组相比空白对照组有明显较长的核酸拖尾，显示过氧化氢处理会严重损伤细胞的核酸分子。然而，相比负控制组，0.5或1mg/ml特纳卡树皮水萃取物的处理使该核酸拖尾缩短约62.5％，说明特纳卡树皮萃取物能减少皮肤细胞中核酸分子的损伤。

实施例5

特纳卡树皮萃取物改善皮肤纹理及减少斑点

特纳卡树皮萃取物可制备供局部施用于皮肤的组合物，其可具有但不限于溶液、乳液、乳霜或凝胶的型态。在一实施例中，该组合物为含有1％w/w特纳卡树皮水萃取物的精华液(含一基底溶剂，其成分包括水、馨鲜酮、己二醇、1,3-丁二醇、三仙胶、增稠剂、及三乙醇胺)。为评估此组合物对皮肤状态的影响，将该精华液与作为安慰剂的该基底溶剂于每日早晚各一次分别涂抹于9位25至40岁的包含男性及女性受试者已清洁过的左、右半脸，并于使用前及连续使用四周后以全脸肤质检测仪(7thgenerationvisiacomplexionanalysissystem；canfield,usa)测定该些受试者的全脸皮肤纹理及棕色斑点数量。

图4显示前述受试者的皮肤纹理改善率(％)的平均值；界定施用前受试者的皮肤粗糙度为100％，以同一受试者于施用前后的皮肤粗糙度降低量作为皮肤纹理的改善率。依据图4，相比安慰剂对皮肤纹理的改善约为10.5％，连续四周施用含特纳卡树皮水萃取物的精华液显著改善皮肤纹理达17.4％。

图5显示前述受试者的棕色斑点相对量(％)的平均值，以施用前受试者皮肤的棕色斑点数量为100％。依据图5，使用安慰剂无法减少皮肤的棕色斑点，但连续四周施用含特纳卡树皮水萃取物的精华液使棕色斑点减少7.7％。此结果证实特纳卡树皮萃取物减缓皮肤老化的效果。

综上所述，特纳卡树皮萃取物或含有该萃取物的组合物能提升皮肤细胞对紫外线的抵抗力，减少皮肤细胞中核酸分子的损伤，及改善皮肤纹理与减少斑点，最终达到预防皮肤老化的目标。因此，特纳卡树皮萃取成物可用于制备预防皮肤老化的组合物。