犬免疫球蛋白在制备犬溶血性贫血药物中的应用的制作方法

本发明属于医药领域，涉及犬免疫球蛋白在制备犬溶血性贫血药物中的应用，具体涉及犬免疫球蛋白在制备治疗犬葱属植物中毒、药物中毒等引起的红细胞被氧化，产生海恩茨小体，从而引起犬溶血性贫血药物中的应用。

背景技术：

犬葱属植物中毒、药物中毒等引起的溶血性贫血属于免疫介导溶血性贫血(imha)，其是由于自身的红细胞抗体造成慢性网状内皮系统溶血和(或)急性血管内溶血的一种免疫性疾病，属于ⅱ型变态反应，是犬最常见的免疫性疾病，也是犬溶血性贫血的常见病因。如果治疗不及时会导致犬因失血过多而死亡。目前治疗免疫介导溶血性贫血的药物有糖皮质激素、硫唑嘌呤、环孢菌素、环磷酰胺和达那唑，这些药物在应用时会产生一定的副作用，如抑制淋巴细胞的活性、肝细胞毒性等。

免疫球蛋白是(ig)是指具有抗体活性或化学结构上与抗体相似的球蛋白。ig是血液和组织液中一类糖蛋白，由b细胞接受抗原(如病原体)刺激后增殖分化为浆细胞所产生，其主要作用是与抗原起免疫反应，生成抗原-抗体复合物，从而阻断病原体对机体的危害，使病原体失去致病作用，是体液免疫的重要效应分子。目前未见犬免疫球蛋白用于治疗由葱属植物中毒、药物中毒引起犬溶血性贫血的报道。

技术实现要素：

本发明针对上述技术问题，通过犬洋葱中毒试验、犬对乙酰氨基酚中毒试验模型证实犬免疫球蛋白对犬由于红细胞被氧化后的保护作用，发现了犬免疫球蛋白对犬洋葱及对乙酰氨基酚中毒引起的溶血性贫血具有较好的治疗效果。

同时提供了犬免疫球蛋白在制备犬溶血性贫血药物中的应用，具体为，犬免疫球蛋白在制备犬葱属植物中毒或药物中毒引起的红细胞被氧化、产生海恩茨小体、从而引起的犬溶血性贫血药物中的应用。

其中，葱属植物包括青葱(大葱)、蒜、洋葱、韭等植物。

本发明所述药物限于犬科或猫科动物使用。

本发明所述药物为药学上可接受的任何剂型。具体地可将犬免疫球蛋白和药学上可接受的辅料制备成各种剂型。所述的辅料可以是淀粉、蔗糖、糊精、微晶纤维素、预胶化淀粉、羧甲基纤维素钠、交联聚维酮、乙醇、聚乙烯吡咯烷酮、硬脂酸镁、氧化镁等常规药物辅料中的一种或多种。所述的剂型可以是口服制剂或注射剂。所述的口服制剂是片剂、胶囊或微丸。所述的注射剂是注射液或注射用冻干粉针。

本发明优选将犬免疫球蛋白制备成注射液。优选地，所述注射剂为静脉注射剂或肌肉注射剂。

当犬免疫球蛋白作为静脉注射剂时，本发明还对犬免疫球蛋白的使用剂量进行了筛选，确定了最佳使用剂量。具体地，所述药物的使用方法为：犬免疫球蛋白静脉注射的剂量为5-10ml/kg体重，每日1次，连用3-7日。最终本发明通过研究证实了犬免疫球蛋白对食用洋葱及对乙酰氨基酚后引起的犬溶血性贫血具有减缓疾病恶化、延缓病情发展的作用。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

犬免疫球蛋白，其结构含有完整的fab及fc片段，进入体内后，可与单核巨噬细胞上的fc受体结合，而起到封闭作用，进而阻止红细胞被破坏，起到了阻止溶血的作用。本发明通过犬洋葱中毒试验、犬对乙酰氨基酚中毒试验模型证实犬免疫球蛋白具有对犬由于红细胞被氧化后的保护作用，进而起到了阻止溶血的作用。与模型组或对照组比较，使用犬免疫球蛋白可明显保护红细胞，能阻止氧化红细胞被巨噬细胞的吞噬作用，从而使红细胞值、红细胞压积值降低缓慢，因此可以延长犬的存活时间，为治疗提供宝贵的时间。因此犬免疫球蛋白可以用于犬溶血性贫血药物的新药开发，并对药物靶标确认有着重要意义，与激素等药物相比毒副作用小，安全性好，与其他药物联用治疗效果更好。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1治疗前动物牙龈照片图，牙龈呈苍白色；

图2为本发明实施例1治疗前动物舌头照片图，舌头呈苍白色；

图3为本发明实施例1中剂量组治疗后动物牙龈照片图，牙龈颜色恢复正常，呈淡红色；

图4为本发明实施例1中剂量组治疗后动物舌头照片图，舌头颜色恢复正常，呈淡红色；

图5为本发明实施例1治疗前红细胞状态图，出现大量海恩茨小体；

图6为本发明实施例1中剂量组治疗后红细胞状态图，海恩茨小体消失，出现大量网织红细胞。

具体实施方式

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面将结合实施例对本发明作进一步的详细介绍。以下实施用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。本发明涉及犬免疫球蛋白是由长春西诺生物科技有限公司采用低温乙醇法从犬血清纯化制备而成，纯度达到95.0％以上。试验用犬为中华田园犬，购自长春经济技术开发区辉武猛犬繁育基地。

实施例1犬免疫球蛋白对犬洋葱中毒引起溶血性贫血的治疗效果评价

1、犬洋葱中毒引起的溶血性贫血模型的建立

洋葱粉碎后拌罐头饲喂犬，建立犬洋葱中毒模型。评价指标为舌头、牙龈的颜色，红细胞数、红细胞压积、总胆红素、海恩茨(heize)小体及网织红细胞数。结果饲喂洋葱后犬的舌头和牙龈变化成苍白色(如图1和图2)，95％以上的红细胞含有heize小体(如图5)。犬的红细胞数、红细胞压积降低明显，总胆红素明显升高。

2、试验分组

将饲喂洋葱后第二天将精神沉郁，舌头、牙龈苍白色的犬挑选出来，随机分成4组，每组10只，分别设定为对照组(ⅳ组)、静注犬免疫球蛋白高剂量组(10ml/kg体重)(ⅰ组)、静注犬免疫球蛋白中剂量组(5ml/kg体重)(ⅱ组)、静注犬免疫球蛋白低剂量组(2.5ml/kg体重)(ⅲ组)。

3、药物的用法用量

对照组动物(iv组)不予任何处理；静注犬免疫球蛋白组分别按照设定的药物剂量进行静脉注射，连续使用3天(因动物模型中海恩茨小体从产生到急剧减少大概需要3天的时间)。具体分组及药物的用法用量见表1。

表1动物分组及药物的用法用量

4、治疗效果评价指标

用药后密切观察实验动物的精神、食欲，并每天观察实验动物的舌头和牙龈的变化。

分别在饲喂洋葱前、给药1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、16天、23天、30天从前肢或/和后肢静脉采血2ml放于血常规测定管中，用于红细胞数和红细胞压积的测定。

分别在饲喂洋葱前、给药1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、11天、13天、15天从上述血常规测定管中吸取2滴血液放入1.5ml离心管中，按1：1的量加入网织红细胞染色液，混匀，静置20分钟。取1滴于载玻片上，晾干后用油镜观察结果。计数1000个红细胞，记录网织红细胞数和heize小体数，按百分比报告结果。

分别在饲喂洋葱前、给药1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、11天、13天从前肢或/和后肢静脉采血2ml放于生化管中，测定总胆红素。

5、犬洋葱中毒引起溶血性贫血的治疗效果

42只试验犬在饲喂洋葱后的第1～2天出现精神沉郁、厌食的症状。饲喂洋葱后1～2天，犬的牙龈苍白、舌头灰黑色。通过血涂片可见，95％以上的红细胞出现海恩茨小体。从42只中随机选择40只用于试验。

高、中剂量组在治疗后第3天，试验犬的精神、食欲基本恢复正常，高、中剂量组试验犬舌头和牙龈颜色比低剂量组和对照组恢复的快，其中，中剂量组见图3和4。低剂量组和对照组在食用洋葱后5天，精神、食欲基本恢复正常。

各组红细胞数和红细胞压积的变化如表2所示。从表2的试验结果可知，与饲喂洋葱前比，药物组和对照组红细胞数、红细胞压积都在饲喂洋葱后呈现下降趋势，红细胞数在第5天降至最低，红细胞压积在第6天降至最低。当红细胞数和红细胞压积降至最低值时，高、中剂量组的值明显高于低剂量组和对照组，并呈显著性差异。之后均开始缓慢升高，高、中剂量组在第16天恢复至正常范围内，低剂量组在第23天恢复至正常范围内，对照组在第30天恢复至正常范围内。

表2各组红细胞数和红细胞压积的变化

犬饲喂洋葱后血液中海恩茨小体总数和网织红细胞总数的变化见表3。药物组和对照组试验犬在食用洋葱后第1天，95.0％以上的红细胞出现海恩茨小体(见图5)，且与饲喂洋葱前相比差异极显著(p＜0.01)；第3天开始海恩茨小体数量开始下降，高剂量组海恩茨小体下降速度低于其它组，高剂量组在第13天检测不出海恩茨小体，中剂量组在第11天检测不出海恩茨小体，低剂量组和对照组均在第9天检测不出海恩茨小体。

各组网织红细胞总数在饲喂洋葱后均逐渐增加，在第6天时增至最多，与饲喂洋葱前相比差异极显著(p＜0.01)，且高、中剂量组的网织红细胞总数明显少于低剂量组和对照组，并呈显著性差异(p＜0.05)，其中中剂量组的红细胞状态见图6所示；之后各组网织红细胞数逐渐减少至正常范围内。

表3各组海恩茨小体和网织红细胞的变化

注：**表示与饲喂洋葱前差异极显著(p＜0.01)，#表示与低剂量组和对照组比较差异显著(p＜0.05)

各组试验总胆红素的变化见表4。从表4的试验结果可知，饲喂洋葱后，药物组和对照组试验犬的总胆红素均逐渐升高，至第3天，总胆红素的含量达到最大值，虽然药物组和对照组总胆红素最大值仍在正常范围内，但是与饲喂洋葱前比较差异极显著(p＜0.01)，说明犬出现了溶血现象。此时药物组总胆红素值与对照组比较差异显著(p＜0.05)，说明静注犬免疫球蛋白可以抑制总胆红素升高，阻止红细胞被破坏。虽然静注犬免疫球蛋白低剂量组的各项指标与对照组比较差异不显著，但是从数值上看，该剂量组在一定程度上可以抑制红细胞破坏、阻止溶血的发生，但其效果不如高剂量组和中剂量组。从各项指标的差异性比较可知，高、中剂量组与对照组比较均差异显著或极显著，但高、中剂量组之间比较差异不显著，因此，推荐临床使用剂量为5ml/kg体重，每天注射1次，连续使用3天。

表4各组试验总胆红素的变化

注：*表示与对照组比较差异显著(p＜0.05)，**表示与对照组比较差异极显著(p＜0.01)，##表示与饲喂洋葱前比较差异极显著(p＜0.01)

实施例2犬药物中毒引起溶血性贫血的治疗作用评价

1、犬对乙酰氨基酚引起的溶血性贫血模型的建立

将15只犬按体重口服对乙酰氨基酚，200mg/kg体重，一次性给予，建立对乙酰氨基酚中毒模型。

2、试验分组

将试验犬随机分成3组，每组5只。i组设为犬免疫球蛋白组(药物组)，ii组设为阳性对照组，iii组设为阴性对照组(模型组)，当试验犬出现临床症状时就开始用药物进行治疗。

3、药物的用法用量

药物的用法用量见表5。

表5药物的用法用量

4、治疗效果评价指标

临床观察指标包括精神状态、饮/食欲、呕吐、脱水状况、可视粘膜的变化。

于饲喂对乙酰氨基酚24h从前肢或/和后肢静脉采血，从采血管中吸取2滴血液放入1.5ml离心管中，按1：1的量加入网织红细胞染色液，混匀，静置20分钟。取1滴于载玻片上，晾干后用油镜观察结果。

分别于饲喂对乙酰氨基酚前、治疗前、治疗第2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天从前肢或/和后肢静脉采血2ml放于血常规测定管中，用于红细胞数和红细胞压积的测定。

试验过程中密切观察试验犬的临床症状，至试验结束时统计各组死亡动物数量。

5、犬药物中毒引起溶血性贫血的治疗效果

15只试验犬在口服对乙酰氨基酚后8～12h均出现精神沉郁、食欲减退，部分犬出现呕吐、腹泻、体温升高等现象，试验动物服药24h后所有犬只的舌头、牙龈等均变成苍白色。由此说明模型成功建立。

犬免疫球蛋白对病犬临床症状的影响：药物组给与犬免疫球蛋白+注射用还原型谷胱甘肽+0.9％氯化钠注射液，阳性对照组给与注射用还原型谷胱甘肽+0.9％氯化钠注射液，阴性对照给与0.9％氯化钠注射液。

给药后阴性对照组和阳性对照组试验犬舌头、牙龈变成苍白色，犬免疫球蛋白组试验犬的舌头、牙龈颜色为浅粉红色。从临床症状可知，给予犬免疫球蛋白后可以保护犬血液中的红细胞，从而减轻贫血的症状，加入犬免疫球蛋白后的治疗效果好于注射用还原型谷胱甘肽组。

药物组、阳性对照组、阴性对照组试验犬在口服对乙酰氨基酚后24h，血液中均出现海恩茨小体。加入犬免疫球蛋白治疗后可以延长海恩茨小体在体内的存留时间。犬免疫球蛋白可以阻止巨噬细胞对氧化红细胞的吞噬作用。

三组试验犬的红细胞值和细胞压积值的对比结果见表6。从表6试验结果可知，药物组、阳性对照组、阴性对照组试验犬的红细胞值和红细胞压积值均逐渐降低，治疗第3～4天降至最低值。从试验结果可知，药物组红细胞值和红细胞压积值降低的幅度最小，以阴性对照组试验犬红细胞值和红细胞压积值降低幅度最大。试验结果说明犬免疫球蛋白可以保护红细胞，与注射用还原型谷胱甘肽联用效果好于单独使用注射用还原型谷胱甘肽组。

表6红细胞值和细胞压积值的对比结果

动物存活数量统计：药物组死亡3只，阳性对照组死亡4只，阴性对照组全部死亡。各组试验动物死亡时间及死亡数量见表7。

表7各组试验犬死亡情况表

综上，犬猫对乙酰氨基酚中毒的核心机制是细胞谷胱甘肽耗竭，缺少了谷胱甘肽结合，n-乙酰苯醌亚胺蓄积引起浓度升高。由于其亲电子特性，n-乙酰苯醌亚胺共价结合细胞蛋白(例如，酶类、结构蛋白和调节蛋白)，通过脂质过氧化破坏蛋白功能和细胞膜。此外，谷胱甘肽耗竭使得细胞易受氧化损伤。对中毒犬猫及时补充谷胱甘肽可以阻止细胞被氧化，缓解中毒症状。而免疫球蛋白，其结构含有完整的fab及fc片段，进入体内后，可与单核巨噬细胞上的fc受体结合，而起到封闭作用，进而阻止被氧化红细胞的破坏，起到了阻止溶血的作用。与谷胱甘肽联合使用可起到双重保护的作用。

以上只通过说明的方式描述了本发明的某些示范性实施例，毋庸置疑，对于本领域的普通技术人员，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可以用各种不同的方式对所描述的实施例进行修正。因此，上述描述在本质上是说明性的，不应理解为对本发明权利要求保护范围的限制。在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。