一种修复皮肤的组合物及其制备的化妆品的制作方法

本发明涉及化合物
技术领域：
，尤其涉及一种修复皮肤的组合物及其制备的化妆品。
背景技术：
：皮肤的生理结构，包括表皮层，基底膜和真皮层以及细胞神经通信等方面，随着人体的不断衰老以及外部的刺激，皮肤出现老化现象，表现为皱纹、松弛、弹性丧失、粗糙、色素沉着、皮肤萎缩及毛细血管扩张。而这些皮肤的老化现象可以归结为表皮层、基底膜和真皮层的损伤，以及损伤后带来的神经通信的不顺畅。表皮层和真皮层的损伤体现在角质形成细胞和成纤维细胞的衰亡和凋零，这也是目前较多的化妆品关注的点，而基底膜的损伤在目前关注还不是很多。基底膜的的变化对真皮和表皮会产生深远的影响，基底膜的连续性被破坏后，表皮细胞失去与基底膜的联系，直接与裸露的真皮相连，影响表皮和真皮的结构支撑及营养物质、水分的运输。表皮无法得到正常的营养和水分供给，自身的角质化就会收到影响，最终导致皮肤的最外层保护层-角质层的屏障功能的缺失。而且基底膜的受损也将导致几种生长因子在真皮和表皮中的传导，这些传导受阻也将进一步地导致皮肤结构受损。所以在修复角质层和真皮层，促进角质形成细胞和成纤维细胞增殖的同时，也应该注意基底膜的修复，使得皮肤的结构保持完整性。另外皮肤中控制细胞分化和细胞增殖的mc-2r和mor-1神经受体的表达量不断地降低，神经受体的表达量降低，意味着当细胞发出促肾上腺皮质素和内啡肽时，由于mc-2r和mor-1神经受体的缺失，导致细胞的分化、增殖和迁移受抑制，无法完成细胞的修复，从而导致皮肤无法完成自我修复。虽然大部分的原料都有促进细胞增殖的功效，但是只有在合理的调节神经受体的条件下，才能保证皮肤的细胞不仅仅是增殖，并能在增殖的情况下正常分化和迁移，从而实现皮肤结构的完整性。而皮肤的完整性不仅仅限于作为生理屏障的表皮，也包括了作为生化屏障的微生物层，皮肤的微生物层，是微生物菌群赖以生存的栖身之地，每平方厘米约有十亿细菌和平共处在皮肤的表皮，形成微生态的“防护盾”。皮肤的微生态是由皮肤微生物、宿主皮肤与环境共同构成的统一体。他们相互制约、相互协调，保持动态平衡，是皮肤的第一道生物屏障，平衡中任意一环被打破都会引发微生态失衡。如皮肤环境异常或受外部刺激时，某些常定植于皮肤上的菌群也会引发疾病。例如，痤疮丙酸杆菌是皮肤的常驻微生物，但是人压力徒增导致脸部油脂分泌过多时，就会导致痤疮丙酸杆菌大量繁殖，导致痤疮的生成，从而造成组织的破坏。痤疮丙酸杆菌的过度繁殖也将导致整个皮肤微生态失衡，微生态的失衡也将导致皮肤最外面的这一生化屏障受损，导致皮肤的物理屏障退化，有害物质的入侵，从而对皮肤进行更深层次的破坏。因此在考虑到修复皮肤的完整性的时候，不仅要考虑到皮肤的结构，即皮肤的生理结构的修复，也必须考虑到微生物层的修复，即皮肤的生化结构的修复。皮肤的完整性是修复型化妆品追求的最终目标。但是现有的化妆品对皮肤的修复的机理更多的是建立在皮肤的结构的修复，即更多的是关注于皮肤表层的角质层的修复等，忽略了皮肤表层的微生物层的修复和皮肤结构上其他方面的修复以及细胞的神经信号传递的修复。技术实现要素：有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种修复皮肤的组合物及其制备的化妆品，该组合物不仅能够促进表皮细胞的增殖，还能够抑制有害细菌，且具有补水保湿的作用。本发明所述的补水、保湿、抗菌和/或促进细胞增殖的组合物由如下质量份的组分组成：亚麻籽提取物0.0005～0.0075份；欧蓍草提取物0.0005～0.01份。一些实施例中，所述组合物由如下质量份的组分组成：亚麻籽提取物1份；欧蓍草提取物1份。一些实施例中，所述组合物由如下质量份的组分组成：亚麻籽提取物0.0075份；欧蓍草提取物0.01份。本发明提供的组合物由亚麻籽提取物和欧蓍草提取物组成。本发明采用的组合物能够实现皮肤结构上的修复，实现皮肤组织架构的完善，另外基于神经信号传递的修复，促进细胞分化、增殖和迁移，从而不仅在结构上修复和维持皮肤组织结构，更保证了细胞间的神经信号的有效传递。各组分的叠加使用产生明显的增效协同作用，提高了皮肤屏障修复的功效结果，显著优于对照组。相对于单纯的化妆品基质而言，各组合物产生显著的补水、保湿、抗菌和/或促进细胞增殖的效果(p<0.05)；与部分组分的组合相比，本发明的组合效果更显著，说明各组分复配能够产生良好的增效协同作用。而与用量相当的但配比不同的对照样品相比，组合物的效果更显著，说明适当的配比有利于于各组分增效协同作用的产生。本发明所述的组合物在制备修复皮肤生理和/或生化结构的化妆品中的应用。本发明中，所述修复包括补水、保湿、抗菌和/或促进细胞增殖。本发明中，所述的补水包括即时补水以及长效补水两方面。本发明实施例中提供的组合物能在30分钟时皮肤的水分含量增加到171.2％，120分钟时补水效果仍有167.3％左右，即时补水效果明显，持续时间较长。从长效的补水效果来看，持续的使用本发明的组合物，在28天时皮肤的水分含量增长约13.14％，继续使用，皮肤的水分含量会持续增长。本发明中，所述的保湿包括即时保湿以及长效保湿两方面。从皮肤水分散失量的减少量来看，采用本发明的组合物能够降低皮肤水分散失量，使用30分钟时，皮肤的水分散失量的减少量达到11.5％。持续28天使用本发明的组合物，皮肤的水分散失量的减少量达到13.31％，即皮肤的水分散失量在不断的减少，体现了皮肤的屏障功能得到了有效的修复。本发明中，所述的促进细胞增殖作用中，所述细胞为成纤维细胞。从成纤维细胞的增殖效果来看，本发明组合物能有效的促进成纤维细胞增殖，增殖率达到了124.40％，组合物对成纤维细胞增殖的促进作用证明该组合物可以有效的改善皮肤中真皮层的损伤；从而有效的防止皮肤结构的进一步被破坏，提高了皮肤的稳定性，对皮肤的生理结构产生良好的修复作用。本发明实施例中，验证抗菌作用的有害菌为金黄色葡萄球菌。体外测试金黄色葡萄球菌的抑制率结果显示，本发明的组合物对金黄色葡萄球菌存在显著的抑制作用。本发明的组合物在皮肤表面微生态被破坏后6小时，可以让皮肤的菌落数恢复至61.82％，12小时后皮肤的菌落数可以恢复到菌落破坏之前的90.91％水平。另外组合物对皮肤有害的金黄色葡萄球菌的增殖得到抑制，在12小时后对皮肤表面的金黄色葡萄球菌的抑制率维持在60.87％。组合物对金黄色葡萄球菌的抑制作用证明该组合物可以修复皮肤表面菌群，从而对皮肤的生化结构产生良好的修复作用。本发明还提供了一种修复皮肤生理和/或生化结构化妆品，其包括本发明所述的组合物及化妆品基质；其中本发明所述的组合物的质量分数为0.2％～3.5％。所述化妆品的基质包括：溶解剂、保湿剂、促渗剂、增稠剂和防腐剂；实验证明，本发明采用的化妆品基质不干扰组合物功效的产生，且对组合物功效能够起到更好的促进作用。所述溶解剂为水、甘油和1,3-丁二醇；所述溶解剂中，甘油和1,3-丁二醇不仅作为溶解剂使用，还具有一定的保湿作用。所述水、甘油和1,3-丁二醇的质量比为(81.8545～82.9823)：(15.03～15.45)：(0.025～0.5)。所述保湿剂为透明质酸；本发明所述的保湿剂包括分子量为210万da的透明质酸(高分子量透明质酸)以及经过酶切的分子量为1000～5000da的透明质酸(小分子透明质酸)。所述高分子量透明质酸与小分子透明质酸的质量比为1:20。其中，大分子量的透明质酸作用于皮肤表面，而小分子透明质酸能够进入皮肤内部，起到补水保湿的作用。所述促渗剂为羟乙基哌嗪乙烷磺酸和戊二醇；促渗剂又称经皮吸收促进剂(penetrationenhancers)，能够降低活性物质通过皮肤的阻力，加速活性物质穿透皮肤的物质。本发明选择的促渗剂对皮肤皮肤无损害或刺激。所述化妆品中，促渗剂的质量分数为0.41％～0.6％。所述增稠剂为黄原胶；所述增稠剂能够增加化妆品的浓稠度。所述化妆品中增稠剂的质量分数为0.0005％～0.01％。所述防腐剂为对羟基苯乙酮、苯氧乙醇和苯甲酸钠。防腐剂用于抑制化妆品中的微生物滋生，延长化妆品的保存期。化妆品中防腐剂的质量分数为0.5012％～0.518％。其中所述对羟基苯乙酮、苯氧乙醇与苯甲酸钠的质量比为0.5：(0.0009～0.0135)：(0.0003～0.0045)。一些实施例中，本发明所述化妆品由如下质量分数的组分组成：一些具体实施例中，本发明所述化妆品由如下质量分数的组分组成：一些具体实施例中，本发明所述化妆品由如下质量分数的组分组成：一些具体实施例中，本发明所述化妆品由如下质量分数的组分组成：本发明所述化妆品为乳液、原液、精华液、爽肤水、面膜、膏霜、洁面乳等。本发明实施例中，所述化妆品为原液。本发明所述化妆品的制备方法，包括：制备亚麻籽提取物的母液a：称取亚麻籽提取物，与60倍质量的甘油混合，25℃以250～300r/min速度搅拌溶解，加入苯甲酸钠和苯氧乙醇，搅拌溶解后，加入水稀释至亚麻籽提取的质量分数为0.5％；制备欧蓍草提取物的母液b：称取欧蓍草提取物与等质量的黄原胶，加入欧蓍草提取物128倍质量的水，25℃以250～300r/min速度搅拌至溶解透明，加入1,3-丁二醇和戊二醇，稀释至欧蓍草提取的质量分数为0.5％；称取210万透明质酸、酶切透明质酸、羟乙基哌嗪乙烷磺酸、果糖和菊粉，加入去离子水加热至75～80℃，以250～300r/min,搅拌溶解20min；加入甘油和对羟基苯乙酮，温度控制为65～75℃，以300r/min，搅拌溶解15min；依次加入所述母液a、母液b，温度控制45℃以下，以100r/min，搅拌15min,冷却至室温制得化妆品。本发明中所述的室温为18～30℃。本发明还提供了一种修复皮肤生理和/或生化结构的方法，其为外用本发明所述的化妆品。所述外用为涂抹、喷洒、贴敷。本发明提供的组合物由亚麻籽提取物、欧蓍草提取物组成。本发明提供的组合物能够实现皮肤结构上的修复，实现皮肤组织架构的完善，另外基于神经信号传递的修复，促进细胞分化、增殖和迁移，从而不仅在结构上修复和维持皮肤组织结构，更保证了细胞间的神经信号的有效传递。各组分的叠加使用产生明显的增效协同作用，提高了皮肤屏障修复的功效结果，显著优于对照组。附图说明图1专利组合的即时补水效果；图2专利组合的长效补水效果；图3专利组合即时皮肤水分散失量的减少量；图4专利组合长效皮肤水分散失量的减少量；图5成纤维细胞细胞增殖率；图6正常皮肤菌群的恢复效果；图7皮肤金黄色葡萄球菌的抑制效果。具体实施方式本发明提供了一种修复皮肤的组合物及其制备的化妆品，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。亚麻籽提取物为亚麻科植物亚麻(linumusitatissimum)的干燥成熟种子经提取蛋白质后水解制得，富含大量的植物多肽。本发明采用亚麻籽提取物来促进抗菌肽的合成。欧蓍草提取物提取自欧蓍草(achilleamillefolium)的地上部分，活性成分为黄酮类物质，能够促进mc-2r和mor-1的表达，修复皮肤内细胞间的神经信号的传递，从而促使细胞增殖、迁移和分化，最终达到修复皮肤生理结构的目标。本发明中所述化妆品的原液是指添加相对单一的高浓度护肤成分，能针对各种肌肤需要，给肌肤更直接、更安全、更强效的保养，让肌肤在短时间内恢复最佳状态的美容产品，原则上全成分不超过20个。下面结合实施例，进一步阐述本发明：实施例1～3表1实施例1～3组方(单位：g)制备方法包括：1、采用冷配的方式制备亚麻籽提取物的母液a。具体操作为称取0.5％的亚麻籽提取物浓缩液，加入30％的甘油，以250-300r/min速度搅拌至透明，加入0.3％苯甲酸钠和0.9％苯氧乙醇，搅拌溶解后，加入68.3％的去离子水进行稀释。最后过滤后冷藏备用。2、采用冷配的方式制备欧蓍草提取物的母液b。具体操作为称取0.5％的欧蓍草提取物浓缩液和0.5％的黄原胶，加入64％的去离子水，以250-300r/min速度搅拌至溶解透明，加入25％的1,3-丁二醇和10％戊二醇，搅拌均匀。最后过滤后冷藏备用。3、按照表1组方称取210万透明质酸、酶切透明质酸、羟乙基哌嗪乙烷磺酸、果糖和菊粉，加入去离子水加热至75-80℃，以250-300r/min,搅拌20min,直至溶解透明；4、按照表1组方加入15g甘油和对羟基苯乙酮，温度控制为65-75℃，以300r/min，搅拌15min，直至所有添加物全部溶解；5、按照组方依次加入母液a、母液b，温度控制45℃以下，以100r/min，搅拌15min,静置恢复到室温即可。对比例1～3表2对比例1～3组方(单位：g)制备方法包括：1、采用冷配的方式制备亚麻籽提取物的母液a。具体操作为称取0.5％的亚麻籽提取物浓缩液，加入30％的甘油，以250-300r/min速度搅拌至透明，加入0.3％苯甲酸钠和0.9％苯氧乙醇，搅拌溶解后，加入68.3％的去离子水进行稀释。最后过滤后冷藏备用。2、采用冷配的方式制备欧蓍草提取物的母液b。具体操作为称取0.5％的欧蓍草提取物浓缩液和0.5％的黄原胶，加入64％的去离子水，以250-300r/min速度搅拌至溶解透明，加入25％的1,3-丁二醇和10％戊二醇，搅拌均匀。最后过滤后冷藏备用。3、按照表1组方称取210万透明质酸、酶切透明质酸、羟乙基哌嗪乙烷磺酸、果糖和菊粉，加入去离子水加热至75-80℃，以250-300r/min,搅拌20min,直至溶解透明；4、按照表1组方加入15g甘油和对羟基苯乙酮，温度控制为65-75℃，以300r/min，搅拌15min，直至所有添加物全部溶解；5、按照组方依次加入母液a、母液b，温度控制45℃以下，以100r/min，搅拌15min,静置恢复到室温即可。功效评测1)皮肤的即时及长效补水效果-测试仪器：德国ck公司多功能皮肤测试仪，型号corneometercm825mdd，-测试原理：采用电容法测试人体皮肤角质层的水分含量，它的原理是基于水和其他物质的介电常数差异显著，按照皮肤含水量不同，测得皮肤的电容值不同，其观测参数可代表皮肤水分值。-测试环境：测试环境温度为22±1℃，湿度为50±5％，并且进行实时动态检测；-测试志愿者：有效志愿者至少30人，年龄在16-65岁之间(妊娠或浦乳期妇女除外)；前臂测试区域电容法皮肤水分测定意义的基础值在15-100之间；无严重系统疾病，无免疫缺陷或自身免疫性疾病者；既往对护肤类化妆品无严重过敏史者；近一个月内未曾使用激素类药物及免疫抑制剂者；未参加其他临床试验者；按规定使用受试药物且资料齐全；测试前所有自愿者应填写知情同意书。-测试步骤：测试前准备：受试部位前2-3天不能使用任何产品(化妆品或外用药品)。实验前，受试者需要同意清洁双手前臂内测，自然风干。清洁后受试者双手前臂内测做好测量区域标记。正式测试前应在符合标准房间内静坐至少30min，不能喝水，前臂暴露，呈测试状态放置，保持放松。测试过程：实验中左右手臂内侧标记3×3cm2试验区域，同一手臂可以标记多个区域，区域间隔1cm。测试产品和空白对照均随机分布在左右手臂上。使用探头corneometercm825mdd进行受试区域和对照区域的皮肤水分含量测量。每个区域依照平行测定15次。先测量各测试区域的空白值，然后按0.072ml样品/cm2的用量，将样品注入到膜布中，并敷在试验区内，时间为20分钟。20分钟后揭掉面膜布，10分钟后测试该区域皮肤水分含量，即为30分钟时皮肤的水分含量。之后分别测量1小时，2小时，受试区域和空白对照区域的皮肤含水量(验证时按此时间测定)，同一个志愿者的测试由同一个测量人员完成。对于长效补水的测试，受试者每天在同一区域按照上述测试方法自行进行涂抹测试样品，并在第14、28天时在不涂抹待测样品的情况下，测试皮肤的水分含量。测试数据：按实验的设计分别测得各时间段的皮肤水分含量，并计算各个时间点的皮肤水分含量的增加量。实验结果：1.1)即时补水结果表3专利组合的即时补水效果结果：从即时的补水效果来看，对照样-1为基础配方具有一定的补水效果，30分钟时水分含量增加量为127.7％。实例样-1在30分钟时皮肤的水分含量增加到171.2％，120分钟时补水效果仍有167.3％，即时补水效果明显，持续时间较长。1.2)长效补水效果表4专利组合的长效补水效果结果：从长效的补水效果来看，持续的使用实例样-1时，皮肤的水分含量会有一个增长的过程，在28天时皮肤的水分含量增长约13.14％。同时也侧面的反应了皮肤的屏障功能得到修复，使皮肤的水分含量得到提升。相对于对照组1，各实验组的补水效果更显著(p<0.05)，说明本发明的组合物存在显著的补水效果；与对照组2相比，实施例1～3的补水效果更显著(p<0.05)，说明多组分的组合产生更显著的增效协同作用，其效果优于其中部分组分的组合；与对照组3相比，实例样1～3的补水效果存在统计学差异(p<0.05)，说明需在特定配比下，各组分才能产生更好的增效协同作用；相对于实例样1～2，实例样3的补水效果更显著(p<0.05)，说明适当的浓度下，组合物的补水效果更显著。2)皮肤的屏障修复效果(tewl值)-测试仪器：德国ck公司多功能皮肤测试仪，探头型号tewametertm300，-测试原理：fick菲克扩散定律：dm/dt＝d.a.dp/dx。通过两组温度、湿度传感器测定近表皮(约1cm内)由角质层水分散失在不同亮点形成的水蒸气压梯度，直接测出经皮散发的水分量。tewl值是皮肤屏障好坏的一个重要标志，皮肤的tewl值越低，说明皮肤的屏障功能越好，反之越差。-测试环境：测试环境温度为22±1℃，湿度为50±5％，并且进行实时动态检测；-测试志愿者：有效志愿者至少30人，年龄在16-65岁之间(妊娠或浦乳期妇女除外)；无严重系统疾病，无免疫缺陷或自身免疫性疾病者；既往对护肤类化妆品无严重过敏史者；近一个月内未曾使用激素类药物及免疫抑制剂者；未参加其他临床试验者；按规定使用受试药物且资料齐全；测试前所有自愿者应填写知情同意书。-测试步骤：测试前准备：受试部位前2-3天不能使用任何产品(化妆品或外用药品)。实验前，受试者需要同意清洁双手前臂内测，自然风干。清洁后受试者双手前臂内测做好测量区域标记。正式测试前应在符合标准房间内静坐至少30min，不能喝水，前臂暴露，呈测试状态放置，保持放松。测试过程：实验中左右手臂内侧标记3×3cm2试验区域，同一手臂可以标记多个区域，区域间隔1cm。测试产品和空白对照均随机分布在左右手臂上。使用探头tewametertm300进行受试区域和对照区域的皮肤水分散失量测量。每个区域依照平行测定15次。先测量各测试区域的空白值，然后按0.072ml样品/cm2的用量，将样品注入到膜布中，并敷在试验区内，时间为20分钟。20分钟后揭掉面膜布，10分钟后测试该区域皮肤水分散失含量，即为30分钟时皮肤的水分散失量。之后分别测量1小时，2小时，受试区域和空白对照区域的皮肤水分散失量，同一个志愿者的测试由同一个测量人员完成。对于长效的屏障修复的测试，受试者每天在同一区域按照上述测试方法自行进行涂抹测试样品，并在第14、28天时在不涂抹待测样品的情况下，测试皮肤的水分散失量tewl。测试数据：按实验的设计分别测得各时间段的皮肤水分散失量，并计算各个时间点的皮肤水分散失量的减少量。皮肤水分散失量的减少量越大，皮肤屏障修复的效果越好。实验结果：2.1)即时屏障修复效果表5即时皮肤水分散失量的减少量结果：从皮肤水分散失量的减少量来看，对照样-1为基础样具有一定的降低皮肤水分散失量的效果，30分钟时，皮肤的水分散失量的减少为5.9％，实例样-1的皮肤的水分散失量的减少量达到11.5％，显著降低了皮肤的水分散失量，体现了即时的皮肤屏障的修复的效果。2.2)长效屏障修复效果表6长效皮肤水分散失量的减少量结果：从长效的皮肤水分散失量的减少量的结果来看，持续28天实例样-1的使用，使得皮肤的水分散失量的减少量达到13.31％，即皮肤的水分散失量在不断的减少，体现了皮肤的屏障功能得到了有效的修复。相对于对照组1，各实验组的保湿效果更显著(p<0.05)，说明本发明的组合物存在显著的保湿效果；与对照组2相比，实施例1～3的保湿效果更显著(p<0.05)，说明多组分的组合产生更显著的增效协同作用，其效果优于其中部分组分的组合；与对照组3相比，实例样1～3的保湿效果存在统计学差异(p<0.05)，说明需在特定配比下，各组分才能产生更好的增效协同作用；相对于实例样1～2，实例样3的保湿效果更显著(p<0.05)，说明适当的浓度下，组合物的保湿效果更显著。3)成纤维细胞增殖效果-mtt染色法-实验原理mtt全称为3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-h-tetrazoliumbromide，汉语化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝，是一种黄颜色的染料。mtt法又称mtt比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性mtt还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(dmso)能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在540或720nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，mtt结晶形成的量与细胞数成正比。-实验材料和方法实验材料:dmem、dpbs、typsin-edta、petridish、96welldish、0.4％台盼蓝溶液、无水乙醇或95％乙醇溶液、普通显微镜、细胞计数板、移液枪、mtt、dmso-实验方法：1.成纤维细胞培养：将培养好的成纤维细胞用typsin-edta处理后收集，用dmem悬浮后利用血细胞计数板计数后将悬浮液稀释到细胞的浓度为5×104cells/ml备用。将准备好的细胞悬浮液分别分株到96welldish和6welldish中培养，其中96welldish接种量为100ul，6welldish接种量为2ml。在37℃，5％co2的培养箱中培养24小时。2.样品添加：待测样品用dmem培基稀释，稀释后的浓度分别为：1％(该浓度通过前面的mtt测试，结果为无毒)。细胞培养24小时后，移除之前的dmem，然后用dpbs小心洗涤后。按照顺序加入第一步准备的添加了待测样品的dmem培养基。在37℃，5％co2的培养箱中培养48小时。3.mtt染色：冷冻保管的mtt粉末利用dpbs溶解，配制成浓度为2mg/ml的溶液。48小时培养后的96welldish中，移除培养基后，分别添加50ul/well的mtt溶液。在37℃，5％co2的培养箱中培养3小时。3小时后完全移除mtt溶液。mtt溶液完全移除后各个well中分别添加100ul/well的dmso溶液使蓝紫色结晶甲瓒(formazancrystal)溶解。在595nm处测吸光光度。以空白样为基准，计算出各个样品的细胞增殖率。实验结果：表7成纤维细胞增殖率成纤维细胞增殖率(％)标准偏差对照样-198.824.3对照样-2114.623.2对照样-3101.424.8实例样-1124.402.4实例样-2120.544.7实例样-3130.503.8结果：从成纤维细胞的增殖效果来看，实例样-1能有效的促进成纤维细胞的增殖，增殖率达到了124.40％，成纤维细胞的增殖可以有效的改善皮肤中真皮层的损伤，从而有效的防止皮肤结构的进一步被破坏，从而提高了皮肤的稳定性。相对于对照组1，各实验组的促进细胞增殖的效果更显著(p<0.05)，说明本发明的组合物存在显著的促进细胞增殖的效果；与对照组2相比，实施例1～3的促进细胞增殖的效果更显著(p<0.05)，说明多组分的组合产生更显著的增效协同作用，其效果优于其中部分组分的组合；与对照组3相比，实例样1～3的促进细胞增殖的效果存在统计学差异(p<0.05)，说明需在特定配比下，各组分才能产生更好的增效协同作用；相对于实例样1～2，实例样3的促进细胞增殖的效果更显著(p<0.05)，说明适当的浓度下，组合物的促进细胞增殖的效果更显著。4)皮肤微生态的恢复效果(菌落总数检测方法)-实验原理：微生物活体数量的测定方法，常用平板培养计数法。它是通过将样品制成均匀的一系列不同稀释度的稀释液，再取一定的稀释液接种，使其均匀分布于培养皿中特定的培养基内，最后根据在平板上长出的菌落数计算出每克(或每毫升)样品中的活菌数量。本测试中采用灭活的棉签在皮肤的固定区域内进行皮肤菌落的采集，采集后将棉签浸泡于灭活的生理盐水中，震荡分散后进行微生物活体数量的测定。-实验仪器：90mm培养皿、无菌锥形瓶、移液枪及枪头、灭菌锅、恒温培养箱、涂棒、酒精灯、超净工作台、磁力搅拌器、漩涡振荡器、棉签-实验材料：生理盐水、75％酒精溶液、卵磷脂、吐温80-营养琼脂培养基培养基成分：蛋白胨20g、牛肉膏3g、氯化钠5g、琼脂15g、卵磷脂1g、吐温807g、蒸馏水1000ml。制法：先将卵磷脂加到少量蒸馏水中，加热溶解，加入吐温80，将其他成分(除琼脂外)加到其余的蒸馏水中，溶解。加入已溶解的卵磷脂、吐温80，混匀，调节ph值为7.1～7.4，加入琼脂，121℃高压灭菌20min，储存于冷暗处备用。-实验方法：1、实验中左右手臂内侧标记3×3cm2试验区域，同一手臂可以标记多个区域，区域间隔1cm。测试产品和空白对照均随机分布在左右手臂上。2、选中6个区域，各个区域用灭菌的棉签蘸取少量生理盐水来回擦拭50次后，将棉签浸泡至相同体积的生理盐水中，用漩涡振荡器进行震荡，将菌分散到生理盐水中。该样品作为皮肤初始的菌落数，记为a0；其中金黄色葡萄球菌的数量为b0。2、手臂内侧6个区域，分别用3×3cm2的膜布覆盖，之后在膜布中注入0.4ml75％的酒精溶液进行灭菌。灭菌后，各个区域用灭菌的棉签蘸取少量生理盐水来回擦拭50次后，将棉签浸泡至相同体积的生理盐水中，用漩涡振荡器进行震荡。该样品为检测菌是否被杀灭。3、手臂内侧6个区域灭菌后，分别用3×3cm2的膜布覆盖，之后在各个膜布中分别注入相应的专利样品，模拟面膜敷20分钟后去除膜布4、之后隔6小时、12小时分别用灭菌的棉签蘸取少量生理盐水来回擦拭50次后，将棉签浸泡至相同体积的生理盐水中，用漩涡振荡器进行震荡，将菌分散到生理盐水中。该样品作为皮肤菌落数的恢复值，记为a1，其中金黄色葡萄球菌的数量为b1。5、10倍系数稀释样品6、将融化并冷至45℃-50℃的卵磷脂吐温80营养琼脂培养基倾注到培养皿中，每个培养皿约15ml，随即转动培养皿，使样品与培养基充分混合均匀，待琼脂凝固后，翻转培养皿，置于36℃培养箱中培养48h。7、菌落计数：先用肉眼观察，点数菌落数，然后用5～10倍放大镜检查，以防遗漏。记下各个培养皿的菌落数后，求出同一稀释度各培养皿生长的平均菌落数。8、通过下列公式计算出皮肤的菌落的恢复率：recoveryeffect＝【(a0-a1)/a0】×100％；金黄色葡萄球菌的抑制率：s.aureusinhibitionratio＝【(b0-b1)/b0】×100％-实验结果：表8正常皮肤菌群的恢复效果结果：从皮肤菌群的恢复效果可以发现，受损的皮肤的菌落数能够快速的恢复到受损前的菌落数。实例样-1在微生态被破坏后6小时时可以让皮肤的菌落数恢复至61.82％，12小时后皮肤的菌落数可以恢复到菌落破坏之前的90.91％水平，而对照样-1在12小时后只能恢复78.90％。另外对皮肤有害的金黄色葡萄球菌的增殖得到抑制，实例样-1在12小时后对皮肤表面的金黄色葡萄球菌的抑制率维持在60.87％。相对于对照组1，各实验组的抑菌效果更显著(p<0.05)，说明本发明的组合物存在显著的抑菌效果；与对照组2相比，实施例1～3的抑菌效果更显著(p<0.05)，说明多组分的组合产生更显著的增效协同作用，其效果优于其中部分组分的组合；与对照组3相比，实例样1～3的抑菌效果存在统计学差异(p<0.05)，说明需在特定配比下，各组分才能产生更好的增效协同作用；相对于实例样1～2，实例样3的抑菌效果更显著(p<0.05)，说明适当的浓度下，组合物的抑菌效果更显著。以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页12