本发明涉及一种基于透皮吸收提取分离木芙蓉叶中有效成分的方法，该方法可应用于生物医药等领域。
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：木芙蓉叶别名拒霜叶、芙蓉花叶、铁箍散，为锦葵科植物木芙蓉的叶片，气微，味微辛。夏、秋二季，剪下叶片，晒干。须经常复晒，存放干燥通风处。炮制时除去杂质，喷淋清水，稍润，切丝或切碎，干燥或研粉。木芙蓉为落叶灌木或小乔木，高2～5m，茎、叶、果柄、小苞片和花萼上均密被星状毛和短柔毛。茎圆柱形。叶互生，卵圆状心形。花大，直径约8cm。蒴果扁球形，果瓣5，密生淡黄色棉毛。种子多数，肾形，背部有长毛。花期8～10月，果期9～11月。木芙蓉叶饮片叶多卷缩、破碎，全体被毛。完整叶片展平后呈卵圆状心形，宽10～20cm，掌状3～7裂，裂片三角形，边缘有钝齿。上表面暗黄绿色，下表面灰绿色，叶柄长5～20cm。气微，味微辛。木芙蓉叶性平，味辛，归肺经、肝经。有凉血，解毒，消肿，止痛的疗效。用于治疗痈疽，烫伤，目赤肿痛，跌打损伤等。可外用，研末调敷或捣敷。木芙蓉叶的主要成分为黄酮和甾醇类。在民间，将木芙蓉叶捣烂外敷治疗乳腺炎具有良好的疗效，并在临床上也得到了运用，且疗效显著。药理研究表明，木芙蓉叶提取物具有明显的非特异性抗炎作用，其有效组分为黄酮类。木芙蓉叶中黄酮类的主要成分为芦丁、金丝桃苷等。透皮给药系统是指经皮肤表面给药，使药物以恒定速度(或接近恒速)通过皮肤，经毛细血管吸收进入体循环而产生全身或局部治疗作用的一类给药系统。与传统的给药方式相比，透皮吸收制剂具有避免肝脏首过效应及肠胃灭活、维持恒定的血药浓度或药理效应、降低药物不良反应、患者可以自主用药等特点，因此透皮给药系统具有良好的应用前景；药物透皮给药系统能以恒定的速率通过皮肤吸收进入血液而维持血药浓度恒定，故可避免口服或注射等给药途径因血药峰浓度产生的不良反应；应用透皮给药系统时患者即使出现中毒征兆也可以随时自行中止给药，可避免不良反应进一步产生。但皮肤为人体与外界环境间优良屏障，仅有极少数药物透皮吸收速率能达到产生全身治疗作用的血药浓度。提高药物透皮吸收速率最常用策略是在制剂中加入透皮吸收促进剂。目前对木芙蓉叶中黄酮类化合物的提取主要通过乙醇加热回流法、碱提酸沉法和微波辅助提取法。cn101716199a公开了一种一种从木芙蓉叶中提取黄酮类化合物的方法，将木芙蓉叶与固相试剂按质量比1∶0.05～2混合，研磨至所得粉末粒度分析结果的d90为10～200μm，然后加水充分搅拌，离心，取上清液加酸调ph值至1.0～6.0，然后浓缩至生药含量为0.1-1.0g木芙蓉叶/ml，过大孔树脂，水洗后用75wt％乙醇水溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，乙醇洗脱液浓缩、干燥得到木芙蓉叶黄酮提取物；所述的木芙蓉叶为木芙蓉叶的碎片。传统木芙蓉叶提取分离方法是直接将木芙蓉叶用化学试剂提取，但是木芙蓉叶外用的功效大多源于产品配方中某些成分的生化特性，而在透皮之后皮肤能吸收多少有效成分，是否能达到预期的作用与功效，这些都不得而知。本发明采用机械化学技术提取黄酮类化合物，产品收率和纯度高，技术工艺简单、生产周期短、环境友好，是一条具有广泛工业化前景的提取分离路线。技术实现要素：针对目前体外木芙蓉叶有效成分直接采用溶剂对木芙蓉叶进行提取存在的与人体消化吸收真实体系差异性较大的问题；本发明的目的在于提供一种环境友好、收率高、工艺简单的透皮吸收提取新方法，该新方法建立一种基于皮肤表层的提高木芙蓉叶有效成分的新提取分离方法，模拟人体表皮皮肤，分离出易被皮肤吸收的成分，提高药物有效成分透皮吸收率。为了实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：一种基于透皮吸收技术提取木芙蓉叶有效成分的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：步骤1)凝胶膏剂的制备:称取木芙蓉叶提取物，粉碎成细粉，加入到含edta的卡波姆溶液中，混匀，加入聚丙烯酸钠，甘羟铝和甘油的混合液，搅拌均匀，加入适量柠檬酸溶液，搅拌均匀，得木芙蓉叶提取物凝胶；步骤2)木芙蓉叶提取物的透皮吸收试验：将猪皮进行预处理后作为透皮屏障，以乙醇-生理盐水为透皮吸收液，将凝胶剂涂于处理好的猪皮角质层，注满透皮吸收液，液面恰与皮肤真皮层接触，排除气泡，进行透皮吸收试验，获得透过液。在本发明一些实施方式中，按照重量百分比计，凝胶膏剂的原料为：木芙蓉叶提取物5～10％，丙二醇1～5％，卡波姆1～10％，聚丙烯酸钠(np-700)1～5％，edta1～5％，柠檬酸0.1～1％，甘油15～40％，甘羟铝1～5％，余量为蒸馏水，总量为100％。在本发明一些实施方式中，按照重量百分比计，凝胶膏剂的原料为：木芙蓉叶提取物7％，丙二醇3％，卡波姆5％，聚丙烯酸钠3％，edta2％，柠檬酸0.4％，甘油35％，甘羟铝2％，余量为蒸馏水，总量为100％。在本发明一些实施方式中，所述猪皮预处理是指用于生理盐水中浸泡处理30min。在本发明一些实施方式中，于恒温37℃，恒速3800r/min的条件下进行透皮吸收试验。在本发明一些实施方式中，所述猪皮预处理是指用剪刀将猪皮剪成5cm*5cm大小，然后于生理盐水中浸泡处理30min。在本发明一些实施方式中，所述的木芙蓉叶提取物通过以下方法制备：将木芙蓉叶采用乙醇溶液提取，过滤、滤液浓缩、蒸发至膏状，干燥至恒重。基于以上方法，本发明获得一种透过液，进一步地，本发明提供的上述透过液可以用于制备抗炎药物。具体实施方式以下结合具体实施例对本发明作具体的介绍。一、主要材料和仪器1、仪器：ryj－6a，体外透皮吸收扩散仪上海黄海药检；di-one×p680高效液相色谱仪，美国戴安公司，pda-100二极管矩阵检测器、chromeleon色谱工作站；远红外快速恒温干燥箱，上海跃进医疗器械厂；ab204-n分析天平，梅特勒托利多有限公司；es-300a电子天平，长沙湘平科技发展有限公司，精密度：0.01mg；2、药品与试剂木芙蓉叶，河北省保定市祁州药材堂；丙二醇，天津市富宇精细化工有限公司；氮酮,西亚试剂公司；薄荷脑,广州市博亚精细化工有限公司；乙二胺四乙酸,edta，天津市致远化学试剂有限公司；卡波姆940,lubrizol化工有限公司；聚丙烯酸钠(np-700)，美国国际特品公司；甘羟铝，kyowa化工有限公司；甘油，天津市富宇精细化工有限公司；皮肤的制备，猪耳朵从本地屠宰场购买。家猪杀死后，开水浸泡前立即割下耳朵，在耳朵脸外侧剃去毛,用植皮刀取厚约600μm的耳皮，－20℃冷冻保存，2周内用完。木芙蓉叶提取物的制备：精确称取木芙蓉叶30.00g剪碎，置索氏提取器中，用6倍量80％乙醇在80℃左右水浴中冷藏回流2h，过滤，收集滤液，回收的滤渣用6倍量80％乙醇以相同方法提取2次，2h/次，收集滤液。合并3次收集的滤液；置旋转蒸发仪中进行浓缩，温度控制在65℃左右，浓缩至约150ml时将提取物移至蒸发皿，置水浴上继续蒸发至膏状，再置干燥箱中，干燥至恒重。实施例1木芙蓉叶提取物水溶液原料：按照重量百分比计，木芙蓉叶提取物7％，余量为蒸馏水，总量为100％；制备方法：将木芙蓉叶提取物加入蒸馏水使其成为水匀浆。透皮吸收：用猪皮模拟人体表皮皮肤，猪皮用剪刀将猪皮剪成5cm*5cm大小，然后于生理盐水中浸泡处理30min后，作为透皮屏障，以30％乙醇-生理盐水为透皮吸收液，试验时，将精密称量的木芙蓉叶提取物水溶液涂于处理好的猪皮角质层，注满透皮吸收液，液面恰与皮肤真皮层接触，排除气泡。于恒温37℃，恒速3800r/min的条件下进行透皮吸收试验。在1h、2h、4h、8h、12h、24h各取样点用洁净针筒分别移取2ml透过液，再用洁净针筒补充2ml30％乙醇-生理盐水。实施例2木芙蓉叶提取物凝胶1凝胶制备原料：按照重量百分比计，木芙蓉叶提取物7％，丙二醇3％，卡波姆5％，聚丙烯酸钠(np-700)3％，edta2％，柠檬酸0.4％，甘油35％，甘羟铝2％，余量为蒸馏水，总量为100％。凝胶制备方法：称取木芙蓉叶提取物，粉碎成细粉，加入到含edta的卡波姆溶液中，混匀，加入np-700，甘羟铝和甘油的混合液，搅拌均匀，加入适量柠檬酸溶液，搅拌均匀，得木芙蓉叶提取物凝胶；透皮吸收实验：用猪皮模拟人体表皮皮肤，猪皮用剪刀将猪皮剪成5cm*5cm大小，然后于生理盐水中浸泡处理30min后，作为透皮屏障，以30％乙醇-生理盐水为透皮吸收液，试验时，将精密称量的凝胶剂涂于处理好的猪皮角质层，注满透皮吸收液，液面恰与皮肤真皮层接触，排除气泡；于恒温37℃，恒速3800r/min的条件下进行透皮吸收试验。在1h、2h、4h、8h、12h、24h各取样点用洁净针筒分别移取2ml透过液，再用洁净针筒补充2ml30％乙醇-生理盐水。实施例3木芙蓉叶提取物凝胶2凝胶制备原料：木芙蓉叶提取物8％，氮酮3％，卡波姆5％，聚丙烯酸钠3％，edta2％，柠檬酸0.4％，甘油34％，甘羟铝2％，余量为蒸馏水，总量为100％。凝胶制备方法：称取木芙蓉叶提取物，粉碎成细粉，加入到含edta的卡波姆溶液中，混匀，加入np-700，甘羟铝和甘油的混合液，搅拌均匀，加入适量柠檬酸溶液，搅拌均匀，得木芙蓉叶提取物凝胶。透皮吸收：用猪皮模拟人体表皮皮肤，猪皮用剪刀将猪皮剪成5cm*5cm大小，然后于生理盐水中浸泡处理30min后，作为透皮屏障，以30％乙醇-生理盐水为透皮吸收液，试验时，将精密称量的凝胶剂涂于处理好的猪皮角质层，注满透皮吸收液，液面恰与皮肤真皮层接触，排除气泡。于恒温37℃，恒速3800r/min的条件下进行透皮吸收试验。在1h、2h、4h、8h、12h、24h各取样点用洁净针筒分别移取2ml透过液，再用洁净针筒补充2ml30％乙醇-生理盐水。实施例4木芙蓉叶提取物凝胶3凝胶制备原料：木芙蓉叶提取物9％，薄荷脑2％，卡波姆5％，聚丙烯酸钠3％，edta2％，柠檬酸0.4％，甘油33％，甘羟铝2％余量为蒸馏水，总量为100％。凝胶制备方法：称取木芙蓉叶提取物，粉碎成细粉，加入到含edta的卡波姆溶液中，混匀，加入np-700，甘羟铝和甘油的混合液，搅拌均匀，加入适量柠檬酸溶液，搅拌均匀，得木芙蓉叶提取物凝胶。透皮吸收：用猪皮模拟人体表皮皮肤，猪皮用剪刀将猪皮剪成5cm*5cm大小，然后于生理盐水中浸泡处理30min后，作为透皮屏障，以30％乙醇-生理盐水为透皮吸收液，试验时，将精密称量的凝胶剂涂于处理好的猪皮角质层，注满透皮吸收液，液面恰与皮肤真皮层接触，排除气泡。于恒温37℃，恒速3800r/min的条件下进行透皮吸收试验。在1h、2h、4h、8h、12h、24h各取样点用洁净针筒分别移取2ml透过液，再用洁净针筒补充2ml30％乙醇-生理盐水。试验例1对比实施例1～4获得透过液的累积透皮量，如表1所示；累积渗透率q的计算：单位面积平均累积透皮量：q(mg·cm-2)＝(mn+∑mp)/a透皮扩散面积：s＝2.80cm2；接收池体积：v＝6.5ml式中q为t时刻的累积透过量(μg·cm-2)；mn为第n个取样点测得的药物透过量(μg)；∑mp为之前测得的药物透过量之和(μg)；a为皮肤扩散面积。以累积渗透量q(μg·cm-2)为纵坐标，时间t(min)为横坐标作图，可以得到药物的累积渗透曲线。将累积渗透量q对时间t进行回归，所得线性方程的斜率即为该条件下药物的稳态透皮速率j(μg·cm-2·h-1)。不同透皮吸收剂木芙蓉叶提取物累积透皮量q(μg/cm2)4h8h12h木芙蓉叶提取物水溶液200.90±36.80554.39±4.71858.48±33.98木芙蓉叶提取物凝胶1310.23±10.241334.50±31.801637.64±5.63木芙蓉叶提取物凝胶2337.48±12.711471.32±56.431697.94±21.73木芙蓉叶提取物凝胶3315.98±65.231289.29±18.241591.94±33.98相较于传统的木芙蓉叶提取分离方法，本实施例采用经过透皮吸收之后的透过液，其更有利于皮肤吸收。试验例2功效性验证选取小鼠或者人体体外进行动物实验或者体外实验，将实施例1～4获得的透过液进行炎症治疗试验；动物：spf级icr小鼠，雄性，12～14g，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，生产许可证号：scxk(沪)2017-0005。试剂：巴豆油(biobasicinc.，lj0406b1010j)；一氧化氮测试盒(上海源叶生物科技有限公司)；小鼠tnf-α，il-6elisa试剂盒(上海源叶生物科技有限公司)小鼠60适应性喂养3d后，随机分为6组:正常对照组、模型对照组、醋酸氟轻松乳膏组、实施例1透过液组，实施例2透过液组，实施例3透过液组，实施例4透过液组；每组10只；除正常对照组外其余各组均用巴豆油20μl/只涂于右耳，分别于致炎后1h、1.5h、2h、2.5h、3h、3.5h给药1次；正常对照组和模型对照组右耳廓涂以蒸馏水30μl/只，醋酸氟轻松乳膏组涂以醋酸氟轻松乳膏30mg/只，其余各组分别涂以相应药物30μl/只或者30mg/ul，致炎后4小时摘除眼球取血，随后脱颈椎处死小鼠，剪下耳廓，8mm打孔器切下左右耳片，称重，用左右耳片重量差表示耳肿胀度，以(模型组平均肿度-给药组平均肿胀度)/模型组平均肿胀度×100％，计算耳肿胀度抑制率。称重后耳片立即投入福尔马林液或多聚甲醛固定备用；血液放置1小时后，3500rpm离心15min，取血清，用硝酸还原酶法检测血清no含量，elisa法检测血清tnf-α、il-6含量。木芙蓉叶提取物猪皮透过液对巴豆油所致幼龄小鼠耳廓肿胀的影响；与正常对照组比较，模型对照组幼龄小鼠耳廓肿胀明显；与模型对照组相比，各给药组幼龄小鼠耳廓肿胀度明显减轻，结果见表1。表1木芙蓉叶提取物猪皮透过液对幼龄小鼠耳廓肿胀的影响(x±s，n＝10)组别剂量耳肿胀度(mg)正常对照30μl/只0.0±0.8＊＊模型对照30μl/只16.4±3.1醋酸氟轻松乳膏30mg/只5.1±1.6＊＊实施例1透过液30μl/只10.5±2.1＊实施例2透过液30μl/只6.8±1.4＊＊实施例3透过液30μl/只6.2±1.7＊＊实施例4透过液30μl/只7.1±1.8＊＊进一步地，本实施例还关注木芙蓉叶提取物猪皮透过液对巴豆油所致耳廓肿胀幼龄小鼠血清no含量的影响；与正常对照组相比，模型对照组幼龄小鼠血清no含量显著上调；与模型对照组相比，各给药组幼龄小鼠血清no含量明显降低，结果见表2。表2木芙蓉叶提取物猪皮透过液对幼龄小鼠血清no含量的影响(x±s，n＝10)此外，本实施还关注木芙蓉叶提取物猪皮透过液对巴豆油所致耳廓肿胀幼龄小鼠血清tnf-α、il-6含量的影响；正常对照组相比，模型对照组幼龄小鼠血清tnf-α、il-6含量显著上调。与模型对照组相比，各给药组幼龄小鼠血清tnf-α、il-6含量明显降低，结果见表3。表3木芙蓉叶提取物猪皮透过液对幼龄小鼠血清tnf-α、il-6含量的影响(x±s，n＝10)组别剂量tnf-a(pg/ml)il-6(pg/ml)正常对照30μl/只51.7±14.9＊＊32.6±7.9＊＊模型对照30μl/只215.6±33.771.6±17.3醋酸氟轻松乳膏30mg/只133.1±31.2＊＊43.1±11.7＊＊实施例1透过液30μl/只174.5±29.4＊56.5±13.4＊实施例2透过液30μl/只126.8±25.3＊＊38.8±12.3＊＊实施例3透过液30μl/只132.2±37.7＊＊44.2±13.7＊＊实施例4透过液30μl/只141.1±34.9＊＊41.1±14.5＊＊本发明通过在体外模拟人体表皮皮肤，以分离出易被皮肤吸收的成分。具体而言，本发明建立了一种基于皮肤表层的提高木芙蓉叶有效成分的新提取分离方法，模拟人体表皮皮肤，分离出易被皮肤吸收的成分，提高药物有效成分透皮吸收率。当前第1页1 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