一种天然抗刺激修护因子及其制备方法与流程

本发明涉及化妆品技术领域，具体涉及一种天然抗刺激修护因子及其制备方法。

背景技术：

紫外线照射会引起皮肤色素沉着、弹性改变、干燥粗糙、皱纹形成等一系列生理改变。

色素沉着指的是黑色素沉着。对于健康的皮肤来说，有各种因素会影响其颜色，黑色素就是其中之一。黑色素位于表皮基底细胞层并累积在已经成熟的黑素体中，然后转移到邻近的角质形成细胞中，使表皮呈现典型的棕色。虽然人的皮肤中黑色素细胞的浓度相似，但不同种族群体之间黑色素细胞的活性是不同的。当皮肤暴露于太阳下时，紫外线会破坏表皮，导致角质形成细胞释放出多肽-前阿片黑色素细胞皮质激素原(pomc)，pomc分裂释放黑色素细胞刺激素(msh)。msh通过黑色素皮质素受体(mc1r)激活环磷酸腺苷(camp)，camp诱导转录因子mitf的转录，而mitf负责转录参与黑色素生成和转移过程中所涉及的基因，其中包括酪氨酸酶基因。酪氨酸酶是黑色素生成过程中的关键酶，酪氨酸在酪氨酸酶作用下经过一系列反应生成黑色素。总的来说，紫外线刺激皮肤，会引起黑色素细胞产生黑色素，黑色素沉着，在人体面部、颈部和手部表现为“色斑”。

另一方面，弹性改变、干燥粗糙、皱纹形成的主要原因在于胶原蛋白、弹性蛋白、氨基多糖等细胞外基质成分发生了改变。细胞外基质是由细胞外的蛋白和多糖构成的网络结构，包括由糖胺聚糖和蛋白聚糖组成的凝胶样基质，以及胶原蛋白和弹性蛋白组成的纤维网架。细胞外基质用来支撑皮肤使其保持张力和紧致性。细胞外基质中起关键作用的有赖氨酰氧化酶(lox)和富含半胱氨酸的酸性分泌糖蛋白(sparc)。lox用来催化胶原蛋白和弹性蛋白之间共价键形成，使细胞外基质交联。sparc是一种结合胶原蛋白的蛋白质，参与胶原纤维和基底层的形成。基底层位于真皮和表皮之间，由层粘连蛋白组成，为角质细胞和成纤维细胞提供机械支持，确保细胞为皮肤保持健康和光亮提供营养。

近年来，化妆品市场对皮肤增白产品的需求不断增加，这些产品不仅能降低皮肤色素沉着水平，还可使皮肤看起来更加光亮和滋润。

目前的化妆品是基于使用含有黑色素生成抑制成分的乳霜、凝胶载体来应对紫外刺激，例如曲酸，对苯二酚和熊果苷。曲酸来源于真菌，具有脱色活性，可抑制酪氨酸酶活性，然而，它与空气接触不稳定，光氧化会失去活性，并且会致敏、引起接触性过敏和皮炎。对苯二酚是天然来源的化合物，具有美白功能，但是该物质具有毒性，禁止作化妆品原料。在对苯二酚衍生物中，熊果苷因为它对细胞有毒也不宜使用。因此，化妆品抗紫外刺激领域需要开发新的天然提取物。

技术实现要素：

本发明的目的在于解决现有的抗紫外刺激的天然修护因子对皮肤细胞有毒的问题，提供一种来自芸苔属植物的、抗紫外刺激有效的、安全的天然修护因子及其制备方法。

为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：

本发明提供了一种天然抗刺激修护因子，所述天然抗刺激修护因子为植物根提取物。

优选地，所述植物根提取物为芸苔属植物试管根提取物，所述天然抗刺激修护因子由芸苔属植物试管根的乙醇提取物和细胞壁提取物组成。

优选地，所述芸苔属植物为白菜(brassicapekinensis)。

本发明还提供了天然抗刺激修护因子的制备方法，包括以下步骤：

步骤1：利用叶盘法将发根农杆菌转化到芸苔属植物的叶片中，培养获得不定根；

步骤2：将不定根在液体培养基中扩大培养；

步骤3：乙醇提取物的制备：收集不定根，将不定根与乙醇在1：4w/v的比例下进行混合匀浆，将样品搅拌1～6小时，在4000rpm、4℃下离心15分钟，固体残渣和上清液分离，回收上清液，旋转蒸发除去乙醇，得到乙醇提取物；通常，从1l乙醇提取上清中可回收约10ml浓缩的乙醇提取物，该提取物可以溶于甘油等亲水性溶剂中，用于化妆品的原料。

步骤4：细胞壁提取物的制备：将步骤3得到的固体残渣悬浮在酸溶液中，并在100℃下煮沸1小时；向溶液中加入胃蛋白酶；在连续搅拌、37℃条件下，反应进行24小时，离心回收上清液，冷冻干燥，获得干粉即为细胞壁提取物；通常从1升细胞壁提取上清中得到约10g干粉，将干粉溶解于甘油等亲水性溶剂，可用作化妆品的原料。

优选地，所述酸溶液为盐酸、硫酸或磷酸。

优选地，所述混合匀浆用乙醇为-20℃保存的、体积百分数为90％～100％的乙醇。

本发明又提供了天然抗刺激修护因子在化妆品中的应用。

本发明再提供了天然抗刺激修护因子在皮肤修护中的应用，具体是将天然抗刺激修护因子和亲水性溶剂混合形成组合物，用于皮肤修护；所述皮肤修护为减少黑色素含量和/或促进层粘连蛋白亚基的表达。

优选地，所述亲水性溶剂为水、盐溶液或有机溶剂，所述有机溶剂为醇、甘油、有机酸、酰胺、胺、醛或酮。

优选地，组合物中乙醇提取物的质量浓度和细胞壁提取物的质量浓度之比为1:1。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明从芸苔属植物(特别是白菜)的试管根中提取修护因子，所得修护因子可以减少皮肤色素沉着、促进细胞外基质中关键蛋白的表达。并且从细胞毒性测定结果来看，所述修护因子对细胞有效、安全。

2、本发明通过用发根农杆菌转化获得试管根，试管根生长速度快，且该过程不需要激素，并且对于具有高抗氧化能力且具有良好抗菌性的次级代谢物具有高生物合成能力，如植物激素、生物碱、蒽醌、抗黄素、类黄酮、皂苷和萜烯，自然状态下这些次级代谢物在植物细胞中含量很低。

3、试管根由于在可控的条件下生长，因此不会有致病因子等潜在环境风险。另外所得修护因子是标准化的并且不依赖于季节和环境条件。这使得所获得的产品始终具有相同的质量特性。此外，还可以通过改变生长条件或通过添加具有刺激作用的天然物质，诱导试管根产生更多的所需物质。

附图说明

图1为两种不同浓度的乙醇提取物和细胞壁提取物对hdf细胞的细胞毒性测定(mtt)结果。纵坐标表示相对于未经处理的对照样品的活细胞百分比，对照的活细胞百分比设定为100％。

图2为用两种不同浓度的细胞壁提取物处理鼠黑色素瘤细胞(b16f1)72h(2a)、处理人原发性黑色素细胞(hem)(2b)24小时后的黑色素含量的分析结果。图2a中样品的黑色素含量为相对于用ibmx刺激的对照样品的百分比，图2b中样品的黑色素含量为相对于未刺激处理的对照样品的百分比。曲酸处理的样品为阳性对照。

图3为细胞壁提取物对小鼠黑素瘤细胞(b16f1)处理72h(3a)和对人原发性黑色素细胞(hem)处理24h(3b)后的酪氨酸酶活性的影响。纵坐标的酶活性值为相对于未处理的对照样品的百分比，对照样品的酶活性值设定为100％。对于b16f1和hem细胞系，分别使用乙酰水杨酸和抗坏血酸处理作为阳性对照。

图4为两种不同浓度的细胞壁提取物对b16f1细胞处理6小时后mitf基因表达量；图中给出的值表示为相对于未经处理的对照样品的百分比，对照样品设定为100％。作为阳性对照，使用乙酰水杨酸处理b16f1细胞。

图5为两种不同浓度的细胞壁提取物和forskolin(10μm)对b16f1细胞处理1h后其内camp水平。对照样品为仅用forskolin(10μm)处理的b16f1细胞，对照样品中的camp水平设定为100％。

图6为两种不同浓度的乙醇提取物处理hdf细胞6小时后，赖氨酰氧化酶(6a)和sparc(6b)表达量。未经处理的对照样品中的赖氨酰氧化酶和sparc表达量设定为100％。阳性对照样品为tgfβ处理的hdf细胞。

图7为两种不同浓度的水乙醇提取物处理6小时后，对人体角质形成细胞(hacat)中iv型胶原表达的影响。未经处理的对照样品中的iv型胶原表达量设定为100％。阳性对照样品为维甲酸处理的hdf细胞。

图8为两种不同浓度的乙醇提取物处理人体角质形成细胞(hacat)6小时后，层粘连蛋白5(α3，β3和γ2)的三个亚基表达量。未经处理的对照样品的表达量设定为100％。

图9为用包含乙醇提取物和细胞壁提取物的组合物处理鼠黑色素瘤细胞(b16f1)72h后的黑色素含量。对照样品为用ibmx刺激的鼠黑色素瘤细胞(b16f1)，其中的黑色素含量设定为100％。

图10为包含细胞壁提取物和乙醇提取物的组合物处理人角质形成细胞(hacat)6小时后层粘连蛋白5的三种亚基(α3，β3和γ2)的表达量。图中给出的值表示为相对于未经处理的对照样品的百分比为100％。

具体实施方式

下面结合具体实施实例来进一步描述本发明。但是应理解所述实例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。

实施例1

1.1白菜试管根的培养

具体包括以下内容：

(1)叶盘转化

①将白菜种子先用70％乙醇灭菌1～3分钟，然后用1％naclo处理15分钟，用无菌水洗涤三次。将处理后的种子在ms固体培养基上培养，培养温度25℃，光周期8h黑暗/16h光照。

②将发根农杆菌(ri15834)在27℃下培养3天并稀释至od600为0.3～0.5。

③白菜种子培养约三周后，取叶片，切出5mm×5mm的大小，然后与发根农杆菌混合，搅拌，放置20分钟，接着将叶片在27℃黑暗条件下，在固体培养基b5m(含b5gamborg1.55g/l，琼脂7g/l，肌醇250mg/l和30g/l蔗糖，ph5.7)上培养3天。

④第四天将外植体用无菌水洗涤并在滤纸上干燥，然后在含抗生素头孢噻肟(500mg/l)的固体培养基b5m上培养一周。接着每周更换培养基直至细菌晕圈消失，培养基中抗生素头孢噻肟浓度为125mg/ml。约5周后，获得不定根。

(2)液体培养物的制备

不定根的生长量达到约2cm(约50mg的重量)时，将根转移到含有150ml液体培养基b5m的烧瓶中。将烧瓶置于黑暗中振荡培养，温度为24～26℃，振荡速度为50rpm。

(3)不定根收集

约4周后，不定根的浓度达到120g/l，此时将含有不定根的液体培养基过滤，收集不定根。随后将不定根在无菌蒸馏水中洗涤并在-80℃冷冻。

1.2从白菜试管根中提取修护因子

具体包括以下内容：

(1)将150g的白菜试管根以1:4w/v的比例悬浮在600ml、体积分数96％的冷乙醇(-20℃)中，搅拌15min。然后将样品置于烧杯中搅拌4h，接着在4℃、4000rpm条件下离心15min，固体残渣和上清液分离，回收上清液约650ml，旋转蒸发上清液除去乙醇，得到6.5ml的浓缩提取物。将浓缩提取物用蒸馏水稀释成乙醇提取物检测液。

(2)将步骤(1)中得到的固体残渣(120g)在300℃条件下用300ml的2mmedta处理1h，冷却后，过滤，同时用蒸馏水洗涤沉淀，并在100℃条件下用0.1n的hcl(ph1.0)处理1h以水解细胞壁的糖，在37℃条件下使用胃蛋白酶处理所得的悬浮液，以分离和消化细胞壁中的蛋白质。离心回收上清液，加入10nnaoh调节ph值至6.5并进行冷冻干燥，得到细胞提取物干粉。将干粉重悬于蒸馏水中，制备成细胞壁提取物检测液。

1.3细胞毒性测定

本实施例中细胞毒性基于mtt(3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基四唑的溴盐)的反应原理进行检测：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶还原mtt，形成的甲臜晶体(深蓝色)。这种晶体在细胞膜内是不可渗透的，并且在活细胞的细胞质中积累。活细胞的数量与甲臜产品的含量成正比。

具体包括以下内容：

(1)将hdf细胞在含有dmem培养基的96孔板中生长约8小时，dmem中补充有10％胎牛血清，hdf细胞的初始浓度为每孔1.3×10⁴个。

(2)然后将1.2中获得的乙醇提取物检测液和细胞壁提取物检测液分别制备成0.01％、0.002％和0.0004％(100μg/ml、20μg/ml和4μg/ml)的浓度后，加入培养孔中对hdf细胞处理48小时。

(3)将细胞在pbs中洗涤并加入ph7.4的pbs缓冲液，pbs缓冲液的加入量为100μl/孔，所述pbs缓冲液包括10mmhepes(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)、1.3mmcacl2、1mmmgso4、4.5mm葡萄糖和0.5mg/mlmtt。

(4)在37℃、5％co2条件下孵育3小时后，向每个孔中加入100μl含有10％tritonx-100和0.1nhcl的溶液。2小时后，用分光光度计测定595nm处的吸光度。

结果如图1所示，本实施例中使用乙醇提取物和细胞壁提取物分别处理的人成纤维细胞(hdf)，活细胞百分比均大于未经任何处理的对照hdf细胞，表明乙醇提取物和细胞壁提取物在浓度不大于0.01％(0.1mg/ml)时对皮肤细胞没有毒性。

1.4黑色素含量的测定

本实施例使用鼠黑素瘤细胞素(b16f1)和原代人黑色素细胞(hem)进行黑色素含量的测定。在刺激黑色素产生的ibmx存在的情况下，用0.0002％、0.001％两种不同浓度(2μg/ml、10μg/ml)的细胞壁提取物处理b16f1细胞72小时，其中ibmx能够增加camp水平，加速黑色素生成过程。而hem细胞用相同浓度的细胞壁提取物在不含ibmx的情况下处理24小时，这是因为hem细胞在没有刺激的情况下黑色素的产生也比较明显。

具体包括以下内容：

(1)将初始浓度为3×10³/孔的b16f1细胞置于96孔板中，于37℃、5％co2条件下培养16小时，培养基为补充有10％胎牛血清、2mm谷氨酰胺和1mm丙酮酸钠的dmem培养基。然后在50μmibmx(磷酸二酯酶抑制剂)存在情况下，分别用浓度为0.001％和0.0002％的细胞壁提取物处理b16f1细胞72小时，使用未经任何处理的b16f1细胞和50μmibmx处理的b16f1细胞作为对照，阳性对照样品为曲酸和50μmibmx处理的b16f1细胞。

(2)将初始浓度为5×10³/孔的hem细胞置于96孔板中，于37℃、5％co2条件下培养20小时，培养基为添加了(hmgs-2)-无pma的medium254。然后分别用浓度为0.001％和0.0002％的细胞壁提取物处理hem细胞24小时，未经处理的hem细胞为对照样品，阳性对照样品为曲酸处理的hem细胞。

(3)将上述处理后的b16f1细胞和hem细胞分别用pbs中洗涤，然后每孔加入50μl的1nnaoh，在70℃条件下裂解20分钟。然后测定490nm处的吸光度，该吸光度对应黑色素的含量。

结果显示，从图2a和图2b可以看出，490nm处的吸光度显示，用细胞壁提取物处理后，黑色素的含量显着降低。在b16f1细胞和hem细胞中，0.001％的细胞壁提取物分别使黑色素含量减少20％和30％。

1.5酪氨酸酶活性的分析测定

本实施例使用鼠黑素瘤细胞素(b16f1)和原代人黑色素细胞(hem)进行酪氨酸酶酶活性分析。

具体包括以下内容：

(1)将初始浓度为1×10⁵/孔的b16f1细胞置于96孔板中，于37℃、5％co2条件下，在补充有10％胎牛血清、2mm谷氨酰胺和1mm丙酮酸钠的dmem培养基中培养20小时。将b16f1用0.0002％至0.001％两种不同浓度(2μg/ml、10μg/ml)的细胞壁提取物处理72小时。

(2)将细胞初始浓度为1.5×10⁵孔的hem细胞置于96孔板中，于37℃、5％co2条件下，在补充(hmgs-2)-无pma培养基254中培养20小时。用0.0002％至0.001％两种不同浓度(2μg/ml、10μg/ml)的细胞壁提取物处理hem细胞24小时。

(3)上述两种细胞在与细胞壁提取物一起温育后，用pbs洗涤并收集在100μl裂解缓冲液(ph6.8、50mm磷酸盐缓冲液，1％tritonx-100和0.1mmpmsf)中。通过bradford蛋白质测定法测量裂解物的蛋白质含量，然后在室温下将样品按照每50μg蛋白质加入2mml-dopa(l-3,4-二羟基苯丙氨酸)温育。接着在490nm下测量吸光度，每10分钟测一次，持续1小时，以计算裂解物中酪氨酸酶的活性。

从图3中可以看出，用芸苔属植物试管根提取物处理显着降低了酪氨酸酶的活性，在两种浓度(0.0002％至0.001％)下，人类黑色素细胞(图3b，hem)和鼠细胞(图3a，b16f1)均显着降低了酪氨酸酶活性：高浓度(0.001％)细胞壁提取物处理后的b16f1中的酶活性降低约45％，hem中的酶活性降低约35％。在b16f1中，细胞壁提取物产生的酶活性的抑制作用比1mm乙酰水杨酸产生的更明显(乙酰水杨酸用作b16f1中的阳性对照，0.02％(0.2mg/ml)抗坏血酸用作hem中的阳性对照)。

1.6转录因子mitf、赖氨酰氧化酶和sparc、层粘连蛋白5的α3，β3和γ2亚基和胶原蛋白iv的表达的分析

本实施例中用于分析mitf基因表达的是细胞b16f1；对于赖氨酰氧化酶(lox)和sparc(spo)基因均使用人原代成纤维细胞(hdf)；对于胶原蛋白iv(col-iv)、层粘连蛋白(lam5-α，β和γ)使用永生化的人角质形成细胞(hacat)。

具体包括以下内容：

(1)将初始浓度为1×10⁵/孔的黑色素细胞鼠(b16f1)置于96孔板中，在dmem培养基中培养16小时，培养基中补充有10％胎牛血清、2mm谷氨酰胺和1mm丙酮酸钠。

(2)将初始浓度为8×10³/孔的人原代成纤维细胞(hdf)置于96孔板中，在补充有0.5％fbs的dmem培养基中培养6小时。

(3)将初始浓度为每孔1.2×10⁵的永生化角质形成细胞(hacat)置于96孔板中，在dmem培养基中生长16小时，培养基中补充有10％胎牛血清。

(4)随后用0.0002％、0.001％两种浓度的细胞壁提取物(2μg/ml、10μg/ml)处理黑色素细胞鼠(b16f1)6小时；用0.0002％、0.002％两种浓度的乙醇提取物(2μg/ml、20μg/ml)处理人成纤维细胞(hdf)6小时；用0.0002％、0.002％两种不同浓度的乙醇提取物持续处理hacat细胞(2μg/ml、20μg/ml)6个小时；

(5)温育结束，分别收获细胞并提取rna，将rna样品用dnasei处理以除去基因组dna，然后对rna样品进行定量分析。接着将300ng的总rna使用逆转录酶进行逆转录。

(6)使用rt-pcr进行半定量，对于lox基因，使用比例为5：5的18spcr引物对/18spcr竞争子(ambion)作为引物对进行rt-pcr。对于mitf和lam5-β和spo基因，使用比例为4：6的18spcr引物对/18spcr竞争子(ambion)作为引物，对于lam5-α，lam5-γ和col-iv基因，使用比例为3：7的18spcr引物对/18spcr竞争子(ambion)作为引物。

(7)将pcr产物进行电泳、分析。图4和图6-8所示的基因表达量为待测基因带的强度与参考18s带的强度之间的比率。

其中，用于扩增的特异性引物的序列如下：

mitffw：5’-caggtaaagcagtacctttc-3’，

mitfrv：5’-cagtgctcttgcttcagact-3’，

lam5-αfw：5’-atgtgatgattgcgacagc-3’，

lam5-αrv：5’-agcacgaaggtcactgagt-3’，

lam5-βfw：5’-agacctatgatgcggacct-3’，

lam5-βrv：5’-gaagacatctccagcctca-3’，

lam5-γfw：5’-atcaacaggtgagctatgg-3’，

lam5-γrv：5’-caatctcctgtgtctggat-3’，

col-ivfw：5’-tgtgaccaggcatagtca-3’，

col-ivrv：5’-gagccaaaagctgtaagc-3’，

loxfw：5’-gtccatgtacaacctgag-3’，

loxrv：5’-tcctgtgtagcgaatgtc-3’，

spofw：5’-atgagggcctggatcttctttc-3’，

sporv：5’-cgcagcttctgcttctcagt-3’。

从图4中可以看出，用低浓度(0.0002％)的提取物处理使mitf基因表达降低约25％。

从图6中可以看出，用乙醇提取物处理增加了赖氨酰氧化酶(6a)和sparc(6b)的表达：浓度为0.002％乙醇提取物，使lox的表达增加约40％，浓度为0.0002％乙醇提取物使sparc的表达增加约40％。

如图7所示，用乙醇提取物处理显著增加iv胶原蛋白的表达，浓度为0.002％产生基因表达增加约270％，由维甲酸处理用作阳性对照，其诱导增加约28％。

从图8中可以得出，用乙醇提取物处理显着增加了层粘连蛋白5的所有亚基的表达：高浓度(0.002％)使层粘连蛋白α3的表达增加约70％，β3增加约为45％，γ2增加约180％。这些结果表明，用乙醇提取物处理显着增加这些基因的表达，可以促进细胞外基质和基底膜的形成，使皮肤滋润、均匀和紧致。

1.7细胞内camp含量分析

在黑色素的生产过程中，特别重要的一个因素是第二信使camp：降低细胞内camp的水平相当于减少导致黑色素产生的酪氨酸，以及所有参与的基因活化的级联转录。

本实施例将两种浓度的细胞壁提取物与10umfoskolin刺激缓冲液共同处理b16f1细胞1小时，forskolin是已知的腺苷酸环化酶活化剂，可增加细胞内camp的水平。然后使用camp384kit检测camp含量。

具体包括以下内容：

(1)将培养的b16f1细胞分离，在pbs中洗涤并重悬浮于标有alexa647染料的camp抗体的刺激缓冲液(稀释100倍)中(含胎牛血清0.1％，ibmx0.5％的1×pbs缓冲液)，然后加入384孔板，每孔6ul，12000个细胞/孔。

(2)然后分别将0.0002％、0.001％两种浓度的细胞壁提取物(2μg/ml、10μg/ml)与10umfoskolin刺激缓冲液(6ul/孔)混合并处理b16f1细胞，未经任何处理的b16f1细胞和10umfoskolin刺激缓冲液处理的b16f1细胞为对照。

(3)将已知浓度的camp溶解于含标有alexa647染料的camp抗体的缓冲液中，制作camp标准曲线。

(4)将培养板在室温下温育1小时，加入12μl检测复合物，检测复合物包括biotin标记的camp(b-camp)与铕标的链霉亲和素蛋白eu-w8044(eu-sa)，其中铕标的camp示踪复合物与体系中的camp竞争结合标有alexa647染料的camp抗体。

(5)培养2小时后，在340nm下激发样品并在665nm下记录荧光发射光谱。340nm的光激发eu-sa/b-camp示踪剂的eu，eu发出能量，并转移到alexa647染料上，产生665nm的发射光。荧光的强度与样品中的camp含量成反比。

从图5中可以看出，用forskolin的处理刺激了camp的产生，但是与细胞壁提取物同时处理减少了这种增加：高浓度(0.001％)细胞壁提取物约使camp减少35％。

实施例2细胞壁提取物和乙醇提取物的混合物对黑色素产生和基底膜中蛋白质表达的影响

2.1细胞壁提取物和乙醇提取物的混合物对黑色素产生的影响

在ibmx存在下，用两种提取物的混合物处理鼠黑色素瘤细胞(b16f1)72小时，每种提取物均浓度为0.0002％(2μg/ml)。

从图9中可以看出，该处理显着降低了黑色素含量：约15％的降低量。与图2中所示相同浓度的细胞壁提取物处理时的结果相似。该结果表明，两种提取物的混合物仅保留了细胞壁提取物降低黑色素的能力，并且乙醇提取物的存在不会干扰该活性。

2.2细胞壁提取物和乙醇提取物的混合物对基膜组成蛋白表达的影响

利用实施例6中的方法，进行rt-pcr实验以检测组成层粘连蛋白5的三个亚基(α3，β3和γ2)的表达水平。

从图10中可以明显看出，用两种提取物的混合物处理显着增加了层粘连蛋白5的所有亚基的表达：特别是该混合物使层粘连蛋白α3表达增加大约60％，β3约增加81％，而γ2约增加72％。这些结果表明，这两种提取物对层粘连蛋白亚基的表达具有协同作用，因为与仅用乙醇提取物获得的结果相比，在相同浓度下，图8的增加值低。