一种c-Myc基因表达抑制剂及其应用的制作方法

本发明涉及一种c-myc基因表达抑制剂及其应用。

背景技术：

聚酰胺一般是由2-3个不同的五元芳香杂环：n-甲基吡咯(py，芳香残基)、n-甲基咪唑(im，芳香残基)及3-羟基-n-甲基吡咯(hp，芳香残基)组成；在dna小沟中，二个聚酰胺或发卡聚酰胺反平行，边靠边与预先确定的dna碱基序列以1:1比例紧密、特异性识别碱基的合成小分子化合物，即n-甲基吡咯(py)倾向于识别t、a和c碱基；n-甲基咪唑(im)是g碱基的读取元素；3-羟基-n-甲基吡咯(hp)能特异性识别t碱基。到目前为止其中im/py和py/im配对分别识别g·c和c·g，而hp/py配对能把碱基对t·a、a·t区分开。而且聚酰胺具有良好的细胞渗透性，能够进入细胞核中，并且不易被核酸酶水解，相对转录因子能较强的键合特定靶基因。研究证明：它能通过在启动子区和增强子上干涉转录系统，调控与疾病相关突变基因的表达。

尽管人们利用聚酰胺中不同芳香残基的配对能将dna中的四个watson-crick碱基对特异性的区分开；但是，由五元芳香环组成的长链聚酰胺存在刚性过强，曲率过大，不能很好的与dna小沟曲率相匹配的不足；尤其是用hp作为t碱基的识别元素尚存在一些缺点。之前，本实验室成功研发利用(s)-β-羟基-γ-氨基酸残基(^sγβ-oh)与β-丙氨酸残基(β)配对^sγβ-oh/β能很好地将t·a、a·t、c·g、g·c区分开；而且，这样的氨基酸残基(^sγβ-oh)具有柔韧性，起到‘弹簧’一样的作用，能够用于设计较长聚酰胺，使其有效识别人类基因中重复率较低的较长的dna序列，即解决使用较长聚酰胺识别较长dna序列的专一性问题。

因此，本实验室将在之前的基础上发明一种聚酰胺作为c-myc基因表达抑制剂，而且这种聚酰胺通过采用(s)-β-羟基-γ-氨基酸残基(^sγβ-oh)与β-丙氨酸残基(β)配对(^sγβ-oh/β)特异性识别碱基对t·a。

另一方面，20年之前，c-myc基因在人类伯基特淋巴瘤中发现，是禽类逆转录病毒的v-myc基因的细胞同源序列。在v-myc基因的研究基础上发现，c-myc基因是一种原癌基因，在许多癌症中表达出现异常。目前认为乳腺癌、结肠癌、宫颈癌、髓系白血病、黑色素瘤、骨肉瘤、胶质母细胞瘤及小细胞肺癌等恶性肿瘤都存在c-myc基因的失调、高表达。人c-myc基因位于8号染色体q24.1，包括两个内含子和三个外显子。

c-myc基因的转录由多个启动子调控。核酸超敏感元件iii1(nheiii1)也叫作pu27(27bp)控制c-myc基因80％～90％的转录活性。nheiii1富含鸟嘌呤(g)，位于p1启动子上游-142bp～-115bp，能够形成具有转录活性的双螺旋结构。同时nheiii1在一定条件下可以形成分子内g-四链体结构，以无活性的沉默子结构形式抑制c-myc基因的转录。因此，nheiii1被认为通过下调c-myc基因的表达水平治疗肿瘤的潜在靶标。

c-myc原癌基因不仅调控15％的其他人类基因的表达，还参与调控细胞周期、新陈代谢、蛋白质生物合成和microrna调控等多种生理过程。除此之外，c-myc基因还参与调控细胞凋亡，细胞衰亡和dna损伤反应。通过活性氧和异常的dna复制中间体的生成，c-myc基因的过度表达会诱导产生dna损伤反应。dna损伤反应在肿瘤进展中具有双重作用，一方面能够抑制肿瘤的生长，而另一方面也能维护肿瘤的生长。因此，内源性c-myc基因具有内在矛盾性的特征。

c-myc在大多数人类干细胞中表达，并在正常和肿瘤细胞中都密切参与细胞周期、细胞分化、蛋白质合成和细胞凋亡的调控。因此，c-myc基因是癌症治疗发展中重要的基因靶标。目前以c-myc为靶标治疗肿瘤的小分子主要分为两类，一类是通过诱导并稳定c-myc基因启动子区域形成g-四链体来抑制肿瘤细胞的增殖；另一类是通过抑制c-myc/max二聚体的形成达到抑制肿瘤的作用。但是，到目前为止，人类还没有成功开发出以c-myc基因为靶标的临床抗肿瘤药物。

有关使用聚酰胺调控与疾病相关基因的报道：

2000年，chiangetal体外实验研究表明：聚酰胺有效抑制her-2/neu启动子区转录因子与dna的作用，从而抑制her-2/neu基因转录。2006年，matsudaetal首次应用小鼠动物模型研究表明：聚酰胺下调tgf-betal基因mrna及蛋白的表达，预示着聚酰胺有治疗tgf-betal基因高度表达的相关疾病的潜力，包括进展性肾炎、心瓣手术再狭窄。2010年，wang等人发现以鼠为动物模型研究聚酰胺下调mmp-9基因，能够抑制肿瘤的侵入和转移；表明mmp-9基因是聚酰胺抗肿瘤细胞转移的作用靶点。2007年，uenot等人报道利用聚酰胺调控结合组织生长因子ctgf基因。

通过以上对本发明相关的背景资料的检索分析发现：利用聚酰胺作为一种c-myc基因抑制剂；使用含有(s)-β-羟基-γ-氨基酸残基(^sγβ-oh)的聚酰胺对c-myc启动子区序列特异性识别作用，从而抑制肿瘤细胞增殖，促进其凋亡，是有一定依据的。

技术实现要素：

针对现有技术存在的上述技术问题，本发明的目的在于提供一种c-myc基因表达抑制剂及其应用。

一种c-myc基因表达抑制剂，其特征在于包含吡咯-咪唑聚酰胺类化合物，所述吡咯-咪唑聚酰胺类化合物的发夹结构如pa1～pa6中的任意一种所示；

其中，●：n-甲基咪唑残基；○：n-甲基吡咯残基；

β表示β-丙氨酸残基；γ表示γ-氨基酸残基；

^sγβ-oh表示(s)-β-羟基-γ-氨基酸残基；

ac表示乙酰基；dp表示n,n-二甲氨基丙二胺残基。

所述的一种c-myc基因表达抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用。

相对于现有技术，本发明取得的有益效果是：

自主设计合成了吡咯咪唑聚酰胺小分子，首次通过识别配对的方式靶向c-myc基因启动子序列，并且沉默c-myc基因的表达，其中发夹结构如pa6的吡咯-咪唑聚酰胺类化合物体现出较好的细胞毒性，并且能够抑制肿瘤细胞的生长，诱导肿瘤细胞凋亡。发夹结构如pa6的吡咯-咪唑聚酰胺类化合物抑制肿瘤细胞生长的具体过程如图1所示。

本发明的发夹结构如pa1～pa6的吡咯-咪唑聚酰胺类化合物与靶c-myc基因启动子区dna序列作用模式如图2所示。

附图说明

图1为本发明的聚酰胺抑制肿瘤细胞生长的过程示意图；

图2为本发明的聚酰胺与靶c-myc基因启动子区dna序列作用的模式图；

图3a为化合物pa1的制备路线图；

图3b为制备化合物pa1～pa6所使用的单体或二聚体的结构示意图；

图4为本发明的聚酰胺对a549细胞的生长抑制曲线图；

图5为本发明的聚酰胺对a549细胞的杀伤作用图；

图6为本发明的聚酰胺对sgc7901细胞的生长抑制曲线图；

图7为本发明的聚酰胺对sgc7901细胞的杀伤作用图；

图8a为本发明的聚酰胺对a549细胞的c-myc基因rt-pcr扩增产物电泳图；

图8b为本发明的聚酰胺对a549细胞内c-mycmrna水平的抑制图；

图8c为本发明的聚酰胺对a549细胞内c-myc基因蛋白免疫印迹试验产物电泳图；

图8d为本发明的聚酰胺对a549细胞内c-myc蛋白质水平的抑制；

图9a为本发明的聚酰胺对sgc7901细胞的c-myc基因rt-pcr扩增产物电泳图；

图9b为本发明的聚酰胺对sgc7901细胞内c-mycmrna水平的抑制图；

图9c为本发明的聚酰胺对sgc7901细胞内c-myc基因蛋白免疫印迹试验产物电泳图；

图9d为本发明的聚酰胺对sgc7901细胞内c-myc蛋白质水平的抑制；

图10为本发明的聚酰胺对a549细胞迁移的抑制作用图；

图11为本发明的聚酰胺对a549细胞迁移的抑制率图；

图12为本发明的聚酰胺对sgc7901细胞迁移的抑制作用图；

图13为本发明的聚酰胺对sgc7901细胞迁移的抑制率图；

图14a为本发明的聚酰胺诱导肿瘤细胞a549凋亡图之一；

图14b为本发明的聚酰胺诱导肿瘤细胞a549凋亡图之二；

图15a为本发明的聚酰胺诱导肿瘤细胞sgc7901凋亡图之一；

图15b为本发明的聚酰胺诱导肿瘤细胞sgc7901凋亡图之二；

图16a为本发明的聚酰胺阻滞a549细胞周期图之一；

图16b为本发明的聚酰胺阻滞a549细胞周期图之二；

图17a为本发明的聚酰胺阻滞sgc7901细胞周期图之一；

图17b为本发明的聚酰胺阻滞sgc7901细胞周期图之二。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围并不限于此。

实施例1：化合物pa1的制备

主要合成步骤：活化树脂、脱去树脂上保护基团、活化羧基基团、耦合、盖帽、切割树脂等部分。

活化树脂：将树脂用dmf进行充分溶胀。

脱保护：将fmoc保护基团从fmoc保护的树脂上通过哌啶/dmf溶液去保护，释放出游离氨基。

活化羧基：将参与下一个耦合反应的氨基酸羧基部分通过活化试剂hbtu进行活化，形成活化酯，从而高效的与氨基耦合。

耦合：活化好氨基酸与树脂上游离氨基反应，形成肽键。

盖帽：在反应中存在部分未完全反应的氨基结构，必须进行封盖，避免在下次耦合中引起副反应，从而保证合成目标聚酰胺的纯度。

切割：当目标聚酰胺合成结束，需要用dp作为切割试剂将其从树脂上切割下来。

所使用的初始原料和试剂试剂的缩写如表1。

表1：固相合成反应中所用试剂及其缩写

步骤如下：合成步骤如图3a。

1)活化：称取图3b如式(12)所示的fmoc保护β-丙氨酸-clear树脂(sps-1，1.00g，0.4mmol，peptidesinternational)加入到固相反应装置的固相反应管中，通氮气保护，再加入5ml的dmf，使氮气充分鼓泡30min进行活化树脂；

2)脱保护：先配制3ml的20％(v/v)哌啶/dmf(哌啶、dmf均为处理过的无水溶剂)，在氮气保护下加入到步骤1)的固相反应管，充分鼓泡反应15min，脱除β-丙氨酸上的氨基保护基团，抽去反应管中的溶剂，用3ml无水二氯甲烷淋洗两次，2ml无水dmf淋洗一次，每次淋洗后都抽干溶剂；

3)偶合：称取图3b中如式(2)所示的单体(1.6mmol)和hbtu(576.5mg，1.52mmol)加入另一支无水反应瓶，加入5ml无水dmf，振摇至化合物完全溶解，再加入1ml的diea，继续振摇反应20分钟至羧基完全活化，再将溶液加入到固相反应管中，氮气鼓泡反应2.5h，抽干反应液，分别用3ml无水二氯甲烷淋洗两次，2ml无水dmf淋洗一次，每次淋洗后都抽干溶剂；

4)盖帽：配制5ml的5％乙酸酐+5％吡啶/dmf溶液，氮气保护下加入到固相反应管中进行盖帽15min，抽干反应液，分别用3ml无水二氯甲烷淋洗两次，2ml无水dmf淋洗一次，每次淋洗后都抽干溶剂。

这一步为了验证合成产物，从固相反应管中取固体树脂(5mg)加入到5ml的反应瓶中，加入500μl的dp，反应液于55℃反应过夜，切除树脂载体上的产物，用0.45μm的一次性过滤器过滤，取25μl的样品液进行hplc分析(254nm，0.1％tfa水溶液和乙腈为流动相，梯度洗脱，乙腈从0％到100％，流速1.0ml/min)。

5)重复步骤2)，进行脱保护；

6)偶合：称取图3b中如式(4)所示的单体(1.6mmol)和hbtu(576.5mg，1.52mmol)加入反应瓶中，加入5ml等量无水dmf，振摇至化合物完全溶解，再分别加入1ml的diea，继续振摇反应20分钟至羧基完全活化。再将溶液加入到固相反应管中，氮气鼓泡反应2.5h，抽干反应液，分别用3ml无水二氯甲烷淋洗两次，2ml无水dmf淋洗一次，每次淋洗后都抽干溶剂；

7)重复步骤4)、步骤2)，对步骤6)中的反应物进行盖帽和脱保护反应；

为了验证合成产物，进行完步骤4)后，从该固相反应管中分别取固体树脂(5mg)加入5ml的反应瓶中，加入500μl的dp，反应液于55℃反应过夜，切除树脂载体上的产物，用0.45μm的一次性过滤器过滤，取25μl的样品液金星hplc分析(254nm，0.1％tfa水溶液和乙腈为流动相，梯度洗脱，乙腈从0％到100％，流速1.0ml/min)。

8)偶合：称取图3b中如式(10)所示的二聚体(1.6mmol)和hbtu(576.5mg，1.52mmol)加入无水反应瓶，分别加入5ml无水dmf，振摇至化合物完全溶解，再分别加入1ml的diea，继续振摇反应20分钟至羧基完全活化，再将溶液分别加入固相反应管中，氮气鼓泡反应2.5h，抽干反应液，分别用3ml无水二氯甲烷淋洗两次，2ml无水dmf淋洗一次，每次淋洗后都抽干溶剂；

9)重复步骤4)、步骤2)，对固相反应管中的反应物进行盖帽和脱保护反应；

为了验证合成产物，进行与步骤4)相应过程相同。

10)偶合：称取图3b中如式(5)所示的单体(1.6mmol)和hbtu(576.5mg，1.52mmol)加入无水反应瓶，加入5ml无水dmf，振摇至化合物完全溶解，再加入1ml的diea，继续振摇反应20分钟至羧基完全活化，再将溶液分别加入固相反应管中，氮气鼓泡反应2.5h，抽干反应液，分别用3ml无水二氯甲烷淋洗两次，2ml无水dmf淋洗一次，每次淋洗后都抽干溶剂；

11)重复步骤4)、步骤2)，对步骤10)的反应物进行盖帽和脱保护反应；

为了验证合成产物，进行与步骤4)相应过程相同。

12)偶合：称取图3b中如式(10)所示的二聚体(1.6mmol)和hbtu(576.5mg，1.52mmol)加入无水反应瓶，加入5ml无水dmf，振摇至化合物完全溶解，再加入1ml的diea，继续振摇反应20分钟至羧基完全活化，再将溶液分别加入固相反应管中，氮气鼓泡反应2.5h，抽干反应液，用3ml无水二氯甲烷淋洗两次，2ml无水dmf淋洗一次，每次淋洗后都抽干溶剂；

13)重复步骤4)、步骤2)的操作，对步骤12)中的相反应管中的反应物进行盖帽和脱保护反应；

为了验证合成产物，进行与步骤4)相应过程相同。

14)偶合：称取图3b中如式(7)所示的单体(1.6mmol)和hbtu(576.5mg，1.52mmol)加入到无水反应瓶中，加入5ml等量无水dmf，振摇至化合物完全溶解，再加入1ml的diea，继续振摇反应20分钟至羧基完全活化，再将溶液加入到固相反应管中，氮气鼓泡反应2.5h，抽干反应液，分别用3ml无水二氯甲烷淋洗两次，2ml无水dmf淋洗一次，每次淋洗后都抽干溶剂；

15)重复步骤4)、步骤2)的操作，对步骤14)中的相反应管中的反应物进行盖帽和脱保护反应；

为了验证合成产物，进行与步骤4)相应过程相同。

16)偶合：称取图3b中如式(3)所示的单体(1.6mmol)和hbtu(576.5mg，1.52mmol)加入无水反应瓶，加入5ml无水dmf，振摇至化合物完全溶解，再加入1ml的diea，继续振摇反应20分钟至羧基完全活化，再将溶液分别加入固相反应管中，氮气鼓泡反应2.5h，抽干反应液，用3ml无水二氯甲烷淋洗两次，2ml无水dmf淋洗一次，每次淋洗后都抽干溶剂；

17)重复步骤4)、步骤2)和步骤4)的操作，分别对步骤16)的反应液进行同样的盖帽、脱保护、盖帽反应；获得中间体(pa1-a)；

为了验证合成产物，进行与步骤4)相应过程相同。

18)将步骤17)的中间体，连有目标聚酰胺(pa1)的树脂从固相反应管中取出，放入反应瓶中，加入20ml的dp，油浴中55℃过夜反应，停止反应，过滤，收集滤液，真空下除去dp后，得到手性羟基保护的发夹聚酰胺(pa1)的中间体(pa1-b)；

19)在氮气保护下，向步骤18)的中间体加入3ml脱保护试剂重量配比为91：3：3：3的tfa/tms/tis/h2o混合液，室温反应1h脱去羟基上的叔丁基保护，真空下移除溶剂，二氯甲烷溶解产物，用5mol/l的盐酸调至酸性，有固体析出，过滤得到白色的目标产物，含手性(s)-β-羟基-γ-氨基酸修饰的发夹聚酰胺(pa1)。收率15.6％，hplc97.6％，¹h-nmr(400mhz，dmso-d6):10.42(s，1h，芳香nh)，10.38(s，1h，芳香nh)，10.14(s，2h，芳香nh)，9.81(s，1h，芳香nh)，9.67(br，2h，芳香nh)，8.04-7.47(m，3h，脂肪nh)，7.83-7.71(m，2h，脂肪nh)，7.64(s，1h，芳香ch)，7.50(s，1h，芳香ch)，7.58(s，1h，芳香ch)，7.48(s，1h，芳香ch)，7.44(m，2h，芳香ch)，7.39(s，1h，芳香ch)，7.27(m，2h，芳香ch)，5.53(br，1h，oh)，3.98(m，1h，hoch)，3.94(s，6h，2×nch3)，3.90(s，3h，nch3)，3.86(s，6h，2×nch3)，3.80(s，3h，nch3)，3.64(m，2h，nhch2)，3.51(m，2h，nhch2)，3.50-3.41(m，2h，nhch2)，3.32-3.25(m，4h，2×nhch2)，2.68(m，2h，nme2ch2)，2.46(d，³jh，h＝7.2hz，2h，coch2)，2.33(t，³jh，h＝6.8hz，2h，coch2)，2.25-2.20(m，4h，2×coch2)，2.02(s，6h，n(ch3)2)，1.96(s，1h，coch3)，1.76(m，2h，chch2ch2)，1.51(m，2h，ch2ch2ch2)。esi-mass:m/zcalcdforc54h74n21o12[m+h]⁺:1208.58；found:1208.47[m+h]⁺。

实施例2：化合物pa2的制备

合成步骤类似合成pa1(图3a)。步骤如下：

1)活化：与制备pa1第一步1)活化操作相同。称取图3b如式(12)所示的fmoc保护β-丙氨酸-clear树脂(sps-1，1.00g，0.4mmol，peptidesinternational)加入到固相反应装置的固相反应管中，通氮气保护，再加入5ml的dmf，使氮气充分鼓泡30min进行活化树脂；

2)脱保护：先配制3ml的20％(v/v)哌啶/dmf(哌啶、dmf均为处理过的无水溶剂)，在氮气保护下加入到步骤1)的固相反应管，充分鼓泡反应15min，脱除β-丙氨酸上的氨基保护基团，抽去反应管中的溶剂，用3ml无水二氯甲烷淋洗两次，2ml无水dmf淋洗一次，每次淋洗后都抽干溶剂；

3)偶合：称取图3b中如式(8)所示的二聚体(1.6mmol)和hbtu(576.5mg，1.52mmol)加入另一支无水反应瓶，加入5ml无水dmf，振摇至化合物完全溶解，再加入1ml的diea，继续振摇反应20分钟至羧基完全活化，再将溶液加入到固相反应管中，氮气鼓泡反应2.5h，抽干反应液，分别用3ml无水二氯甲烷淋洗两次，2ml无水dmf淋洗一次，每次淋洗后都抽干溶剂；

4)盖帽：配制5ml的5％乙酸酐+5％吡啶/dmf溶液，氮气保护下加入到固相反应管中进行盖帽15min，抽干反应液，分别用3ml无水二氯甲烷淋洗两次，2ml无水dmf淋洗一次，每次淋洗后都抽干溶剂。

这一步为了验证合成产物，从固相反应管中取固体树脂(5mg)加入到5ml的反应瓶中，加入500μl的dp，反应液于55℃反应过夜，切除树脂载体上的产物，用0.45μm的一次性过滤器过滤，取25μl的样品液进行hplc分析(254nm，0.1％tfa水溶液和乙腈为流动相，梯度洗脱，乙腈从0％到100％，流速1.0ml/min)。

5)重复步骤2)，进行脱保护；

6)偶合：称取图3b中如式(10)所示的二聚体(1.6mmol)和hbtu(576.5mg，1.52mmol)加入反应瓶中，加入5ml等量无水dmf，振摇至化合物完全溶解，再分别加入1ml的diea，继续振摇反应20分钟至羧基完全活化。再将溶液加入到固相反应管中，氮气鼓泡反应2.5h，抽干反应液，分别用3ml无水二氯甲烷淋洗两次，2ml无水dmf淋洗一次，每次淋洗后都抽干溶剂；

7)重复步骤4)、步骤2)，对步骤6)中的反应物进行盖帽和脱保护反应；

为了验证合成产物，进行完步骤4)后，从该固相反应管中分别取固体树脂(5mg)加入5ml的反应瓶中，加入500μl的dp，反应液于55℃反应过夜，切除树脂载体上的产物，用0.45μm的一次性过滤器过滤，取25μl的样品液金星hplc分析(254nm，0.1％tfa水溶液和乙腈为流动相，梯度洗脱，乙腈从0％到100％，流速1.0ml/min)。

8)偶合：称取图3b中如式(5)所示的单体(1.6mmol)和hbtu(576.5mg，1.52mmol)加入无水反应瓶，分别加入5ml无水dmf，振摇至化合物完全溶解，再分别加入1ml的diea，继续振摇反应20分钟至羧基完全活化，再将溶液分别加入固相反应管中，氮气鼓泡反应2.5h，抽干反应液，分别用3ml无水二氯甲烷淋洗两次，2ml无水dmf淋洗一次，每次淋洗后都抽干溶剂；

9)重复步骤4)、步骤2)，对固相反应管中的反应物进行盖帽和脱保护反应；

为了验证合成产物，进行与步骤4)相应过程相同。

10)偶合：称取图3b中如式(10)所示的二聚体(1.6mmol)和hbtu(576.5mg，1.52mmol)加入无水反应瓶，加入5ml无水dmf，振摇至化合物完全溶解，再加入1ml的diea，继续振摇反应20分钟至羧基完全活化，再将溶液分别加入固相反应管中，氮气鼓泡反应2.5h，抽干反应液，分别用3ml无水二氯甲烷淋洗两次，2ml无水dmf淋洗一次，每次淋洗后都抽干溶剂；

11)重复步骤4)、步骤2)，对步骤10)的反应物进行盖帽和脱保护反应；

为了验证合成产物，进行与步骤4)相应过程相同。

12)偶合：称取图3b中如式(7)所示的单体(1.6mmol)和hbtu(576.5mg，1.52mmol)加入无水反应瓶，加入5ml无水dmf，振摇至化合物完全溶解，再加入1ml的diea，继续振摇反应20分钟至羧基完全活化，再将溶液分别加入固相反应管中，氮气鼓泡反应2.5h，抽干反应液，用3ml无水二氯甲烷淋洗两次，2ml无水dmf淋洗一次，每次淋洗后都抽干溶剂；

13)重复步骤4)、步骤2)的操作，对步骤12)中的相反应管中的反应物进行盖帽和脱保护反应；

为了验证合成产物，进行与步骤4)相应过程相同。

14)偶合：称取图3b中如式(3)所示的单体(1.6mmol)和hbtu(576.5mg，1.52mmol)加入到无水反应瓶中，加入5ml等量无水dmf，振摇至化合物完全溶解，再加入1ml的diea，继续振摇反应20分钟至羧基完全活化，再将溶液加入到固相反应管中，氮气鼓泡反应2.5h，抽干反应液，分别用3ml无水二氯甲烷淋洗两次，2ml无水dmf淋洗一次，每次淋洗后都抽干溶剂；

15)重复步骤4)、步骤2)和步骤4)的操作，分别对步骤14)的反应液进行同样的盖帽、脱保护、盖帽反应；获得中间体(pa2-a)；

为了验证合成产物，进行与步骤4)相应过程相同。

16)将步骤15)的中间体，连有目标聚酰胺(pa2)的树脂从固相反应管中取出，放入反应瓶中，加入20ml的dp，油浴中55℃过夜反应，停止反应，过滤，收集滤液，真空下除去dp后，得到手性羟基保护的发夹聚酰胺(pa2)的中间体(pa2-b)；

17)在氮气保护下，向步骤16)的中间体加入3ml脱保护试剂重量配比为91：3：3：3的tfa/tms/tis/h2o混合液，室温反应1h脱去羟基上的叔丁基保护，真空下移除溶剂，二氯甲烷溶解产物，用5mol/l的盐酸调至酸性，有固体析出，过滤得到淡白色的目标产物，含手性(s)-β-羟基-γ-氨基酸修饰的发夹聚酰胺(pa2)。收率13.6％，hplc98.1％，¹h-nmr(400mhz，dmso-d6):10.23(s，1h，芳香nh)，10.01(s，1h，芳香nh)，9.90-9.98(br，2h，芳香nh)，9.75(s，1h，芳香nh)，9.86(br，2h，芳香nh)，8.15-7.89(m，3h，脂肪nh)，7.63-7.41(m，2h，脂肪nh)，7.39-7.35(br，2h，芳香ch)，7.30(s，1h，芳香ch)，7.27(s，1h，芳香ch)，7.16(s，1h，芳香ch)，7.13(m，2h，芳香ch)，7.10(m，2h，芳香ch)，5.52(br，1h，oh)，3.99(m，1h，hoch)，3.91(s，6h，2×nch3)，3.87(s，3h，nch3)，3.83(s，6h，2×nch3)，3.80(s，3h，nch3)，3.76(s，6h，2×nch3)，3.72(s，3h，nch3)，3.64(m，2h，nhch2)，3.50(m，2h，nhch2)，3.46-3.40(m，2h，nhch2)，3.34-3.20(m，4h，2×nhch2)，2.46(d，³jh，h＝7.2hz，2h，coch2)，2.36(t，³jh，h＝6.8hz，2h，coch2)，2.28-2.23(t，³jh，h＝6.8hz，2h，coch2)，2.01(s，6h，n(ch3)2)，1.95(s，1h，coch3)，1.79(m，2h，chch2ch2)，1.53(m，2h，ch2ch2ch2)。esi-mass:m/zcalcdforc57h75n22o12[m+h]⁺:1259.59；found:1259.62[m+h]⁺。

实施例3：化合物pa3的制备

合成步骤类似合成pa1(图3a)。步骤如下：

1)活化：与制备pa1第一步1)活化操作相同。称取图3b如式(12)所示的fmoc保护β-丙氨酸-clear树脂(sps-1，1.00g，0.4mmol，peptidesinternational)加入到固相反应装置的固相反应管中，通氮气保护，再加入5ml的dmf，使氮气充分鼓泡30min进行活化树脂；

2)脱保护：先配制3ml的20％(v/v)哌啶/dmf(哌啶、dmf均为处理过的无水溶剂)，在氮气保护下加入到步骤1)的固相反应管，充分鼓泡反应15min，脱除β-丙氨酸上的氨基保护基团，抽去反应管中的溶剂，用3ml无水二氯甲烷淋洗两次，2ml无水dmf淋洗一次，每次淋洗后都抽干溶剂；

3)偶合：称取图3b中如式(2)所示的单体(1.6mmol)和hbtu(576.5mg，1.52mmol)加入另一支无水反应瓶，加入5ml无水dmf，振摇至化合物完全溶解，再加入1ml的diea，继续振摇反应20分钟至羧基完全活化，再将溶液加入到固相反应管中，氮气鼓泡反应2.5h，抽干反应液，分别用3ml无水二氯甲烷淋洗两次，2ml无水dmf淋洗一次，每次淋洗后都抽干溶剂；

4)盖帽：配制5ml的5％乙酸酐+5％吡啶/dmf溶液，氮气保护下加入到固相反应管中进行盖帽15min，抽干反应液，分别用3ml无水二氯甲烷淋洗两次，2ml无水dmf淋洗一次，每次淋洗后都抽干溶剂。

这一步为了验证合成产物，从固相反应管中取固体树脂(5mg)加入到5ml的反应瓶中，加入500μl的dp，反应液于55℃反应过夜，切除树脂载体上的产物，用0.45μm的一次性过滤器过滤，取25μl的样品液进行hplc分析(254nm，0.1％tfa水溶液和乙腈为流动相，梯度洗脱，乙腈从0％到100％，流速1.0ml/min)。

5)重复步骤2)，进行脱保护；

6)偶合：称取图3b中如式(7)所示的单体(1.6mmol)和hbtu(576.5mg，1.52mmol)加入反应瓶中，加入5ml等量无水dmf，振摇至化合物完全溶解，再分别加入1ml的diea，继续振摇反应20分钟至羧基完全活化。再将溶液加入到固相反应管中，氮气鼓泡反应2.5h，抽干反应液，分别用3ml无水二氯甲烷淋洗两次，2ml无水dmf淋洗一次，每次淋洗后都抽干溶剂；

7)重复步骤4)、步骤2)，对步骤6)中的反应物进行盖帽和脱保护反应；

为了验证合成产物，进行完步骤4)后，从该固相反应管中分别取固体树脂(5mg)加入5ml的反应瓶中，加入500μl的dp，反应液于55℃反应过夜，切除树脂载体上的产物，用0.45μm的一次性过滤器过滤，取25μl的样品液金星hplc分析(254nm，0.1％tfa水溶液和乙腈为流动相，梯度洗脱，乙腈从0％到100％，流速1.0ml/min)。

8)偶合：称取图3b中如式(10)所示的二聚体(1.6mmol)和hbtu(576.5mg，1.52mmol)加入无水反应瓶，分别加入5ml无水dmf，振摇至化合物完全溶解，再分别加入1ml的diea，继续振摇反应20分钟至羧基完全活化，再将溶液分别加入固相反应管中，氮气鼓泡反应2.5h，抽干反应液，分别用3ml无水二氯甲烷淋洗两次，2ml无水dmf淋洗一次，每次淋洗后都抽干溶剂；

9)重复步骤4)、步骤2)，对固相反应管中的反应物进行盖帽和脱保护反应；

为了验证合成产物，进行与步骤4)相应过程相同。

10)偶合：称取图3b中如式(5)所示的单体(1.6mmol)和hbtu(576.5mg，1.52mmol)加入无水反应瓶，加入5ml无水dmf，振摇至化合物完全溶解，再加入1ml的diea，继续振摇反应20分钟至羧基完全活化，再将溶液分别加入固相反应管中，氮气鼓泡反应2.5h，抽干反应液，分别用3ml无水二氯甲烷淋洗两次，2ml无水dmf淋洗一次，每次淋洗后都抽干溶剂；

11)重复步骤4)、步骤2)，对步骤10)的反应物进行盖帽和脱保护反应；

为了验证合成产物，进行与步骤4)相应过程相同。

12)偶合：称取图3b中如式(10)所示的二聚体(1.6mmol)和hbtu(576.5mg，1.52mmol)加入无水反应瓶，加入5ml无水dmf，振摇至化合物完全溶解，再加入1ml的diea，继续振摇反应20分钟至羧基完全活化，再将溶液分别加入固相反应管中，氮气鼓泡反应2.5h，抽干反应液，用3ml无水二氯甲烷淋洗两次，2ml无水dmf淋洗一次，每次淋洗后都抽干溶剂；

13)重复步骤4)、步骤2)的操作，对步骤12)中的相反应管中的反应物进行盖帽和脱保护反应；

为了验证合成产物，进行与步骤4)相应过程相同。

14)偶合：称取图3b中如式(4)所示的单体(1.6mmol)和hbtu(576.5mg，1.52mmol)加入到无水反应瓶中，加入5ml等量无水dmf，振摇至化合物完全溶解，再加入1ml的diea，继续振摇反应20分钟至羧基完全活化，再将溶液加入到固相反应管中，氮气鼓泡反应2.5h，抽干反应液，分别用3ml无水二氯甲烷淋洗两次，2ml无水dmf淋洗一次，每次淋洗后都抽干溶剂；

15)重复步骤4)、步骤2)，对固相反应管中的反应物进行盖帽和脱保护反应；

为了验证合成产物，进行与步骤4)相应过程相同。

16)偶合：称取图3b中如式(3)所示的单体(1.6mmol)和hbtu(576.5mg，1.52mmol)加入到无水反应瓶中，加入5ml等量无水dmf，振摇至化合物完全溶解，再加入1ml的diea，继续振摇反应20分钟至羧基完全活化，再将溶液加入到固相反应管中，氮气鼓泡反应2.5h，抽干反应液，分别用3ml无水二氯甲烷淋洗两次，2ml无水dmf淋洗一次，每次淋洗后都抽干溶剂；

17)重复步骤4)、步骤2)和步骤4)的操作，分别对步骤16)的反应液进行同样的盖帽、脱保护、盖帽反应；获得中间体(pa3-a)；

为了验证合成产物，进行与步骤4)相应过程相同。

18)将步骤17)的中间体，连有目标聚酰胺(pa3)的树脂从固相反应管中取出，放入反应瓶中，加入20ml的dp，油浴中55℃过夜反应，停止反应，过滤，收集滤液，真空下除去dp后，得到手性羟基保护的发夹聚酰胺(pa3)的中间体(pa3-b)；

19)在氮气保护下，向步骤18)的中间体加入3ml脱保护试剂重量配比为91：3：3：3的tfa/tms/tis/h2o混合液，室温反应1h脱去羟基上的叔丁基保护，真空下移除溶剂，二氯甲烷溶解产物，用5mol/l的盐酸调至酸性，有固体析出，过滤得到淡白色的目标产物，含手性(s)-β-羟基-γ-氨基酸修饰的发夹聚酰胺(pa3)。收率16.1％，hplc98.3％，¹h-nmr(400mhz，dmso-d6):10.40(s，1h，芳香nh)，10.37(s，1h，芳香nh)，10.12(s，2h，芳香nh)，9.80(s，1h，芳香nh)，9.69(br，2h，芳香nh)，8.08-7.45(m，3h，脂肪nh)，7.81-7.70(m，2h，脂肪nh)，7.66(s，1h，芳香ch)，7.52(s，1h，芳香ch)，7.57(s，1h，芳香ch)，7.49(s，1h，芳香ch)，7.41(m，2h，芳香ch)，7.36(s，1h，芳香ch)，7.26(m，2h，芳香ch)，5.52(br，1h，oh)，3.97(m，1h，hoch)，3.93(s，6h，2×nch3)，3.91(s，3h，nch3)，3.87(s，6h，2×nch3)，3.82(s，3h，nch3)，3.63(m，2h，nhch2)，3.50(m，2h，nhch2)，3.48-3.40(m，2h，nhch2)，3.31-3.25(m，4h，2×nhch2)，2.69(m，2h，nme2ch2)，2.45(d，³jh，h＝7.2hz，2h，coch2)，2.36(t，³jh，h＝6.8hz，2h，coch2)，2.26-2.20(m，4h，2×coch2)，2.01(s，6h，n(ch3)2)，1.94(s，1h，coch3)，1.76(m，2h，chch2ch2)，1.50(m，2h，ch2ch2ch2)。esi-mass:m/zcalcdforc54h74n21o12[m+h]⁺:1208.58；found:1208.53[m+h]⁺。

实施例4：化合物pa4的制备

合成步骤类似合成pa1(图3a)。步骤如下：

1)活化：与制备pa1第一步1)活化操作相同。称取图3b如式(12)所示的fmoc保护β-丙氨酸-clear树脂(sps-1，1.00g，0.4mmol，peptidesinternational)加入到固相反应装置的固相反应管中，通氮气保护，再加入5ml的dmf，使氮气充分鼓泡30min进行活化树脂；

2)脱保护：先配制3ml的20％(v/v)哌啶/dmf(哌啶、dmf均为处理过的无水溶剂)，在氮气保护下加入到步骤1)的固相反应管，充分鼓泡反应15min，脱除β-丙氨酸上的氨基保护基团，抽去反应管中的溶剂，用3ml无水二氯甲烷淋洗两次，2ml无水dmf淋洗一次，每次淋洗后都抽干溶剂；

3)偶合：称取图3b中如式(7)所示的单体(1.6mmol)和hbtu(576.5mg，1.52mmol)加入另一支无水反应瓶，加入5ml无水dmf，振摇至化合物完全溶解，再加入1ml的diea，继续振摇反应20分钟至羧基完全活化，再将溶液加入到固相反应管中，氮气鼓泡反应2.5h，抽干反应液，分别用3ml无水二氯甲烷淋洗两次，2ml无水dmf淋洗一次，每次淋洗后都抽干溶剂；

4)盖帽：配制5ml的5％乙酸酐+5％吡啶/dmf溶液，氮气保护下加入到固相反应管中进行盖帽15min，抽干反应液，分别用3ml无水二氯甲烷淋洗两次，2ml无水dmf淋洗一次，每次淋洗后都抽干溶剂。

这一步为了验证合成产物，从固相反应管中取固体树脂(5mg)加入到5ml的反应瓶中，加入500μl的dp，反应液于55℃反应过夜，切除树脂载体上的产物，用0.45μm的一次性过滤器过滤，取25μl的样品液进行hplc分析(254nm，0.1％tfa水溶液和乙腈为流动相，梯度洗脱，乙腈从0％到100％，流速1.0ml/min)。

5)重复步骤2)，进行脱保护；

6)偶合：称取图3b中如式(10)所示的二聚体(1.6mmol)和hbtu(576.5mg，1.52mmol)加入反应瓶中，加入5ml等量无水dmf，振摇至化合物完全溶解，再分别加入1ml的diea，继续振摇反应20分钟至羧基完全活化。再将溶液加入到固相反应管中，氮气鼓泡反应2.5h，抽干反应液，分别用3ml无水二氯甲烷淋洗两次，2ml无水dmf淋洗一次，每次淋洗后都抽干溶剂；

7)重复步骤4)、步骤2)，对步骤6)中的反应物进行盖帽和脱保护反应；

为了验证合成产物，进行完步骤4)后，从该固相反应管中分别取固体树脂(5mg)加入5ml的反应瓶中，加入500μl的dp，反应液于55℃反应过夜，切除树脂载体上的产物，用0.45μm的一次性过滤器过滤，取25μl的样品液金星hplc分析(254nm，0.1％tfa水溶液和乙腈为流动相，梯度洗脱，乙腈从0％到100％，流速1.0ml/min)。

8)偶合：称取图3b中如式(5)所示的单体(1.6mmol)和hbtu(576.5mg，1.52mmol)加入无水反应瓶，分别加入5ml无水dmf，振摇至化合物完全溶解，再分别加入1ml的diea，继续振摇反应20分钟至羧基完全活化，再将溶液分别加入固相反应管中，氮气鼓泡反应2.5h，抽干反应液，分别用3ml无水二氯甲烷淋洗两次，2ml无水dmf淋洗一次，每次淋洗后都抽干溶剂；

9)重复步骤4)、步骤2)，对固相反应管中的反应物进行盖帽和脱保护反应；

为了验证合成产物，进行与步骤4)相应过程相同。

10)偶合：称取图3b中如式(10)所示的二聚体(1.6mmol)和hbtu(576.5mg，1.52mmol)加入无水反应瓶，加入5ml无水dmf，振摇至化合物完全溶解，再加入1ml的diea，继续振摇反应20分钟至羧基完全活化，再将溶液分别加入固相反应管中，氮气鼓泡反应2.5h，抽干反应液，分别用3ml无水二氯甲烷淋洗两次，2ml无水dmf淋洗一次，每次淋洗后都抽干溶剂；

11)重复步骤4)、步骤2)，对步骤10)的反应物进行盖帽和脱保护反应；

为了验证合成产物，进行与步骤4)相应过程相同。

12)偶合：称取图3b中如式(10)所示的二聚体(1.6mmol)和hbtu(576.5mg，1.52mmol)加入无水反应瓶，加入5ml无水dmf，振摇至化合物完全溶解，再加入1ml的diea，继续振摇反应20分钟至羧基完全活化，再将溶液分别加入固相反应管中，氮气鼓泡反应2.5h，抽干反应液，用3ml无水二氯甲烷淋洗两次，2ml无水dmf淋洗一次，每次淋洗后都抽干溶剂；

13)重复步骤4)、步骤2)和步骤4)的操作，分别对步骤14)的反应液进行同样的盖帽、脱保护、盖帽反应；获得中间体(pa4-a)；

为了验证合成产物，进行与步骤4)相应过程相同。

14)将步骤13)的中间体，连有目标聚酰胺(pa4)的树脂从固相反应管中取出，放入反应瓶中，加入20ml的dp，油浴中55℃过夜反应，停止反应，过滤，收集滤液，真空下除去dp后，得到手性羟基保护的发夹聚酰胺(pa4)的中间体(pa4-b)；

15)在氮气保护下，向步骤14)的中间体加入3ml脱保护试剂重量配比为91：3：3：3的tfa/tms/tis/h2o混合液，室温反应1h脱去羟基上的叔丁基保护，真空下移除溶剂，二氯甲烷溶解产物，用5mol/l的盐酸调至酸性，有固体析出，过滤得到淡白色的目标产物，含手性(s)-β-羟基-γ-氨基酸修饰的发夹聚酰胺(pa4)。收率11.4％，hplc98.3％，¹h-nmr(400mhz，dmso-d6):10.20(s，1h，芳香nh)，10.00(s，1h，芳香nh)，9.92-9.99(br，2h，芳香nh)，9.76(s，1h，芳香nh)，9.87(br，2h，芳香nh)，8.17-7.89(m，3h，脂肪nh)，7.65-7.42(m，2h，脂肪nh)，7.39-7.33(br，2h，芳香ch)，7.35(s，1h，芳香ch)，7.28(s，1h，芳香ch)，7.16(s，1h，芳香ch)，7.11(m，2h，芳香ch)，7.06(m，2h，芳香ch)，5.51(br，1h，oh)，3.98(m，1h，hoch)，3.90(s，6h，2×nch3)，3.86(s，3h，nch3)，3.82(s，6h，2×nch3)，3.79(s，3h，nch3)，3.76(s，6h，2×nch3)，3.71(s，3h，nch3)，3.66(m，2h，nhch2)，3.51(m，2h，nhch2)，3.44-3.38(m，2h，nhch2)，3.32-3.22(m，4h，2×nhch2)，2.44(d，³jh，h＝7.2hz，2h，coch2)，2.34(t，³jh，h＝6.8hz，2h，coch2)，2.27-2.21(t，³jh，h＝6.8hz，2h，coch2)，2.00(s，6h，n(ch3)2)，1.96(s，1h，coch3)，1.79(m，2h，chch2ch2)，1.52(m，2h，ch2ch2ch2)。esi-mass:m/zcalcdforc57h75n22o12[m+h]⁺:1259.59；found:1259.55[m+h]⁺。

实施例5：化合物pa5的制备

合成步骤类似合成pa1(图3a)。步骤如下：

1)活化：与制备pa1第一步1)活化操作相同。称取图3b如式(12)所示的fmoc保护β-丙氨酸-clear树脂(sps-1，1.00g，0.4mmol，peptidesinternational)加入到固相反应装置的固相反应管中，通氮气保护，再加入5ml的dmf，使氮气充分鼓泡30min进行活化树脂；

2)脱保护：先配制3ml的20％(v/v)哌啶/dmf(哌啶、dmf均为处理过的无水溶剂)，在氮气保护下加入到步骤1)的固相反应管，充分鼓泡反应15min，脱除β-丙氨酸上的氨基保护基团，抽去反应管中的溶剂，用3ml无水二氯甲烷淋洗两次，2ml无水dmf淋洗一次，每次淋洗后都抽干溶剂；

3)偶合：称取图3b中如式(8)所示的二聚体(1.6mmol)和hbtu(576.5mg，1.52mmol)加入另一支无水反应瓶，加入5ml无水dmf，振摇至化合物完全溶解，再加入1ml的diea，继续振摇反应20分钟至羧基完全活化，再将溶液加入到固相反应管中，氮气鼓泡反应2.5h，抽干反应液，分别用3ml无水二氯甲烷淋洗两次，2ml无水dmf淋洗一次，每次淋洗后都抽干溶剂；

4)盖帽：配制5ml的5％乙酸酐+5％吡啶/dmf溶液，氮气保护下加入到固相反应管中进行盖帽15min，抽干反应液，分别用3ml无水二氯甲烷淋洗两次，2ml无水dmf淋洗一次，每次淋洗后都抽干溶剂。

这一步为了验证合成产物，从固相反应管中取固体树脂(5mg)加入到5ml的反应瓶中，加入500μl的dp，反应液于55℃反应过夜，切除树脂载体上的产物，用0.45μm的一次性过滤器过滤，取25μl的样品液进行hplc分析(254nm，0.1％tfa水溶液和乙腈为流动相，梯度洗脱，乙腈从0％到100％，流速1.0ml/min)。

5)重复步骤2)，进行脱保护；

6)偶合：称取图3b中如式(8)所示的二聚体(1.6mmol)和hbtu(576.5mg，1.52mmol)加入反应瓶中，加入5ml等量无水dmf，振摇至化合物完全溶解，再分别加入1ml的diea，继续振摇反应20分钟至羧基完全活化。再将溶液加入到固相反应管中，氮气鼓泡反应2.5h，抽干反应液，分别用3ml无水二氯甲烷淋洗两次，2ml无水dmf淋洗一次，每次淋洗后都抽干溶剂；

7)重复步骤4)、步骤2)，对步骤6)中的反应物进行盖帽和脱保护反应；

为了验证合成产物，进行完步骤4)后，从该固相反应管中分别取固体树脂(5mg)加入5ml的反应瓶中，加入500μl的dp，反应液于55℃反应过夜，切除树脂载体上的产物，用0.45μm的一次性过滤器过滤，取25μl的样品液金星hplc分析(254nm，0.1％tfa水溶液和乙腈为流动相，梯度洗脱，乙腈从0％到100％，流速1.0ml/min)。

8)偶合：称取图3b中如式(7)所示的单体(1.6mmol)和hbtu(576.5mg，1.52mmol)加入无水反应瓶，分别加入5ml无水dmf，振摇至化合物完全溶解，再分别加入1ml的diea，继续振摇反应20分钟至羧基完全活化，再将溶液分别加入固相反应管中，氮气鼓泡反应2.5h，抽干反应液，分别用3ml无水二氯甲烷淋洗两次，2ml无水dmf淋洗一次，每次淋洗后都抽干溶剂；

9)重复步骤4)、步骤2)，对固相反应管中的反应物进行盖帽和脱保护反应。

为了验证合成产物，进行与步骤4)相应过程相同。

10)重复步骤3)、步骤4)、步骤2)，对固相反应管中的反应物进行偶合、盖帽和脱保护反应。

为了验证合成产物，进行与步骤4)相应过程相同。

11)偶合：称取图3b中如式(2)所示的单体(1.6mmol)和hbtu(576.5mg，1.52mmol)加入无水反应瓶，加入5ml无水dmf，振摇至化合物完全溶解，再加入1ml的diea，继续振摇反应20分钟至羧基完全活化，再将溶液分别加入固相反应管中，氮气鼓泡反应2.5h，抽干反应液，用3ml无水二氯甲烷淋洗两次，2ml无水dmf淋洗一次，每次淋洗后都抽干溶剂；

12)重复步骤4)、步骤2)的操作，对步骤11)中的相反应管中的反应物进行盖帽和脱保护反应；

为了验证合成产物，进行与步骤4)相应过程相同。

13)偶合：称取图3b中如式(6)所示的单体(1.6mmol)和hbtu(576.5mg，1.52mmol)加入到无水反应瓶中，加入5ml等量无水dmf，振摇至化合物完全溶解，再加入1ml的diea，继续振摇反应20分钟至羧基完全活化，再将溶液加入到固相反应管中，氮气鼓泡反应2.5h，抽干反应液，分别用3ml无水二氯甲烷淋洗两次，2ml无水dmf淋洗一次，每次淋洗后都抽干溶剂；

14)重复步骤4)、步骤2)的操作，对步骤13)中的相反应管中的反应物进行盖帽和脱保护反应；

为了验证合成产物，进行与步骤4)相应过程相同。

15)偶合：称取图3b中如式(11)所示的二聚体(1.6mmol)和hbtu(576.5mg，1.52mmol)加入无水反应瓶，加入5ml无水dmf，振摇至化合物完全溶解，再加入1ml的diea，继续振摇反应20分钟至羧基完全活化，再将溶液分别加入固相反应管中，氮气鼓泡反应2.5h，抽干反应液，用3ml无水二氯甲烷淋洗两次，2ml无水dmf淋洗一次，每次淋洗后都抽干溶剂；

16)重复步骤4)、步骤2)的操作，对步骤15)中的相反应管中的反应物进行盖帽和脱保护反应；

为了验证合成产物，进行与步骤4)相应过程相同。

17)偶合：称取图3b中如式(2)所示的单体(1.6mmol)和hbtu(576.5mg，1.52mmol)加入到无水反应瓶中，加入5ml等量无水dmf，振摇至化合物完全溶解，再加入1ml的diea，继续振摇反应20分钟至羧基完全活化，再将溶液加入到固相反应管中，氮气鼓泡反应2.5h，抽干反应液，分别用3ml无水二氯甲烷淋洗两次，2ml无水dmf淋洗一次，每次淋洗后都抽干溶剂；

18)重复步骤4)、步骤2)的操作，对步骤17)中的相反应管中的反应物进行盖帽和脱保护反应；

为了验证合成产物，进行与步骤4)相应过程相同。

19)偶合：称取图3b中如式(4)所示的单体(1.6mmol)(1.6mmol)和hbtu(576.5mg，1.52mmol)加入到无水反应瓶中，加入5ml等量无水dmf，振摇至化合物完全溶解，再加入1ml的diea，继续振摇反应20分钟至羧基完全活化，再将溶液加入到固相反应管中，氮气鼓泡反应2.5h，抽干反应液，分别用3ml无水二氯甲烷淋洗两次，2ml无水dmf淋洗一次，每次淋洗后都抽干溶剂；

20)重复步骤4)、步骤2)的操作，对步骤19)中的相反应管中的反应物进行盖帽和脱保护反应；

为了验证合成产物，进行与步骤4)相应过程相同。

21)重复步骤15)、步骤4)、步骤2)的操作，对步骤20)中的相反应管中的反应物进行偶合、盖帽和脱保护反应；

为了验证合成产物，进行与步骤4)相应过程相同。

22)重复步骤15)、步骤4)、步骤2)和步骤4)的操作，分别对步骤21)的反应液进行同样的偶合、盖帽、脱保护、盖帽反应；获得中间体(pa5-a)；

为了验证合成产物，进行与步骤4)相应过程相同。

23)将步骤22)的中间体(pa5-a)，连有目标聚酰胺的树脂从固相反应管中取出，放入反应瓶中，加入20ml的dp，油浴中55℃过夜反应，停止反应，过滤，收集滤液，真空下除去dp，得到手性羟基和氨基保护的发夹聚酰胺(pa5)的中间体(pa5-b)；

24)在氮气保护下，向步骤23)的中间体加入3ml脱保护试剂重量配比为91：3：3：3的tfa/tms/tis/h2o混合液，室温反应1h脱去羟基上的叔丁基和氨基上的叔丁氧羰基保护，真空下移除溶剂；二氯甲烷溶解产物，用5mol/l的盐酸调至酸性，有固体析出，过滤得到淡白色的目标产物，含手性(s)-β-羟基-γ-氨基酸修饰的发夹聚酰胺(pa5)。收率10.9％，hplc97.3％。¹h-nmr(400mhz，dmso-d6):δ10.35(s，1h，芳香nh)，10.31(s，1h，芳香nh)，10.27(s，2h，芳香nh)，10.22(s，1h，芳香nh)，10.16(s，2h，芳香nh)，9.98(s，1h，芳香nh)，9.94(s，2h，芳香nh)，9.88(s，1h，芳香nh)，9.80(s，2h，芳香nh)，9.86(s，1h，芳香nh)，8.23-7.87(m，3h，脂肪nh)，7.82-7.75(m，2h，脂肪nh)，7.66(s，1h，芳香ch)，7.59(s，1h，芳香ch)，7.52(m，2h，芳香ch)，7.47(s，1h，芳香ch)，7.40-7.34(m，2h，芳香ch)，7.30(s，2h，芳香ch)，7.26-7.21(m，3h，芳香ch)，7.17-7.00(m，4h，芳香ch)，6.94-6.90(m，2h，芳香ch)，6.86-6.80(m，4h，芳香ch)，5.50(br，1h，oh)，3.95(m，1h，hoch)，3.91(s，3h，nch3)，3.89(s，3h，nch3)，3.87(s，6h，2×nch3)，3.84(s，3h，nch3)，3.79(s，6h，2×nch3)，3.76(s，6h，2×nch3)，3.72(s，3h，nch3)，3.68(s，6h，2×nch3)，3.64(s，6h，2×nch3)，3.60(m，2h，nhch2)，3.54(m，2h，nhch2)，3.48-3.40(m，3h，nhch2+ch2ch2chnh3)，3.34-3.20(m，4h，2×nhch2)，2.63(m，2h，nme2ch2)，2.45(d，³jh，h＝7.4hz，2h，coch2)，2.35(t，³jh，h＝7.2hz，2h，coch2)，2.29-2.23(m，2h，coch2)，2.01(s，6h，n(ch3)2)，1.96(s，1h，coch3)，1.77(m，2h，chch2ch2)，1.53(m，2h，ch2ch2ch2)。esi-mass:m/zcalcdforc98h120n42o20[m+2h]²⁺:2204.97；found:1102.47[m+2h]²⁺.

实施例6：化合物pa6的制备

合成步骤类似合成pa1(图3a)。步骤如下：

1)活化：与制备pa1第一步1)活化操作相同。称取图3b如式(12)所示的fmoc保护β-丙氨酸-clear树脂(sps-1，1.00g，0.4mmol，peptidesinternational)加入到固相反应装置的固相反应管中，通氮气保护，再加入5ml的dmf，使氮气充分鼓泡30min进行活化树脂；

2)脱保护：先配制3ml的20％(v/v)哌啶/dmf(哌啶、dmf均为处理过的无水溶剂)，在氮气保护下加入到步骤1)的固相反应管，充分鼓泡反应15min，脱除β-丙氨酸上的氨基保护基团，抽去反应管中的溶剂，用3ml无水二氯甲烷淋洗两次，2ml无水dmf淋洗一次，每次淋洗后都抽干溶剂；

3)偶合：称取图3b中如式(8)所示的二聚体(1.6mmol)和hbtu(576.5mg，1.52mmol)加入另一支无水反应瓶，加入5ml无水dmf，振摇至化合物完全溶解，再加入1ml的diea，继续振摇反应20分钟至羧基完全活化，再将溶液加入到固相反应管中，氮气鼓泡反应2.5h，抽干反应液，分别用3ml无水二氯甲烷淋洗两次，2ml无水dmf淋洗一次，每次淋洗后都抽干溶剂；

4)盖帽：配制5ml的5％乙酸酐+5％吡啶/dmf溶液，氮气保护下加入到固相反应管中进行盖帽15min，抽干反应液，分别用3ml无水二氯甲烷淋洗两次，2ml无水dmf淋洗一次，每次淋洗后都抽干溶剂。

这一步为了验证合成产物，从固相反应管中取固体树脂(5mg)加入到5ml的反应瓶中，加入500μl的dp，反应液于55℃反应过夜，切除树脂载体上的产物，用0.45μm的一次性过滤器过滤，取25μl的样品液进行hplc分析(254nm，0.1％tfa水溶液和乙腈为流动相，梯度洗脱，乙腈从0％到100％，流速1.0ml/min)。

5)重复步骤2)，进行脱保护；

6)偶合：称取图3b中如式(2)所示的单体(1.6mmol)和hbtu(576.5mg，1.52mmol)加入反应瓶中，加入5ml等量无水dmf，振摇至化合物完全溶解，再分别加入1ml的diea，继续振摇反应20分钟至羧基完全活化。再将溶液加入到固相反应管中，氮气鼓泡反应2.5h，抽干反应液，分别用3ml无水二氯甲烷淋洗两次，2ml无水dmf淋洗一次，每次淋洗后都抽干溶剂；

7)重复步骤4)、步骤2)，对步骤6)中的反应物进行盖帽和脱保护反应；

为了验证合成产物，进行完步骤4)后，从该固相反应管中分别取固体树脂(5mg)加入5ml的反应瓶中，加入500μl的dp，反应液于55℃反应过夜，切除树脂载体上的产物，用0.45μm的一次性过滤器过滤，取25μl的样品液金星hplc分析(254nm，0.1％tfa水溶液和乙腈为流动相，梯度洗脱，乙腈从0％到100％，流速1.0ml/min)。

8)偶合：称取图3b中如式(6)所示的单体(1.6mmol)和hbtu(576.5mg，1.52mmol)加入无水反应瓶，分别加入5ml无水dmf，振摇至化合物完全溶解，再分别加入1ml的diea，继续振摇反应20分钟至羧基完全活化，再将溶液分别加入固相反应管中，氮气鼓泡反应2.5h，抽干反应液，分别用3ml无水二氯甲烷淋洗两次，2ml无水dmf淋洗一次，每次淋洗后都抽干溶剂；

9)重复步骤4)、步骤2)，对固相反应管中的反应物进行盖帽和脱保护反应。

为了验证合成产物，进行与步骤4)相应过程相同。

10)偶合：称取图3b中如式(11)所示的单体(1.6mmol)和hbtu(576.5mg，1.52mmol)加入无水反应瓶，加入5ml无水dmf，振摇至化合物完全溶解，再加入1ml的diea，继续振摇反应20分钟至羧基完全活化，再将溶液分别加入固相反应管中，氮气鼓泡反应2.5h，抽干反应液，用3ml无水二氯甲烷淋洗两次，2ml无水dmf淋洗一次，每次淋洗后都抽干溶剂；

11)重复步骤4)、步骤2)的操作，对步骤10)中的相反应管中的反应物进行盖帽和脱保护反应；

为了验证合成产物，进行与步骤4)相应过程相同。

12)偶合：称取图3b中如式(3)所示的单体(1.6mmol)和hbtu(576.5mg，1.52mmol)加入到无水反应瓶中，加入5ml等量无水dmf，振摇至化合物完全溶解，再加入1ml的diea，继续振摇反应20分钟至羧基完全活化，再将溶液加入到固相反应管中，氮气鼓泡反应2.5h，抽干反应液，分别用3ml无水二氯甲烷淋洗两次，2ml无水dmf淋洗一次，每次淋洗后都抽干溶剂；

13)依次重复步骤4)、步骤2)和步骤4)的操作，分别对步骤12)的反应液进行同样的盖帽、脱保护、盖帽反应；获得中间体(pa6-a)。

为了验证合成产物，进行与步骤4)相应过程相同。

14)向步骤13)所获得的中间体，连有目标聚酰胺的树脂中加入脱保护试剂重量配比为10：90的tfa/ch2cl2混合液后，室温氮气鼓泡反应0.5h，抽干反应液，分别无水二氯甲烷、无水dmf淋洗，每次淋洗后都抽干溶剂，获得脱去氨基上的叔丁氧羰基的发夹聚酰胺(pa6)的中间体(pa6-b)；

15)重复步骤10)、步骤4)、步骤2)的操作，对步骤14)中的相反应管中的反应物进行偶合、盖帽和脱保护反应；

为了验证合成产物，进行与步骤4)相应过程相同。

16)偶合：称取图3b中如式(1)所示的单体(1.6mmol)和hbtu(576.5mg，1.52mmol)加入到无水反应瓶中，加入5ml等量无水dmf，振摇至化合物完全溶解，再加入1ml的diea，继续振摇反应20分钟至羧基完全活化，再将溶液加入到固相反应管中，氮气鼓泡反应2.5h，抽干反应液，分别用3ml无水二氯甲烷淋洗两次，2ml无水dmf淋洗一次，每次淋洗后都抽干溶剂；

17)重复步骤4)，对步骤16)的反应液进行同样的盖帽反应；获得发夹聚酰胺(pa6)中间体的树脂(pa6-c)。

为了验证合成产物，进行与步骤4)相应过程相同。

18)将步骤17)的中间体，连有目标聚酰胺(pa6)的树脂从固相反应管中取出，放入反应瓶中，加入20ml的dp，油浴中55℃过夜反应，停止反应，过滤，收集滤液，真空下除去dp后，得到手性羟基保护的发夹聚酰胺(pa6)的中间体(pa6-d)；

19)在氮气保护下，用二氯甲烷溶解步骤18)产物，用5mol/l的盐酸调至酸性，有固体析出，过滤得到白色的目标产物(pa6)。收率12.8％，hplc98.6％，¹h-nmr(400mhz，dmso-d6):δ10.56(s，1h，芳香nh)，10.47(s，1h，芳香nh)，10.35(s，1h，芳香nh)，10.23(s，2h，芳香nh)，9.14(s，1h，芳香nh)，9.90(s，1h，芳香nh)，9.76(brs，1h，芳香nh)，8.44-8.31(m，1h，脂肪nh)，7.88-7.76(m，3h，脂肪nh)，7.63(s，1h，芳香ch)，7.57(s，1h，芳香ch)，7.52(s，1h，芳香ch)，7.46(m，2h，芳香ch)，7.40(s，1h，芳香ch)，7.34(m，1h，芳香ch)，7.27(s，1h，芳香ch)，7.14-7.10(m，3h，芳香ch)，6.98-6.96(m，2h，芳香ch)，3.92(s，6h，2×nch3)，3.89(s，3h，nch3)，3.86(s，6h，2×nch3)，3.80(s，3h，nch3)，3.75(s，3h，nch3)，3.70(s，3h，2×nch3)，3.61(m，2h，nhch2)，3.56(m，2h，nhch2)，3.38-3.26(m，3h，nhch2+ch2ch2chnh3)，2.62(m，2h，nme2ch2)，2.31(t，³jh，h＝6.8hz，2h，coch2)，2.01(s，6h，n(ch3)2)，1.99(s，1h，coch3)，1.79(m，2h，chch2ch2)，1.47(m，2h，ch2ch2ch2)。esi-mass:m/zcalcdforc62h77n28o12[m+h]⁺:1405.63；found:1405.58[m+h]⁺.

实施例7:聚酰胺对c-myc基因高表达的肿瘤细胞的生长抑制

用rtca技术考查六种聚酰胺对c-myc基因高表达的a549和sgc7901两种肿瘤细胞的细胞毒性，以筛选出几种对肿瘤细胞毒性强的聚酰胺，获得较低ic50值(使细胞50％致死的药物浓度)的预选药物分子。

实验材料与方法(一)

材料：

a.化合物：发夹结构如pa1～pa6的吡咯-咪唑聚酰胺类化合物

b.细胞株：a549(人肺腺癌细胞)，sgc-7901(胃低分化腺癌细胞)。

c.培养基组成：rpmi1640培养基(invitrogengibco，美国)，小牛血清(invitrogengibco，美国)，青霉素-链霉素双抗(invitrogengibco，美国)，l-谷氨酰胺(invitrogengibco，美国)，肝素(invitrogengibco，美国)。

肿瘤细胞的培养和收集:从液氮罐中取出肿瘤细胞，迅速置于水浴锅内，并不停摇动使其尽量融化。将解冻后的肿瘤细胞转移到离心管中，补充rpmi-1640全培养基至合适体积，混匀，低温低速离心除去上清液。重复使用全培养液洗涤一次，再用培养基悬浮细胞，按细胞密度接种至含全培养基的培养瓶中。至于合适的温度、co2、湿度的培养箱中培养。待细胞铺满培养瓶底，用胰酶消化为单个细胞，并转移到离心管中，补充全培养基，混匀，低温低速离心，除去上清液，重复洗涤一次，收集细胞沉淀。

实验方法：

rtca实验：e-plate实验所用的孔内加入全培养基，其余孔及所有孔间间隙中加入pbs溶液，室温孵育后，加入细胞稀释液，使每个孔的细胞数大约为5000-10000个，室温孵育后，取出e-plate，于实验孔内加入预先配置好的不同浓度的化合物，每个浓度设置一个重复孔。0.5％dmso作为对照；”0”只有培养液，为空白对照。

聚酰胺pa1～pa6对a549细胞的生长抑制曲线如图4所示。

对比6种聚酰胺药物对c-myc基因高表达的a549(肺腺癌)细胞的生长抑制作用，由图4中可以看出聚酰胺pa1、pa3、pa5和pa6对a549细胞的抑制作用都比较明显，尤其聚酰胺pa5和pa6有较好的浓度依赖性，其余2种聚酰胺药物只有当浓度达到一定值时，实验条件是16μm时，对靶细胞的抑制作用明显增强。

聚酰胺pa1～pa6对a549细胞的杀伤作用：通过数据分析加入聚酰胺pa1～pa6处理24小时后a549细胞的存活率如图5和表2所示。

图5显示了在加入聚酰胺pa1～pa6处理24小时后对a549的杀伤作用。对比这6种聚酰胺pa1～pa6在24小时内对a549杀伤作用，其中聚酰胺pa1～pa6的使用浓度为1μm，2μm，4μm，8μm，16μm。六种聚酰胺pa1～pa6在24小时内对a549细胞的杀伤作用基本上呈浓度依赖关系，其中聚酰胺pa5和pa6在16μm时的细胞的存活率仅分别为31.05％和7.14％，而聚酰胺pa2和pa4对细胞的杀伤作用比较弱，分别为51.55％和72.64％。综合图5的结果，聚酰胺pa5和pa6对a549的毒性作用较强，尤其是聚酰胺pa6；而聚酰胺pa4在实验浓度下对a549细胞没有明显的抑制作用。

六种聚酰胺pa1～pa6对c-myc基因高表达的sgc7901(肺腺癌)细胞的生长抑制作用，实验材料与方法同上述实验材料与方法，实验结果如图6所示。

从图6中可以看出聚酰胺pa1、聚酰胺pa3、聚酰胺pa5、聚酰胺pa6对sgc7901细胞呈现良好的细胞毒性，在浓度为16μm时，细胞指数曲线基本持平，说明sgc7901细胞的生长受到强烈的抑制。而聚酰胺pa2和聚酰胺pa4在8μm时，细胞生长并没有受到明显抑制。

聚酰胺对sgc7901细胞的杀伤作用：通过数据分析加入化合物pa1～pa6处理24小时后sgc7901细胞的存活率如图7和表2所示。

图7显示了在加入聚酰胺pa1～pa6处理24小时后sgc7901的存活率，在最大浓度16μm下，聚酰胺pa5和pa6对sgc7901细胞的存活率均在40％以下，而聚酰胺pa2和pa4存活率均在50％以上。经过对比得出聚酰胺pa1、pa3、pa5和pa6对sgc7901细胞的抑制作用都比较明显，而浓度依赖性较好的是聚酰胺pa5和pa6，其余4种聚酰胺都是当浓度增大到16μm时，对细胞的抑制作用明显增强。

rtca实验表明六种聚酰胺在不同程度上都促进a549细胞和sgc7901细胞的凋亡，其中聚酰胺pa5和pa6的作用效果比较好，聚酰胺pa6比pa5的作用强；对sgc7901细胞作用效果更好。这说明聚酰胺具有靶向基因、治疗多种与c-myc基因相关的肿瘤的潜力。

表2：聚酰胺1-6处理的a549和sgc7901细胞系的ic50值(μm)。

实施例8：聚酰胺对肿瘤细胞c-myc基因表达的影响

(1)通过rt-pcr技术，考查6种聚酰胺pa1～pa6对a549，sgc7901肿瘤细胞c-myc基因的mrna表达情况。

实验材料与方法(二)

材料:核酸提取试剂盒(rneasyminikit试剂盒，qiagen,德国)，onesteprnapcrkit试剂盒(rr024b，takara，日本)试剂盒，胰酶(invitrogen，美国)，bca蛋白浓度测定试剂盒(上海碧云天生物技术公司)。

培养基的组成：同实验材料与方法(一)

肿瘤细胞的培养与收集：同实验材料与方法(一)

rna的提取：rna提取完全参照rneasyminikit(qiagen说明书)。每种肿瘤细胞分别提取两次，提取完成后测定rna浓度并用depc处理过后调节合适浓度。

rt-pcr反应：rt-pcr反应采用onesteprnapcrkit(takara，rr024b)试剂盒。进行两次独立实验。

1.5％琼脂糖凝胶电泳，各取同样体积的rt-pcr反应产物，电泳30-60min，在紫外凝胶成像系统进行拍照，用图像分析软件进行数据分析。

(2)蛋白免疫印迹试验，考查6种聚酰胺pa1～pa6对a549，sgc7901肿瘤细胞c-myc基因的蛋白质表达情况。

表3：sds-聚丙烯酰胺凝胶配方

sds-聚丙烯酰胺凝胶凝电泳条件：sds-聚丙烯酰胺凝胶按表3制备；接通电源；在上样孔中加入maker和样品浓缩胶恒压80-100v，分离胶恒压100-140v，至溴酚蓝的条带刚跑出分离胶前沿后，停止电泳，然后，进行数据分析。

聚酰胺pa1～pa6分别加入a549，sgc7901细胞内，c-mycmrna水平的表达情况：在a549细胞内如图8a和图8b所示，在sgc7901细胞内如图9a和图9b所示，β-actin基因为对照基因。图8a和图9a为c-myc基因rt-pcr扩增产物电泳图。c-myc蛋白水平的表达情况：在a549细胞内如图8c和图8d所示，在sgc7901细胞内如图9c和图9d所示，β-actin基因为对照基因，图8c和图9c为c-myc基因蛋白免疫印迹试验产物电泳图。

从图8a和图8c可以看出，随着浓度增加聚酰胺pa1，pa3，pa5和pa6对应的c-mycmrna和蛋白表达的条带相对变暗，采用quantityone软件对图8a和图8c进行分析，结果分别见图8b和8d。

从图8a、图8b、图8c和图8d中的结果可知，在聚酰胺pa1～pa6存在下，与不加聚酰胺的对照组相比，a549细胞的c-myc基因的转录水平呈现不同程度的下调。通过进一步数据分析(图8b)，聚酰胺pa1～pa6在1μm浓度时，对a549细胞中c-myc基因的转录并没有明显的抑制作用。但当聚酰胺的浓度达到10μm时，聚酰胺pa1，pa3，pa5和pa6对c-myc基因的转录的抑制作用明显增强，c-myc的mrna表达水平分别下降了：54.60％，44.95％，60.97％，63.81％。而聚酰胺pa2和pa4在所有浓度下对c-myc基因的转录的抑制作用都较弱。

聚酰胺pa1～pa6对a549细胞内c-myc蛋白水平的抑制(图8c和图8d)。根据westernblot实验结果显示，聚酰胺pa1～pa6对c-myc蛋白水平的影响情况与pcr的结果一致。在1μm浓度下，聚酰胺的抑制作用除pa5和pa6外不明显。在聚酰胺pa1～pa6的加药浓度为10μm时，a549细胞中c-myc蛋白水平分别下调了53.2％、35.7％、60.4％、30.0％、75.7％和85.6％。综合聚酰胺pa1～pa6对c-mycmrna和蛋白水平的影响，聚酰胺pa1，pa3，pa5和pa6对c-mycmrna和蛋白水平的抑制最明显，尤其，聚酰胺pa5和pa6，而聚酰胺pa2和pa4的作用较弱。

聚酰胺pa1～pa6对sgc7901细胞内c-myc表达的影响见图9a和图9b；从图9a和图9b中的结果可知，在聚酰胺pa1～pa6存在下，与不加聚酰胺的对照组相比，sgc7901细胞的c-myc基因的转录水平呈现不同程度的下调，且呈现浓度依赖的关系。低浓度时聚酰胺对sgc7901细胞中c-myc基因转录的抑制作用并不明显。通过进一步数据分析(图9b)，聚酰胺pa2和pa4对sgc7901细胞中c-myc基因转录的抑制作用不明显。当加药浓度达到10μm时，聚酰胺pa1，pa3，pa5和pa6对c-myc基因转录的抑制作用明显增强，c-myc基因转录水平分别下降了40.9％，45.6％，74.8％和85.6％。

聚酰胺pa1～pa6对sgc7901细胞内c-myc蛋白水平抑制的影响见图9a和图9b。从图9c和图9d中可以看出，当加药浓度为5μm时，聚酰胺pa1，pa3，pa5和pa6对sgc7901细胞中c-myc蛋白的表达有明显的抑制作用，而且抑制作用呈现浓度依赖性。当浓度达到最大10μm时，聚酰胺pa1，pa3，pa5和pa6作用后的sgc7901细胞中的c-myc蛋白水平分别下降了72.2％、90.5％、90％和95.9％。聚酰胺pa2在最大加药浓度下才出现了抑制作用，而聚酰胺pa4在任何浓度下都没有明显的抑制作用。

通过rt-pcr实验和westernblot实验，探究聚酰胺pa1～pa6对a549细胞和sgc7901细胞中原癌基因c-myc转录和表达的影响情况。从图结果说明聚酰胺pa1～pa6对靶标细胞中c-myc基因表达有不同程度的抑制作用，且抑制作用基本呈现浓度依赖的特性。聚酰胺pa2和pa4在低浓度下对细胞c-mycmrna水平并没有明显的抑制效果，但当浓度增加到10μm时，聚酰胺pa2和pa4对细胞内的c-myc蛋白水平表达起到了微弱的抑制作用。而聚酰胺pa1，pa3，pa5和pa6在加药浓度达到5μm就能够明显地抑制c-myc基因的转录和表达。结果表明聚酰胺pa1，pa3，pa5和pa6对sgc7901细胞c-myc的表达有更好的抑制作用。

实施例9：聚酰胺对a549细胞和sgc7901肿瘤细胞迁移的影响

划痕实验材料与方法(三)：

(1)a549，sgc7901肿瘤细胞的培养同实验材料与方法(一)。

(2)划痕实验的方法：待肿瘤细胞至对数生长期，接种于合适的细胞培养孔板，用枪头在孔板底部划直线，记录并记录划痕的位子，然后加入无血清的培养液和不同浓度的化合物，合适温度培养24小时，用倒置显微镜拍照记录肿瘤细胞向划痕区迁移的相对距离。实验结果如图10、图11、图12和图13所示。

其中在图10中，图片a～f分别为聚酰胺pa1～pa6对a549细胞迁移的抑制作用的图片。在图12中，图片a～f分别为聚酰胺pa1～pa6对sgc7901细胞迁移的抑制作用的图片。

通过细胞划痕实验结果表明，在0.1μm浓度下，聚酰胺pa1，pa3，pa5和pa6对a549细胞和sgc7901细胞的迁移有一定的抑制作用，当浓度为0.5μm时，抑制两种肿瘤细胞迁移的能力较明显，抑制率都在60％以上，其中聚酰胺pa6对sgc7901细胞的迁移抑制率达到了96.5％以上。

实施例10：聚酰胺对a549细胞和sgc7901肿瘤细胞凋亡和周期的影响

应用流式细胞术考查六种聚酰胺对c-myc基因高表达的a549和sgc7901两种肿瘤细胞的杀伤及抑制增殖的方式。

实验材料与方法(四)

材料:凋亡试剂盒(bd，美国)

培养基的组成：同实验材料与方法(一)

肿瘤细胞的培养与收集：同实验材料与方法(一)

实验材料与方法：

(1)a549，sgc7901肿瘤细胞的培养同实验材料与方法(一)。

(2)细胞凋亡的实验方法：将细胞(a549和sgc7901)细胞以每孔1×10⁵个细胞接种在12孔板上，并在含有10％fbs的1ml1640补充物中生长。将细胞维持在37℃和5％co2。20小时后，更换培养基，向各孔中加入1ml不同浓度的聚酰胺。将细胞在37℃及5％co2下孵育24小时。然后弃去培养基。用pbs(含2％fbs)洗涤细胞。用不含edta的胰蛋白酶消化细胞，并收集在离心管中。用冷pbs离心并洗涤细胞。添加染料结合缓冲液，使最终细胞浓度为1×10⁶个细胞/ml。将100μl细胞悬浮液转移至新的流式管。然后加入染料a。在室温下孵育15分钟，避光。加入染料b并孵育10分钟。最后添加400μl染料结合缓冲液。使用流式细胞术检测和记录625nm和488nm的7-aad荧光和pi荧光。所有组都有三组作为并行测试。

(3)检测细胞周期的方法：将细胞以每孔2×105个细胞接种在六孔板上，并在含有10％fbs的2ml细胞培养液补充物中生长。将细胞维持在37℃及5％co2。20小时后，通过使用不含fbs的培养基替换细胞培养液，对细胞进行饥饿。一夜后，用pbs冲洗培养基和碎片，并用含有不同浓度的化合物的新鲜细胞培养液代替。对照组由1％dmso表示。将细胞在37℃及5％co2的饱和湿度下培养36小时。接下来，收集细胞并用pbs洗涤两次。将细胞用合适浓度的乙醇(预冷)在4℃下固定过夜。通过离心除去乙醇并用pbs洗涤两次。将细胞转移到流式管中。加入rna酶后，将试管加入37℃水浴中水浴。最后，向每个管中加入周期染料，并在4℃在黑暗中染色25分钟。使用流式细胞术检测和记录488nm的细胞周期。(facscalibur，bd，usa)。所有组都有三组作为平行测试。

聚酰胺pa1～pa6分别加入，药物干预后的a549，sgc7901经过流式细胞仪检测，用modfit软件分析数据(结果见图14a、图14b、图15a和图15b)，可以看出随着聚酰胺浓度的增加肿瘤细胞凋亡比例逐渐增加，表明聚酰胺能够通过诱导细胞凋亡的方式杀伤肿瘤细胞，其中pa5和pa6诱导凋亡的作用最为显著。

从图14a和图14b中可以看出，当加药浓度为6μm时，聚酰胺pa1，pa3，pa5和pa6对a549细胞具有明显的杀伤作用，而且抑制作用呈现浓度依赖性。当浓度达到最大12μm时，聚酰胺pa6作用后的a549细胞的总体凋亡率在60％以上。

从图15a和图15b中可以看出，当加药浓度为6μm时，聚酰胺pa1，pa3，pa5和pa6对sgc7901细胞具有明显的杀伤作用，与对照组相比，早期凋亡和晚期凋亡的比例均有增加，而且抑制作用呈现浓度依赖性。当浓度达到最大12μm时，聚酰胺pa5和pa6作用后的sgc7901细胞的总体凋亡率都在60％以上。聚酰胺pa2和pa4在最大加药浓度下也显示了一定的杀伤作用，不过作用效果较弱。而聚酰胺pa1和pa3的杀伤作用在两者之间。并且与a549细胞相比，聚酰胺的杀伤作用普遍偏强。

肿瘤细胞凋亡周期检测：聚酰胺pa1～pa6分别加入，药物干预后的a549，sgc7901经过流式细胞仪对药物干预后的肿瘤细胞进行细胞周期检测，用周期软件分析数据(结果见图16a、图16b、图17a和图17b)，可以看出随着聚酰胺浓度的增加肿瘤细胞g1期比例逐渐增加，药物的加入使得肿瘤细胞阻滞在g1期，结果表明聚酰胺能够干预细胞周期，并通过将细胞周期阻滞在g1期的方式抑制肿瘤细胞的增殖。

细胞周期的实验结果显示，聚酰胺在3μm浓度下，对a549细胞的周期开始干预，与对照组相比，聚酰胺加入后，处于g1期的a549的细胞比例明显增加，表明周期阻滞在g1期。通过图16b可以看出，在聚酰胺pa1～pa6的加药浓度为6μm时，与对照组相比a549g1期的细胞比例增加30％以上。聚酰胺pa5和pa6g1增加的比例在40％左右，作用最为显著。

图17a和图17b的实验结果显示，聚酰胺在3μm浓度下，sgc7901细胞g1期比例增加，由图17a可以看出，当聚酰胺的浓度为6μm时s期和g2期的峰值很低，细胞基本集中在g1期。通过图16b可以看出，在聚酰胺pa1～pa6的加药浓度为6μm时，与对照组相比sgc7901g1期的细胞比例增加在40％左右。

本发明研究结果表明：聚酰胺作为c-myc基因表达抑制剂，聚酰胺pa1，pa3，pa5和pa6对a549细胞和sgc7901细胞的dna分子水平还是细胞水平上都有一定的抑制和杀伤作用，其中聚酰胺pa6为最佳的靶基因调控剂和靶细胞抑制剂。聚酰胺pa6不仅具有较强的抗肿瘤活性，而且具有较好的特异性，因此聚酰胺pa6具有潜力被开发成靶向c-myc基因的抗肿瘤药物。

本说明书所述的内容仅仅是对发明构思实现形式的列举，本发明的保护范围不应当被视为仅限于实施例所陈述的具体形式。