L-丝氨酸在预防或治疗高原颅脑损伤中的应用的制作方法

本发明涉及l-丝氨酸的应用技术领域，尤其涉及l-丝氨酸在预防或治疗高原颅脑损伤中的应用。

背景技术：

人的大脑主要由白质和灰质组成，大脑灰质又称大脑皮层。其中灰质主要由神经元的胞体和无髓轴突构成，是中枢神经系统的中央处理器，担负着大脑的许多高级功能；白质主要由包裹着髓鞘的轴突和各种神经胶质细胞构成，包括胼胝体、内囊、前连合和纹状体纤维束等。脑白质具有应答来自于大脑皮层运动和感觉信息并回应其信号给大脑皮层的功能，在信号传导等方面发挥重要作用。

近年来随着去高海拔地区开发旅游的人数日益增多，高原颅脑损伤发生率越来越高，其高致残率致死率已受到人类的日益关注。高原颅脑损伤后以中枢神经细胞的髓鞘损害为主要特征，其造成的神经元脱髓鞘，轴突退化，使得继发性损伤加重，患者则表现出注意力不集中、健忘和个性改变，直至痴呆、昏迷甚至是死亡。以往对于高原颅脑损伤的治疗，大多关注于灰质的病理变化及修复过程，白质损伤在很大程度上被忽视。近年来，越来越多的研究表明，白质损伤也成为这些疾病的重要病理过程，对于白质损伤的研究也越来越受到重视。目前，针对脑外伤及脑缺血的治疗药物均未能有效降低病人的死亡率和致残率，很大可能原因就是目前的治疗药物只对神经元胞体损伤有一定保护作用，而对维系神经元之间、皮质与皮质下之间联系的白质部分没有明显的保护作用。

高原环境下白质损伤的主要病理改变包括：从局部水肿到脱髓磷脂；轴突和少突胶质细胞的丢失；轻度胶质细胞增生等组织学变化。少突胶质细胞oligodendrocyte，olg是形成和维持髓鞘的基本细胞，在轴突损伤后的脱髓鞘及髓鞘修复过程中发挥主要作用。olg包绕轴突，形成绝缘的髓鞘结构，协助传递神经电信号，维持和保护神经元的正常生理功能。olg在成年个体脑中仍能再生，新的olg主要来源于少突胶质前体细胞oligodendrocyteprogenitorcells，opcs，部分来源于神经干细胞。另外，白质高度易感于炎症反应，高原下白质损伤往往伴随炎症反应的发生。尽管炎症反应是应对损伤和感染的第一道防线，但过度的炎症反应会加重神经组织的损伤。在中枢神经系统中，主要是小胶质细胞和星形胶质细胞参与炎症反应。在高原环境下脑白质损伤过程中，伴随有胶质细胞增殖、活化，并产生促炎因子，进一步损伤神经系统。

l-丝氨酸是一种重要的胶质细胞源性神经营养物质，对神经元存活及神经突起的生长有重要作用。l-丝氨酸也是合成磷脂酰丝氨酸、鞘脂、核苷酸及神经递质d-丝氨酸的前体，是中枢神经系统重要的非必需氨基酸。l-丝氨酸已被用于治疗抑郁症、精神分裂症、慢性疲劳综合征，并用于防止精神运动迟缓、小头畸形。有研究发现，一些神经递质对于内源性神经干细胞具有激活作用，如激活抑制性神经递质gaba受体，可促进神经干细胞的增生。l-丝氨酸属于机体内源性物质，能够激动抑制性氨基酸甘氨酸glycine受体，对gaba受体也有一定的激动作用。

技术实现要素：

本发明提供l-丝氨酸在预防或治疗高原颅脑损伤中的应用，解决现有技术中的许多神经疾病都涉及到白质损伤，如中毒性脑白质变性、缺血性和出血性脑损伤、多发性硬化及脑外伤。以往对于高原颅脑损伤的治疗，大多关注于灰质的病理变化及修复过程，白质损伤在很大程度上被忽视。然而，现在越来越多证据表明，白质损伤在脑损伤中起着重要作用，但是目前还缺乏确实有效的临床神经保护剂，因此针对高原脑白质损伤的治疗需要也越来越迫切等技术问题。

本发明采用以下技术方案：l-丝氨酸在预防或治疗高原颅脑损伤中的应用，步骤为：

第一步，建立小鼠高原模型：通过将c57bl/6小鼠放入低压氧舱，模拟海拔4000m进行模拟高原培养；

第二步，对高原培养后小鼠麻醉：3天后将小鼠从低压氧舱拿出，腹腔注射麻醉剂将小鼠麻醉，将麻醉后的小鼠固定在脑立体定位仪上；

第三步，建立小鼠高原颅脑损伤模型：消毒并切开小鼠头皮，暴露前囟，确定前囟位置，以前囟前1.5mm，中线右侧旁开1.5mm处为中心，以牙科钻开一直径为3mm的骨窗，充分暴露硬脑膜，并保持硬脑膜外形完整，打开tbi-0310颅脑损伤仪，然后撞击开骨窗处位置，撞击完成后缝合头皮，术后将小鼠置于ivc鼠笼内正常饲养，假手术组仅切开头皮和颅骨开窗，不撞击；

第四步，对高原颅脑损伤的小鼠予以l-丝氨酸治疗：治疗组在手术半小时后腹腔注射l-丝氨酸给药，每天两次，连给3天；

第五步：建立小鼠高原颅脑损伤模型后第1天开始，进行行为学测试，在第三天开始取脑组织进行形态学检测。

作为本发明的一种优选技术方案：所述第一步中，低压氧舱内压力为-39.7kpa。

作为本发明的一种优选技术方案：所述第二步中麻醉剂采用质量分数10%的水合氯醛，麻醉剂量为0.01ml/g。

作为本发明的一种优选技术方案：所述第三步中撞击参数为：撞击停留时间150ms，撞击速度3.5m/s，撞击深度1.5mm。

作为本发明的一种优选技术方案：所述第三步中骨窗中心区域为额顶叶交界处的感觉运动混合皮层。

作为本发明的一种优选技术方案：所述第三步中开骨窗和撞击后及时止血。

作为本发明的一种优选技术方案：所述第四步中l-丝氨酸给药量为342ml/kg。

作为本发明的一种优选技术方案：所述第五步中行为学测试方法为rotarodtest转杆实验,beamwalkingtest平衡木试验,corner转角实验。

作为本发明的一种优选技术方案：所述第五步中形态学检测方法为快蓝染色，免疫组织化学荧光。

有益效果：

本发明所述l-丝氨酸在预防或治疗高原颅脑损伤中的应用采用以上技术方案与现有技术相比，具有以下技术效果：

1、我们采用l-丝氨酸治疗小鼠在行为学上有明显的改善；

2、行为学实验rotarodtest,beamwalkingtest,corner结果显示，l-丝氨酸治疗后高原脑外伤后小鼠的感觉运动功能有所恢复；

3、另外，通过尼氏染色和快蓝染色，发现经过l-丝氨酸治疗后，能显著增加海马ca3区神经元数量，对高原环境下脑白质的损伤也有一定的修复作用，促进高原颅脑损伤患者运动感觉功能的修复；

4、并且，l-丝氨酸治疗能抑制小胶质细胞的活化和炎症因子的表达；

5、这些结果提示，l-丝氨酸的治疗作用可能与其抑制损伤过程，特别是抑制小胶质细胞活化、炎症因子释放有一定的关系。

6、l-丝氨酸对高原颅脑损伤的小鼠脑白质损伤有治疗作用，可能与其抑制炎症反应从而保护神经细胞与其突起，减少损伤，以及促进少突胶质细胞增生，促进髓鞘的再生修复，进而促进神经功能的恢复有关。

7、对于高原下脑白质损伤，l-丝氨酸治疗可以抑制脱髓鞘损伤，改善运动及感觉能力，修复神经功能；同时l-丝氨酸对白质损伤的治疗作用可能与抑制炎症反应、促进少突胶质细胞增生有关。

附图说明

图1是建立小鼠高原颅脑损伤模型撞击示意图。

图2是本申请实验的技术路线图。

图3是本申请行为学检测图。

图4是本申请快蓝染色情况图。

图5是本申请免疫组织化学荧光图。

图6是本申请小胶质细胞数量的统计图。

图7是本申请基因表达情况统计图。

具体实施方式

以下结合实例对本发明作进一步的描述，实施例仅用于对本发明进行说明，并不构成对权利要求范围的限制，本领域技术人员可以想到的其他替代手段，均在本发明权利要求范围内。。

实施例1：

l-丝氨酸在预防或治疗高原颅脑损伤中的应用，步骤为：

第一步，建立小鼠高原模型：通过将c57bl/6小鼠放入低压氧舱，模拟海拔4000m进行模拟高原培养，低压氧舱内压力为-39.7kpa；

第二步，对高原培养后小鼠麻醉：3天后将小鼠从低压氧舱拿出，腹腔注射麻醉剂将小鼠麻醉，将麻醉后的小鼠固定在脑立体定位仪上，麻醉剂采用质量分数10%的水合氯醛，麻醉剂量为0.01ml/kg；

第三步，建立小鼠高原颅脑损伤模型：消毒并切开小鼠头皮，暴露前囟，确定前囟位置，以前囟前1.5mm，中线右侧旁开1.5mm处为中心，以牙科钻开一直径为3mm的骨窗，骨窗中心区域为额顶叶交界处的感觉运动混合皮层，充分暴露硬脑膜，并保持硬脑膜外形完整，注意止血，打开tbi-0310颅脑损伤仪，设定参数，撞击速度：3.5m/s，撞击深度：1.5mm，撞击停留时间：150ms，然后撞击开骨窗处位置，撞击过程中注意及时止血，撞击完成后缝合头皮，术后将小鼠置于ivc鼠笼内正常饲养，假手术组仅切开头皮和颅骨开窗，不撞击；

第四步，对高原颅脑损伤的小鼠予以l-丝氨酸治疗：治疗组在手术半小时后腹腔注射l-丝氨酸给药，l-丝氨酸给药量为342ml/kg，每天两次，连给3天；

第五步：建立小鼠高原颅脑损伤模型后第1天开始，进行行为学测试，行为学测试方法为：rotarodtest转杆实验，beamwalkingtest平衡木试验,corner转角实验。

l-丝氨酸对小鼠感觉运功功能的影响

rotarodtest转杆实验，beamwalkingtest平衡木试验,corner转角实验主要检测动物的感觉运动能力，图3中a为转杆实验图，记录小鼠从转杆掉落下去的潜伏期；b为平衡木实验图，记录小鼠在平衡木上错步数；c为转角实验图，记录小鼠遇到角落处向左转次数，可以看出在连续3天测试内注射l-丝氨酸可改善高原创伤性脑外伤小鼠运动感觉功能。高原tbi模型组与sham组相比，高原损伤组感觉运动能力均有所下降，经l-丝氨酸治疗后，感觉运动能力有显著提高。

实施例2：

l-丝氨酸在预防或治疗高原颅脑损伤中的应用，步骤为：

第一步，建立小鼠高原模型：通过将c57bl/6小鼠放入低压氧舱，模拟海拔4000m进行模拟高原培养，低压氧舱内压力为-39.7kpa；

第二步，对高原培养后小鼠麻醉：3天后将小鼠从低压氧舱拿出，腹腔注射麻醉剂将小鼠麻醉，将麻醉后的小鼠固定在脑立体定位仪上，麻醉剂采用质量分数10%的水合氯醛，麻醉剂量为0.01ml/kg；

第三步，建立小鼠高原颅脑损伤模型：消毒并切开小鼠头皮，暴露前囟，确定前囟位置，以前囟前1.5mm，中线右侧旁开1.5mm处为中心，以牙科钻开一直径为3mm的骨窗，骨窗中心区域为额顶叶交界处的感觉运动混合皮层，充分暴露硬脑膜，并保持硬脑膜外形完整，注意止血，打开tbi-0310颅脑损伤仪，设定参数，撞击速度：3.5m/s，撞击深度：1.5mm，撞击停留时间：150ms，然后撞击开骨窗处位置，撞击过程中注意及时止血，撞击完成后缝合头皮，术后将小鼠置于ivc鼠笼内正常饲养，假手术组仅切开头皮和颅骨开窗，不撞击；

第四步，对高原颅脑损伤的小鼠予以l-丝氨酸治疗：治疗组在手术半小时后腹腔注射l-丝氨酸给药，l-丝氨酸给药量为342ml/kg，每天两次，每天两次，连给3天；

第五步：建立小鼠高原颅脑损伤模型后第三天开始取脑组织进行形态学检测，形态学检测方法为快蓝染色，免疫组织化学荧光。

l-丝氨酸对小鼠白质修复的影响

如图4所示，不同倍镜下快蓝染色情况，通过快蓝染色发现，在给予l-丝氨酸治疗后，小鼠白质区域蓝色程度显著深于高原tbi组，说明l-丝氨酸342mg/kg的药物剂量对小鼠白质损伤后具有有效的修复作用。

实施例3：

l-丝氨酸在预防或治疗高原颅脑损伤中的应用，步骤为：

第一步，建立小鼠高原模型：通过将c57bl/6小鼠放入低压氧舱，模拟海拔4000m进行模拟高原培养，低压氧舱内压力为-39.7kpa；

第二步，对高原培养后小鼠麻醉：3天后将小鼠从低压氧舱拿出，腹腔注射麻醉剂将小鼠麻醉，将麻醉后的小鼠固定在脑立体定位仪上，麻醉剂采用质量分数10%的水合氯醛，麻醉剂量为0.01ml/kg；

第三步，建立小鼠高原颅脑损伤模型：消毒并切开小鼠头皮，暴露前囟，确定前囟位置，以前囟前1.5mm，中线右侧旁开1.5mm处为中心，以牙科钻开一直径为3mm的骨窗，骨窗中心区域为额顶叶交界处的感觉运动混合皮层，充分暴露硬脑膜，并保持硬脑膜外形完整，注意止血，打开tbi-0310颅脑损伤仪，设定参数，撞击速度：3.5m/s，撞击深度：1.5mm，撞击停留时间：150ms，然后撞击开骨窗处位置，撞击过程中注意及时止血，撞击完成后缝合头皮，术后将小鼠置于ivc鼠笼内正常饲养，假手术组仅切开头皮和颅骨开窗，不撞击；

第四步，对高原颅脑损伤的小鼠予以l-丝氨酸治疗：治疗组在手术半小时后腹腔注射l-丝氨酸给药，l-丝氨酸给药量为342ml/kg，每天两次，连给3天；

第五步：建立小鼠高原颅脑损伤模型后第三天开始取脑组织进行免疫组织化学荧光。

l-丝氨酸对小鼠脑组织小胶质细胞的影响

如图5-7所示，经过l-丝氨酸注射后，小胶质细胞胞体变小，恢复到空白对照组时的形态，改善由高原颅脑损伤后引起的小胶质细胞活化，如图5所示：皮层，纹状体处假手术组，tbi组及l-丝氨酸给药组后小胶质细胞变化情况，在正常脑组织中，绿色荧光标记的小胶质细胞数目较少，胞体较小，呈分支状或杆状。如图6所示：皮层，纹状体区小胶质细胞数量的统计，如图7所示：假手术组，tbi组及l-丝氨酸给药组后tnf-α，il-1βmrna表达情况统计图。