一种食源性纳米粒子蛋白冠的制备方法与流程

本发明涉及新型食源性纳米材料蛋白冠制备及生物医药应用技术领域，更具体地说，涉及一种食源性纳米粒子蛋白冠的制备方法。

背景技术：

烤制食品具有诱人的色泽和鲜美的口感，是人们日常生活中的一道美味菜肴，千百年来一直深受消费者的喜爱。近年来研究者报道了在烤制食品中发现了碳纳米粒子，如在烤面包、烤牛肉、烤鸭以及烤羊肉串等涉及到热加工的食物，这些碳纳米粒子多是无定形态，粒径在1～20nm左右。碳纳米粒子具有一系列优异的物理及化学性质，如表面效应、量子尺寸效应、量子隧道效应、良好的水溶性、发光稳定性等。因此，碳纳米粒子在生物成像、生物传感、药物载体及光催化等众多领域表现出良好的应用前景，引起了人们的广泛关注，使其研究得到了飞速发展。

碳纳米粒子表面存在丰富的带电荷官能团，如氨基，羧基等，这使其可以通过共价接枝或者静电相互作用与蛋白质结合，其表面吸附的一层或多层蛋白所组成的结构称为蛋白冠，蛋白冠的形成取决于纳米材料的大小、化学成分和表面基团。碳纳米粒子的吸附会对某些蛋白分子本身的结构甚至是功能造成一定影响。更重要地，碳纳米粒子吸附蛋白后常改变碳纳米粒子原有的粒径、分散性及表面电荷等，降低碳纳米粒子本省的毒性和改变生物相容性。

目前制备蛋白冠的碳纳米粒子一般采用水热合成法、电弧放电法合成法、高温高压法、电化学扫描法以及有机物热解法等方法制得，这些方法制备的碳纳米粒子具有抑制细胞增长的风险，为碳纳米粒子的应用带来了一定的挑战。

技术实现要素：

本发明针对烤制食品中产生的纳米粒子的安全性存在风险等问题，提出了一种食源性纳米粒子蛋白冠制备方法。本研究采用食源性纳米粒子与人血清白蛋白相互作用形成蛋白冠，有效地减低食源性纳米粒子本身的毒性，能够作为载体应用于生物医药领域，可以为评价食源性纳米粒子形成蛋白冠的安全性提供理论依据。

为了达到上述目的，本发明提供一种食源性纳米粒子蛋白冠制备方法，包括如下步骤：

s1：浸提：取烤鱼，浸泡于无水乙醇中，700～900w超声1～4h，静置1～2h，取上清液；所述烤鱼和无水乙醇的重量体积比为1:1～1:5g/ml；

s2、去除有机溶剂：将步骤s1所述上清液置于60～80℃旋转蒸发至所述上清液体积的1/8～1/10，得混合液；

s3、脱脂：向步骤s2所述混合液中加入其1～3倍体积的三氯甲烷水溶液(v水/v三氯甲烷＝2:1)；使用分液漏斗充分摇匀分液，除去下层三氯甲烷层，得到上层水溶性纳米粒子粗提液；

s4：纯化：将步骤s3所述纳米粒子粗提液置于60～80℃、旋转蒸发至所述纳米粒子粗提液原体积的1/8～1/10，得纳米粒子浓缩液；将所述纳米粒子浓缩液过半制备液相色谱层析，检测器为荧光检测器，荧光光谱激发波长为380nm，发射波长为400～500nm；收集荧光部分，真空冷冻干燥，得到食源性纳米粒子；

s5：食源性纳米粒子蛋白冠制备：采用无血清高糖培养基配制纳米粒子溶液和血清蛋白溶液；取所述纳米粒子溶液和所述血清蛋白溶液混匀，静置10～30min，所得混合液即为食源性纳米粒子蛋白冠；所述血清蛋白与纳米粒子摩尔比为1:90～1:110；其中，所述纳米粒子的分子量为1056m/z。

优选方式下，步骤s1所述烤鱼为烤三文鱼，其制备方法为：取三文鱼置于180℃～220℃烤制30～60min；

优选方式下，步骤s2所述旋转蒸发的转速为50～70rpm。

优选方式下，步骤s4所述半制备液相色谱条件为：ods-bp色谱柱，ods-bp填料粒径为10μm，色谱柱内径为20mm，长度为300mm，流动相为体积分数为5％～20％(v/v)甲醇水溶液，所述纳米粒子浓缩液的上样量为5～10ml，流速为16～20ml/min，洗脱时间为90～150min。

优选方式下，步骤s4所述旋转蒸发的转速为50～70rpm；所述真空冷冻干燥的参数为：-50～60℃，真空度为1～10pa，干燥10～24h。

优选方式下，步骤s5所述血清蛋白为人血清白蛋白。

优选方式下，所述食源性纳米粒子蛋白冠制备方法，包括如下步骤：

s1、浸提：500g三文鱼经过200℃烤制50min，将烤制的三文鱼浸泡于1500ml的无水乙醇中，800w超声浸提2h，静置1h，取上清液；

s2、去除有机溶剂：将步骤s1所述上清液置于70℃、60rpm旋转蒸发至150ml，得混合液；

s3、脱脂：向步骤s2所述混合液中加入三氯甲烷水溶液300ml，通过分液漏斗充分震荡，去除下层三氯甲烷，得到水相纳米粒子粗提液30ml；所述三氯甲烷水溶液由水和三氯甲烷按体积比为2:1混合而成；

s4：纯化：将步骤s3所述水相纳米粒子粗提溶液于70℃，60rpm旋转蒸发，浓缩至3ml，得纳米粒子浓缩液；经过依利特半制备液相色谱进行纯化，ods-bp色谱柱，填料粒径为10μm，色谱柱内径为20mm，长度为300mm，流动相为体积分数10％(v/v)的甲醇水溶液，上样品为5ml纳米粒子浓缩液，流速为18ml/min，洗脱时间为120min，荧光光谱激发波长为380nm，发射波长为400～500nm，收集荧光部分，在-50℃，真空度为10pa下冷冻干燥24h，得到食源性纳米粒子；

s5：食源性纳米粒子蛋白冠制备：取步骤s4所述食源性纳米粒子，采用无血清高糖培养基配制成食源性纳米粒子浓度为1mol/l的纳米粒子溶液；取人血清白蛋白，使用无血清高糖培养基配置成人血清白蛋白浓度为1×10^-5mol/l的人血清白蛋溶液；取所述纳米粒子溶液2μl加入到2ml所述血清蛋白溶液中，混匀，静置20min，所得混合液即为食源性纳米粒子蛋白冠；其中，所述血清蛋白与纳米粒子摩尔比为1:100，所述纳米粒子的分子量为1056m/z。

本发明的有益效果是：

本发明提供了一种食源性纳米粒子蛋白冠制备方法，本发明通过烤鱼的方法获得食源性纳米粒子，由于纳米粒子表面存在丰富的官能团，可以和血清蛋白形成蛋白冠，降低食源性纳米粒子本身的毒性，所述蛋白冠可以作为载体应用于生物医药领域。

本发明中纳米粒子来源于食品热加工过程中产生的纳米粒子，具有安全性高，水溶性好，生物相容性好等优点。本发明首次采用食源性纳米粒子与蛋白质相互作用形成蛋白冠，从而降低纳米粒子的毒性，将为食源性碳纳米粒子蛋白冠作为载体在生物医药领域的应用打下基础。

综上所述，本发明制备的食源性纳米粒子蛋白冠可作为载体，在药物、食品功能因子、营养物质小分子等众多生物医药方向具有优异的应用，为研究食品热加工中食源性纳米粒子蛋白冠的载运功能提供理论基础。

附图说明:

图1为本发明实施例1中制备的食源性纳米粒子的透射电镜图；

图2为本发明实施例1中制备的食源性纳米粒子的粒径分布图；

图3为本发明实施例1中制备的人血清白蛋白和蛋白冠的荧光光谱图；

图4为本发明实施例1中大鼠肾细胞在无血清高糖培养基配制的食源性纳米粒子浓度为1×10^-3mol/l的纳米粒子溶液孵育12h的相位对比图；

图5为大鼠肾细胞在本发明实施例1制备的1×10^-3mol/l的食源性纳米粒子蛋白冠孵育12h的相位对比图；

图6为本发明实施例1中大鼠肾细胞在无血清高糖培养基配制的食源性纳米粒子浓度为1×10^-3mol/l的纳米粒子溶液孵育12h的细胞凋亡检测结果；

图7为大鼠肾细胞在本发明实施例1制备的1×10^-3mol/l的食源性纳米粒子蛋白冠孵育12h的细胞凋亡检测结果。

具体实施方式

以下通过具体实施例对发明作进一步说明，而不是对本发明的限制。

下述实施例使用的人血清白蛋白为北京索莱宝科技有限公司，货号a8230；所述青霉素-链霉素为hycone公司，货号sv30010；所述无血清高糖培养基为bi公司，货号06-1055-57-1acs。

实施例1：

500g三文鱼经过200℃烤制50min，将烤制的三文鱼浸泡于1500ml的无水乙醇中，800w超声浸提2h，静置1h，取上清液；将所述上清液置于70℃、60rpm旋转蒸发至150ml，得混合液；向所述混合液中加入三氯甲烷水溶液300ml复溶(所述三氯甲烷水溶液中，水和三氯甲烷的体积比为2:1)，通过分液漏斗充分震荡，然后去除三氯甲烷，得到水相纳米粒子粗提液30ml；将所述水相纳米粒子粗提溶液于70℃，60rpm旋转蒸发，浓缩至3ml，得纳米粒子浓缩液；经过依利特半制备液相色谱进行纯化，ods-bp色谱柱，填料粒径为10μm，色谱柱内径为20mm，长度为300mm，流动相为体积分数10％(v/v)甲醇水溶液，上样品为5ml纳米粒子浓缩液，流速为18ml/min，洗脱时间为120min，荧光光谱激发波长为380nm，发射波长为400～500nm，收集荧光部分，在-50℃，真空度为10pa下冷冻干燥24h，得到食源性纳米粒子；

采用无血清高糖培养基(bi公司，货号06-1055-57-1acs)，分别配制成人血清白蛋白浓度为1×10^-5mol/l的人血清白蛋溶液和食源性纳米粒子浓度为1mol/l的纳米粒子溶液；取所述1mol/l纳米粒子溶液2μl，加入到所述2ml1×10^-5mol/l人血清白蛋白溶液中(所述人血清白蛋白与纳米粒子摩尔比1:100，纳米粒子终浓度为1×10^-3mol/l)，充分混匀，静置20min，所得混合液即为食源性纳米粒子蛋白冠。

取1mg本实施例制备的食源性纳米粒子配成1mg/ml水溶液，滴到超薄碳膜中，采用透射电镜观察纳米粒子的形貌，如图1所示，纳米粒子呈现球状，粒径分布在1.5～3.9nm，平均粒径大小为2.67±0.36nm(图2)。

如图3所示，1×10^-5mol/l的人血清白蛋白与本实施例制备的蛋白冠比较，荧光强度明显降低，最大发射波长由338nm变为350nm，说明纳米粒子与人血清白蛋白结合形成蛋白冠。

采用无血清高糖培养基配制食源性纳米粒子浓度为1×10^-3mol/l的纳米粒子溶液；将大鼠肾细胞以每孔1×10⁵个细胞接种于12孔板中(每孔加1ml含1％(v/v)青霉素-链霉素和10％(v/v)胎牛血清的高糖培养基)，并在含有5％co2的培养箱中37℃培养24h，弃去原培养基(即含1％(v/v)青霉素-链霉素和10％(v/v)胎牛血清的高糖培养基)；加入1ml无血清高糖培养基配制1×10^-3mol/l的纳米粒子溶液，并在含有5％co2的培养箱中37℃培养12h(图4)后，球形细胞的个数明显增加，表明纳米粒子促进了细胞黏附性丧失和造成部分细胞损伤。然而，将大鼠肾细胞以每孔1×10⁵个细胞接种于12孔板中(每孔加1ml含1％(v/v)青霉素-链霉素和10％(v/v)胎牛血清的高糖培养基)，并在含有5％co2的培养箱中37℃培养24h，弃去原培养基(即含1％(v/v)青霉素-链霉素和10％(v/v)胎牛血清的高糖培养基)，加入1ml本实施例制备的食源性纳米粒子蛋白冠溶液，并在含有5％co2的培养箱中37℃孵育12h(图5)，球形细胞数量显著减少，可能是因为人血清白蛋白与纳米粒子形成蛋白冠后减缓了纳米粒子的毒性。

进一步通过流式细胞术对细胞凋亡分析，选择488nm和535nm俩通道进行检测，验证蛋白冠是否对纳米粒子减轻了细胞毒性。如图6所示，在含有1×10^-3mol/l纳米粒子的无血清高糖培养基中，大鼠肾细胞细胞存活率为81.35％，晚期凋亡率为11.25％，坏死率为6.36％；而本实施例制备的食源性纳米粒子蛋白冠处理的活细胞比例为90.74％，晚期凋亡率为4.60％，坏死率为3.91％(图7)，明显低于单独纳米粒子处理的凋亡率，这说明本发明制备的食源性纳米粒子蛋白冠在减轻纳米粒子的细胞毒性方面具有明显的作用。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。