一种仿生人工骨及其制备方法与流程

本发明涉及医用复合材料技术领域，尤其涉及一种仿生人工骨及其制备方法。

背景技术：

多种疾病或创伤均可导致骨缺损。天然骨由有机质和无机盐构成，二者比例约为35:65。有机质主要包括胶原、多糖等，无机盐主要为钙盐。

许多人工骨材料已被用于骨重建，可分为：(1)无机材料：如生物陶瓷，生物相容性好但相对惰性，硬度高但脆性；(2)有机材料：如胶原、聚酯等，可成骨诱导但力学性能差；(3)复合材料：如磷酸钙-胶原复合人工骨、plga-bmp人工骨等，兼具力学性能和生物活性，但成骨活性仍不理想。

近年来，纳米骨修复材料引起关注：力学强度好、生物活性高。主要有纳米陶瓷、纳米高分子聚合物、纳米复合材料等，但上述纳米骨修复材料均为人工合成，其宏量制备、孔径控制、分散度等仍是制约其应用的瓶颈问题。

技术实现要素：

为了解决人工合成纳米材料面临的问题，本发明提供一种仿生人工骨及其制备方法，其利用具有精妙的天然纳米结构的海洋生物的天然生物矿化结构，制备获得一种价格低廉而生物安全性、相容性和力学性能等良好的天然纳米仿生骨修复材料。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一个目的是提供一种仿生人工骨，其包括a组分和b组分，所述a组分为具有天然多重纳米结构的海洋源性生物矿化物，b组分为仿细胞外基质有机物。

为了进一步优化上述仿生人工骨，本发明采取的技术措施包括：

进一步地，所述b组分为溶液形式，其为胶原与多糖的复合物，在溶液中胶原与多糖的总浓度为2～10wt％，所述胶原与多糖的重量比为10:1-20:1。

进一步地，所述a组分和b组分的w/v比例为1:1～1:5。

进一步地，所述b组分中，所述胶原与多糖的重量比为10:1-15:1；在溶液中胶原与多糖的总浓度为2～5wt％；所述a组分和b组分的w/v比例为＝1:3-1:5。

进一步地，所述a组分主要为硅藻门海洋生物外骨骼，包括中心纲硅藻、羽纹纲硅藻中的一种或几种。

进一步地，所述a组分包括中心纲硅藻中的一种或几种，所述中心纲硅藻包括根管藻、盒型藻、冠盘藻、小环藻、圆筛藻中的一种或几种。

进一步地，所述硅藻门海洋生物外骨骼以无定形二氧化硅为主，还有少量钙盐、多糖、蛋白等组分；具有天然多重纳米结构，单个藻体中便含0.5-5μm、100-200nm、1-100nm多重纳米结构；力学强度优异，可承受150-680n·mm^-1的机械压力；为单细胞，分散性好；资源极为丰富。

进一步地，所述b组分中，所述胶原包括ⅰ、ⅱ、ⅲ型胶原蛋白或胶原明胶或胶原多肽中的一种或几种；所述胶原的来源包括牛、猪、羊、鸡、鱼。

进一步地，所述b组分中，所述胶原主要为ⅰ型蛋白或胶原明胶或胶原多肽的一种或几种，所述胶原来源于鱼。

进一步地，所述b组分中，所述多糖包括水溶性壳聚糖及其衍生物、甲壳素及其衍生物、硫酸软骨素及其衍生物、透明质酸及其衍生物、海藻酸及其衍生物、岩藻多糖及其衍生物、硫酸角质素及其衍生物、石莼多糖及其衍生物、琼脂多糖及其衍生物、螺旋藻多糖及其衍生物、卡拉胶中的一种或几种。

本发明的第二个目的是提供一种任一上述的仿生人工骨的制备方法，其包括如下步骤：

步骤1)a组分制备：海洋源性生物矿化物经多次水洗、离心去除杂质后，先以氯化钠溶液超声处理，再以过氧化氢和盐酸处理，反复水洗至中性后，离心去上清液；依次以不同浓度的乙醇超声洗涤，离心去上清后，真空干燥；

步骤2)b组分制备：b组分中胶原组分：多糖组分(w/w)＝10:1-20:1，其为包括胶原与多糖的复合物，配制成2-10wt％的溶液；

步骤3)a组分和b组分复合：温和搅拌条件下，向b组分中缓慢加入a组分，比例为a:b＝1:1～1:5(w/v)；负压条件下静置，使得b组分充分浸润到a组分多重纳米结构中并彻底排除气泡；将混匀的混合物缓缓倒入模具中，冻干；

步骤4)交联：将步骤3)的冻干产物以交联溶液处理，冲洗去除冗余交联溶液；

步骤5)二次冻干：将步骤4)中的交联产物冷冻干燥；

步骤6)分装、灭菌：将步骤5)所得产物分装后，灭菌，获得仿生人工骨成品。

进一步地，所述仿生人工骨的制备方法包括如下步骤：

步骤1)a组分制备：硅藻经多次水洗、离心去除杂质后，先以2-5wt％氯化钠溶液超声处理15-30min，再以10-30wt％过氧化氢和1-3mol·l^-1盐酸处理24-72h，反复水洗至中性后，离心去上清液；依次以50wt％、75wt％、100wt％乙醇超声洗涤各15-30min，离心去上清后，真空干燥；

步骤2)b组分制备：b组分中胶原组分：多糖组分(w/w)＝10:1-20:1，其为包括胶原与多糖的复合物，采用常规溶剂配制成2-10wt％的溶液；例如：胶原-多糖复合物以无菌去离子水配制成2-10wt/％溶液，温和搅拌混匀后，排除气泡得均匀溶液；

步骤3)a组分和b组分复合：温和搅拌条件下，向b组分中缓慢加入a组分，比例为a:b＝1:1～1:5(w/v)；负压条件下静置4-12h，使得b组分充分浸润到a组分多重纳米结构中并彻底排除气泡；将混匀的混合物缓缓倒入模具中，冻干；

步骤4)交联：将步骤3)的冻干产物以10-40mg/mledc(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺)、2.25-5mg/mlnhs(n-羟基琥珀酰亚胺)交联溶液处理4-18h，pbs多次冲洗去除冗余交联溶液；

步骤5)二次冻干：将步骤4)中的交联产物冷冻干燥；

步骤6)分装、灭菌：将步骤5)所得产物分装后，辐照灭菌或电子束最终灭菌，获得仿生人工骨成品。

进一步地，所述仿生人工骨成品的剂型包括颗粒、海绵、粉末、块体或毛条。

本发明采用上述技术方案，具有如下技术效果：

本发明所述的仿生人工骨为海洋源性天然多重纳米仿生人工骨，其由海洋源性天然无机材料和有机材料仿生复合而成，具有天然多重纳米仿生结构和组分，可引导且诱导新生组织生成。该仿生人工骨包括天然多重纳米结构的无机矿化组分和仿细胞外基质的有机组分，均为海洋源性，来源广泛、成本低廉、生物安全性高，是天然仿生的细胞外基质支架材料。本发明制备的海洋源性天然多重纳米仿生人工骨可加工性和临床操作性好，可为颗粒、海绵、粉末、块体或毛条等多种剂型，可满足不同骨缺损修复的临床需求。

附图说明

图1是本发明一实施例中所制备的天然多孔纳米仿生人工骨的示意图。

图2是本发明一实施例中采用实施例1制备的仿生人工骨和市售人工骨组修复新西兰兔股骨缺损的结果示意图。

具体实施方式

本发明涉及一种仿生人工骨，其包括a组分和b组分，所述a组分为具有天然多重纳米结构的海洋源性生物矿化物，b组分为仿细胞外基质有机物；具体地，所述b组分为溶液形式，其为胶原与多糖的复合物，所述a组分主要为硅藻门海洋生物外骨骼。本发明还涉及上述仿生人工骨的制备方法。

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。

实施例1

本实施例为一较佳的仿生人工骨(如图1所示的圆柱体形)的制备方法，包括如下步骤：

1)a组分制备：收集足量圆筛硅藻，经多次水洗、离心去除杂质后，先以5wt％氯化钠溶液超声处理30min，再以30wt％过氧化氢和2mol·l^-1盐酸处理48h，反复水洗至中性后，离心去上清液。依次以50wt％、75wt％、100wt％乙醇超声洗涤各30min，离心去上清后，真空干燥。

2)b组分制备：ⅰ型鱼胶原蛋白：透明质酸＝10:1(w/w)，配制成4wt％的溶液。

3)a组分和b组分复合：温和搅拌条件下，向b组分中缓慢加入a组分，比例为a:b＝1:5(w/v)。负压条件下静置12h，使得b组分充分浸润到a组分多重纳米结构中并彻底排除气泡。将混匀的混合物缓缓倒入模具中，冻干。

4)交联：将步骤3)的冻干产物以10mg/mledc、2.25mg/mlnhs交联溶液处理18h，pbs多次冲洗去除冗余交联溶液。

5)二次冻干：将步骤4)中的交联产物冷冻干燥。

6)分装、灭菌：将步骤5)所得产物分装后，辐照灭菌或电子束最终灭菌，可得成品。

实施例2

本实施例为另一较佳的仿生人工骨的制备方法，包括如下步骤：

1)a组分制备：收集足量根管硅藻经多次水洗、离心去除杂质后，先以2wt％氯化钠溶液超声处理20min，再以20wt％过氧化氢和3mol·l^-1盐酸处理24h，反复水洗至中性后，离心去上清液；依次以50wt％、75wt％、100wt％乙醇超声洗涤各20min，离心去上清后，真空干燥；

2)b组分制备：ⅱ型鱼胶原多肽：水溶性壳聚糖＝12:1(w/w)，配制成10wt％的溶液；

3)a组分和b组分复合：温和搅拌条件下，向b组分中缓慢加入a组分，比例为a:b＝1:2(w/v)；负压条件下静置8h，使得b组分充分浸润到a组分多重纳米结构中并彻底排除气泡；将混匀的混合物缓缓倒入模具中，冻干；

4)交联：将步骤3)的冻干产物以30mg/mledc(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺)、3.5mg/mlnhs(n-羟基琥珀酰亚胺)交联溶液处理10h，pbs多次冲洗去除冗余交联溶液；

5)二次冻干：将步骤4)中的交联产物冷冻干燥；

6)分装、灭菌：将步骤5)所得产物分装后，辐照灭菌或电子束最终灭菌，获得仿生人工骨成品。

实施例3

本实施例为又一较佳的仿生人工骨的制备方法，包括如下步骤：

1)a组分制备：收集足量冠盘硅藻经多次水洗、离心去除杂质后，先以3.5wt％氯化钠溶液超声处理15min，再以10wt％过氧化氢和1mol·l^-1盐酸处理72h，反复水洗至中性后，离心去上清液；依次以50wt％、75wt％、100wt％乙醇超声洗涤各15min，离心去上清后，真空干燥；

2)b组分制备：ⅲ型猪胶原明胶：岩藻多糖＝20:1(w/w)，配制成2wt％的溶液；

3)a组分和b组分复合：温和搅拌条件下，向b组分中缓慢加入a组分，比例为a:b＝1:1(w/v)；负压条件下静置4h，使得b组分充分浸润到a组分多重纳米结构中并彻底排除气泡；将混匀的混合物缓缓倒入模具中，冻干；

4)交联：将步骤3)的冻干产物以40mg/mledc(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺)、5mg/mlnhs(n-羟基琥珀酰亚胺)交联溶液处理4，pbs多次冲洗去除冗余交联溶液；

5)二次冻干：将步骤4)中的交联产物冷冻干燥；

6)分装、灭菌：将步骤5)所得产物分装后，辐照灭菌或电子束最终灭菌，获得仿生人工骨成品。

应用实施例1

本实施例为将实施例1制备的仿生人工骨用于进行新西兰兔股骨缺损修复。按标准操作建立新西兰兔股骨模型。取约6月龄新西兰兔，制备1.5cm股骨缺损后，实验组植入本发明制备的仿生人工骨，对照组植入市售硫酸钙人工骨产品。3个月后取材，观察骨缺损修复情况。本发明制备的仿生人工骨组有大量新骨生成且与受体骨组织有效融合，新生骨组织中有丰富新生血管长入，结构与骨的生理结构相似，见图2的(b)部分。市售人工骨组仍有大量空腔，骨生成效果不佳，见图2的(a)部分。

由上述实施例可知，本发明所制备的仿生人工骨主要采用海洋源性材料，病毒传播风险低，来源广泛、资源丰富、价格低廉；且其所使用的无机矿化组分为天然的多重纳米结构支架，分散性好、力学强度高，生物相容性好，具有纳米诱导活性，可诱导多种细胞迁移和增殖。本发明所制备的仿生人工骨含有机组分和无机组分，具有天然仿生微结构和细胞外基质组分，极为接近骨的天然结构，可为骨再生提供仿生微环境。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。