马钱苷元在制备自身免疫性肝炎防治药物中的用途的制作方法

1.本发明属于医药领域，涉及马钱苷元的医药用途，具体涉及马钱苷元在制备自身免疫性肝炎防治药物中的用途。


背景技术：

2.自身免疫性肝炎是一种特异或非特异性自身抗原表达所引起的肝组织损伤，是一种病因不明的肝脏慢性炎症性疾病。本病的临床特点是肝功能损害、血浆免疫球蛋白增高、血循环中存在多种自身抗体等，但自身免疫性肝炎与其它肝脏病如原发性胆汁性肝硬化(pbc)、原发性硬化性胆管炎(psc)等自身免疫性肝病在临床表现、生化、免疫及组织学变化等方面常常有交叉重叠，使得自身免疫性肝炎的临床诊断和治疗相当困难。1992年召开的国际自身免疫性肝炎会议，制定了有关aih的诊断标准：1.高丙种球蛋白血症；2.特异性自身抗体；3.女性易患；4.免疫抑制剂治疗有效；5.相关的背景是hla—dr3或dr4；6.除外嗜肝病毒感染引起的肝脏疾病。
3.现代医学一般常把免疫抑制剂作为aih的首选治疗药物，临床运用后能使aih缓解，症状改善，肝功能恢复，并减轻肝脏组织学损害，延缓病情进展至肝硬化，预防严重肝病并发症的发生，最终降低病死率。其中泼尼松(龙)单一治疗或加用硫唑嘌呤联合治疗已被广泛采用，并已公认为是aih的标准治疗。但免疫抑制剂有较多的副作用，长期应用尤为明显，所以，在治疗过程中应注意定期复查，预防并发症，以保证治疗的顺利进行。中医药在调节免疫、降酶、退黄、防治肝纤维化方面有良好的作用，具有多层次、多靶点、多途径的整体调控和综合治疗的优势。在临床实践中对激素治疗无效或不能耐受激素治疗的患者采用中医药治疗，取得了较好的疗效。
4.山茱萸(cornus oficinalis sieb.&zucc.)系山茱萸科山茱萸属的落叶乔木或灌木，广泛分布于山西、陕西、甘肃、山东、江苏、浙江、安徽、江西、河南、湖南等地，朝鲜、日本也有分布。其干燥成熟果肉即为中药山茱萸，又名萸肉、山萸肉等，收载于2010版《中国药典》。用于治疗眩晕耳鸣，腰膝酸痛，阳痿遗精，遗尿尿频，崩漏带下，大汗虚脱，内热消渴等。在临床上使用广泛，是六味地黄丸、知柏地黄丸、金匮肾气丸、左归丸、杞菊地黄丸、桂附地黄丸、益名地黄丸、济阴地黄丸等多种复方或成药的主要药味，是一味非常具有研究和开发价值的补益肝肾的药物。环烯醚萜苷是中药山茱萸的主要活性成分之一，其生物活性主要集中于免疫调节、降血糖、抗凝血、改善记忆等方面。通过系统的化学成分研究，目前已从中药山茱萸中发现环烯醚萜苷类化合物19个。
5.马钱苷(loganin)是中药山茱萸中环烯醚萜苷类的主要成分，也是六味地黄丸等发挥药理作用的主要有效成分之一，在药材中的含量为0.37％～1.22％，它具有免疫调节、抗炎、抗菌、镇咳、祛痰等作用，同时也是一些中成药的重要原料。
6.马钱苷元为马钱苷的苷元(loganetin)，结构如下：
[0007][0008]
peter j.houghton等采用常规柱色谱分离技术以desfontainia spinosa植物的叶片为原料提取得到马钱苷元(peter j.houghton.iridoids from desfostainia spinosa.phytochemistry,1985,24(8):1841-1842)。由于该方法操作繁琐，耗时长，价格昂贵，经济上并不可行。anupam maurya等优化了马钱苷元的制备方法，该方法以糖胶树为原料，采用快速离心分离色谱技术制备得到高纯度马钱苷元。该文献中公开了马钱苷元自身无抗菌活性，但与萘啶酸组合使用可明显降低对萘啶酸耐药和萘啶酸敏感的大肠杆菌菌株的最低抑菌浓度。马钱苷元可用于治疗多药耐药革兰氏阴性菌感染(anupam maurya.preparative isolation of bioenhancer loganetin from alstonia scholaris by fast centrifugal partition chromatography.separation science and technology,2014,49(5):773-777)。
[0009]
迄今为止，未见有关马钱苷元对自身免疫性肝炎防治作用或临床应用方面的研究。


技术实现要素：

[0010]
本发明的主要目的为提供马钱苷元在制备自身免疫性肝炎防治药物中的用途。
[0011]
具体地，马钱苷元能够纠正自身免疫性肝炎患者的免疫细胞因子紊乱，并能够降低自身免疫性肝炎患者的转氨酶的含量和肝脏指数。
[0012]
马钱苷元对自身免疫性肝炎大鼠的治疗作用的药效实施例结果显示：
[0013]
马钱苷元各剂量组均可以显著改善白细胞介素水平和γ-干扰素水平之间的比例失衡，具体表现在其可以显著升高白细胞介素2和γ-干扰素水平,降低白细胞介素4和白细胞介素6的水平，并且其在改善白细胞介素水平和γ-干扰素水平之间的比例失衡方面呈现剂量依赖性。
[0014]
马钱苷元对自身免疫性肝炎大鼠肝功能和肝脏指数的影响的药效实施例结果显示：
[0015]
(1)模型组大鼠血清alt、ast含量与正常组相比大幅度升高；各给药组的大鼠血清alt、ast含量与模型组相比显著下降(p<0.05或p<0.01)，均具有统计学意义，其中，马钱苷元对大鼠血清alt、ast含量的影响呈剂量依赖性关系，并且与泼尼松组相比有显著性差异(p<0.05或p<0.01)。
[0016]
(2)模型组大鼠肝指数与正常组相比有极显著性差异；各给药组的大鼠的肝指数与模型组相比有显著性差异(p<0.05或p<0.01)，均具有统计学意义，其中，马钱苷元对自身免疫性肝炎大鼠的肝脏指数影响呈剂量依赖关系，中、高剂量组泼尼松组相比有显著性差异或极显著性差异(p<0.05或p<0.01)，此结果表明：马钱苷元在对大鼠自身免疫性肝炎进
行治疗时，在降低肝脏指数方面显著优于现有治疗药物泼尼松。
[0017]
此外，马钱苷元对刀豆蛋白a所致小鼠急性免疫性肝损伤具有显著的治疗作用具体地，
[0018]
(1)与正常对照组相比，模型对照组小鼠血清alt、ast均显著升高；马钱苷元各给药组处理小鼠后，均能降低小鼠血清alt、ast，与模型对照组相比均具有统计学差异(p<0.05或p<0.01)，而马钱苷组虽然能降低大鼠血清alt、ast，降低幅度并不明显，与模型组相比无统计学意义。
[0019]
(2)马钱苷元对大鼠血清alt、ast的降低作用呈现剂量依赖关系，其中中、高剂量组与马钱苷组相比，具有显著差异(p<0.01)。
[0020]
本发明的另一目的为提供马钱苷元在治疗免疫性肝损伤时所用到的具体的药物制剂。
[0021]
优选地，在治疗免疫性肝损伤时马钱苷元所用的制剂为其口服制剂或注射制剂。
[0022]
其中，口服制剂为片剂、胶囊剂或颗粒剂，注射制剂由马钱苷元和药用辅料组成，所述的药物辅料为乙醇、丙二醇、peg400、peg600和吐温80中的一种或多种。此外，注射剂可用于皮下注射。
[0023]
马钱苷元的口服制剂或注射制剂的每一制剂单位中马钱苷元的含量为1—1000mg。
[0024]
所述的马钱苷元的人用剂量为0.01mg/kg/d-100mg/kg/d，在服用时，只需根据每单位具体制剂含有的药量调整服用量即可，这对本领域普通技术人员来说是容易实现的。
[0025]
本发明提供的技术方案与现有技术中治疗自身免疫性肝炎的方法具有如下优势：
[0026]
(1)本发明所述的马钱苷元用于自身免疫性肝炎治疗时疗效确切，不仅可以降低肝脏转氨酶含量和肝脏指数，更能调节淋巴细胞细胞因子之间的失衡，降低对肝组织的损伤，起到标本兼治的效果，具体表现为能够显著升高白细胞介素2和γ-干扰素水平，并能显著降低白细胞介素4和白细胞介素6的水平，从而从根源上治疗自身免疫性肝炎。
[0027]
(2)马钱苷元用于预防或治疗自身免疫性肝炎时价格低廉，质量控制简单方便，与现有的生物制剂相比成本低，可大幅度降低自身免疫性肝炎患者的治疗费用。
具体实施例
[0028]
为了使本领域技术人员充分了解本发明，以下通过具体的实施例进一步说明本发明，但本领域技术人员应该知晓，本发明实施例并不以任何方式限制本发明。
[0029]
制剂实施例1马钱苷元注射液
[0030][0031]
制备工艺：将处方量的乙醇和吐温-80混合均匀，加入马钱苷元，搅拌溶解，加入注射用水至10l，搅拌均匀，加入0.5％针用活性炭，搅拌，脱炭，即得。
[0032]
制剂实施例2马钱苷元注射液
[0033]
马钱苷元
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10g
[0034]
乙醇
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3.3l
[0035]
注射用水
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加至10l
[0036]
制备工艺：将处方量的乙醇加入马钱苷元，搅拌溶解，加入注射用水至10l，搅拌均匀，加入0.5％针用活性炭，搅拌，脱炭，即得。
[0037]
制剂实施例3马钱苷元注射液
[0038][0039][0040]
制备工艺：将处方量的丙二醇和乙醇混合均匀，加入马钱苷元，搅拌溶解，加入处方量的0.9％氯化钠溶液，搅拌均匀，加入0.5％针用活性炭，搅拌，脱炭，即得。
[0041]
制剂实施例4马钱苷元注射液
[0042][0043]
制备工艺：向处方量的peg-400加入马钱苷元，搅拌溶解，加入0.9％氯化钠溶液至10l，搅拌均匀，加入0.5％针用活性炭，搅拌，脱炭，即得。
[0044]
制剂实施例5马钱苷元注射液
[0045][0046]
制备工艺：向处方量的peg-400加入马钱苷元，搅拌溶解，加入0.9％氯化钠溶液至10l，
[0047]
搅拌均匀，加入0.5％针用活性炭，搅拌，脱炭，即得。
[0048]
制剂实施例6马钱苷元片剂
[0049]
羧甲基淀粉钠
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8g
[0050]
硬脂酸镁
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
1.5g
[0051]
8％淀粉浆
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适量
[0052]
制备工艺:将马钱苷元和辅料微晶纤维素、羧甲基淀粉钠混合均匀，加入适量的淀粉浆制软材，然后过16目筛制粒。湿颗粒在60℃干燥，干颗粒过20目筛整粒，筛出干粒中的细粉，与硬脂酸镁混匀，然后再与干颗粒混匀，压片，每片约200mg，即得。
[0053]
制剂实施例7马钱苷元胶囊剂
[0054]
马钱苷元
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
10g
[0055]
微晶纤维素
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300g
[0056]
微粉硅胶
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12g
[0057]
制备工艺：将马钱苷元、微晶纤维素、微粉硅胶粉碎过100目筛混匀，直接填装胶囊即得。
[0058]
制剂实施例8马钱苷元颗粒剂
[0059][0060]
制备工艺：称取处方量的马钱苷元、淀粉、糊精、蔗糖粉混合均匀。另将适量的80％乙醇加入于混合粉末中，混合均匀，制软材，通过18目尼龙筛制成湿粒，60℃左右干燥，20目筛整粒，分装，即得。
[0061]
药效实施例1马钱苷元对自身免疫性肝炎大鼠的治疗作用
[0062]
自身免疫性肝炎大鼠模型发生了显著的免疫平衡失调，表现为cd4+细胞百分比增高，th2细胞因子水平升高，thl细胞因子水平降低及肝细胞特异性脂蛋白抗体水平升高，导致自身免疫性肝炎的产生。其中cd4+细胞在肝组织内浸润，释放损伤可导致肝损伤，thl和th2细胞活性及其细胞因子平衡失调是导致自身免疫性组织损伤的主要原因之一，i l—6促进炎症反应时急性期蛋白释放也是导致肝组织损伤的原因。
[0063]
1.自身免疫性肝炎大鼠模型的制备：
[0064]
wistar大鼠，雄性，3月龄。采用弗氏完全佐剂加肝细胞特异性脂蛋白2mg/只，于颈部、腋窝、腹股沟皮下及腹腔和肌肉多点注射，每点0.2ml,10d/次，连续注射2次后，改为肝细胞特异性脂蛋白l mg(不加弗氏完全佐剂)上述部位多点注射，1次/周，注射3次后改为1次/月，再注射3次，并于最后1次免疫后第3天，以肝细胞特异性脂蛋白2mg静脉注射加强1次。于加强后第3天，随机制取3只作肝组织病理学检查，结果表明：经肝细胞特异性脂蛋白免疫的动物肝细胞变性坏死较明显，中度碎片状坏死，出现桥接坏死，小叶内有纤维间隔形成，提示自身免疫性肝炎模型制作成功。
[0065]
2.给药与分组
[0066]
将造模成功的自身免疫性肝炎大鼠随机分成以下6组，每组10只。各给药组给药情况如下所示：
[0067]
正常对照组：皮下注射等体积的溶剂；
[0068]
模型组：皮下注射等体积的溶剂；
[0069]
泼尼松组：灌胃给予5mg/kg的泼尼松；
[0070]
马钱苷元低剂量组：皮下注射本发明实施例l制备的药物0.3mg/kg；
[0071]
马钱苷元中剂量组：皮下注射本发明实施例l制备的药物l mg/kg；
[0072]
马钱苷元高剂量组：皮下注射本发明实施例l制备的药物3mg/kg。
[0073]
所有给药组每天给药1次，连续给药3周，于给药结束时取血备用，测定大鼠外周血淋巴细胞培养上清中各细胞因子的含量。
[0074]
3.主要指标测定
[0075]
淋巴细胞培养及增殖：将动物用硫喷妥钠麻醉，常规消毒，剥离胸腹部皮肤，打开胸腔和腹腔，心脏取血，离心10min,分离血浆-60℃保存备测。收集细胞，3倍体积的培养基悬浮血细胞，将细胞悬液缓慢加在淋巴细胞分离液上层，500g离心20min,吸取淋巴细胞，hank's液洗涤3次，沉淀用培养液悬浮，计数，用含体积分数为0.15小牛血清和10％大鼠自身血浆的培养基调整细胞至1x 10
10
/l，接种于24孔培养板，37℃、体积分数为0.05的co2,原代培养4h,离心，弃上清液，沉淀用培养基悬浮，计数，调整细胞至1x 109/l，接种于24孔培养板。
[0076]
细胞因子的检测方法及步骤：采用elisa法，全自动酶免仪进行定量检测。首先在使用前将试剂从冰箱取出，室温平衡30min。将试剂摇匀，加100μl倍稀释的标准品，样本或标准的稀释液于微孔，分别作为标准对照、样本检测或空白对照。每孔加入50μl稀释的生物素标记检测抗体，室温3h,倾去所有孔中反应液，洗板3x 3mi n。每孔加入辣根过氧化物酶(hrp)标记的亲合素，室温静置30min,每孔加入四甲基联苯胺(tmb)溶液100μl,避光10-15mi n,显色。每孔加入100μl 1.8mol/l的硫酸终止反应，在450nm波长处检测吸光度。
[0077]
4、数据统计及结果分析
[0078]
统计学分析采用spss 13.0统计分析软件处理数据，结果以x土s表示，组间差异的比较采用t检验。
[0079]
表1马钱元对自身免疫性肝炎大鼠模型外周淋巴细胞因子水平的影响
[0080]
[0081][0082]
与正常对照组相比，
##
p<0.01；
[0083]
与模型组相比，
﹩
p<0.05，
﹩﹩
p<0.01；
[0084]
与泼尼松组相比，
&
p<0.05，
&&
p<0.01。
[0085]
由表1的内容可以看出，模型组与正常组相比白细胞介素2和γ-干扰素水平显著降低，白细胞介素4和白细胞介素6水平显著升高。与模型组相比，泼尼松组对细胞因子的改变幅度不大，与模型组相比无统计学差异；马钱苷元各剂量组可以显著改善白细胞介素水平和γ-干扰素水平之间的比例失衡，具体表现在其可以显著升高白细胞介素2和γ-干扰素水平(p<0.05),显著降低白细胞介素4和白细胞介素6的水平(p<0.05)。马钱苷元在改善白细胞介素水平和γ-干扰素水平之间的比例失衡方面呈现剂量依赖性，其中马钱苷元高组的各细胞因子水平与模型组相比具有极显著性差异(p<0.01)。
[0086]
药效实施例2马钱苷元对自身免疫性肝炎大鼠肝功能和肝脏指数的影响
[0087]
1自身免疫性肝炎模型的制备
[0088]
wistar大鼠，雄性，3月龄。采用弗氏完全佐剂加肝细胞特异性脂蛋白2mg/只，于颈部、腋窝、腹股沟皮下及腹腔和肌肉多点注射，每点0.2ml,l0d/次，连续注射2次后，改为肝细胞特异性脂蛋白lmg(不加弗氏完全佐剂)上述部位多点注射，1次/周，注射3次后改为1次/月，再注射3次，并于最后1次免疫后第3天，以肝细胞特异性脂蛋白2mg静脉注射加强1次。于加强后第3天，随机取3只作肝组织病理学检查，结果表明：经肝细胞特异性脂蛋白免疫的动物肝细胞变性坏死较明显，中度碎片状坏死，出现桥接坏死，小叶内有纤维间隔形成，提示自身免疫性肝炎模型制作成功。
[0089]
2分组与给药
[0090]
模型大鼠适应性饲养1周后，随机分成正常组、模型组以及给药组，具体分组情况如下，每组10只。每天下午14:30时灌胃药物，剂量如下：
[0091]
正常对照组：同体积的羧甲基纤维素钠；
[0092]
模型对照组：同体积的羧甲基纤维素钠；
[0093]
泼尼松组：灌胃给予5mg/kg/d泼尼松；
[0094]
马钱苷元低剂量组：灌胃给予按实施例6制备马钱苷元片剂0.5mg/kg/d；
[0095]
马钱苷元中剂量组：灌胃给予按实施例6制备马钱苷元片剂5mg/kg/d；
[0096]
马钱苷元高剂量组：灌胃给予按实施例6制备马钱苷元片剂l0mg/kg/d。
[0097]
3检测指标
[0098]
按上述给药方式连续给药14天，末次给药后，戊巳比妥钠麻醉大鼠，解剖，腹主静脉取血测定生化指标，取肝脏进行称重。
[0099]
3.1肝功能
[0100]
肝功能试验结果详见表2，结果表明：模型组大鼠血清alt、ast含量与正常组相比大幅度升高；各给药组的大鼠血清alt、ast含量与模型组相比显著下降(p<0.05或p<0.01)，均具有统计学意义，其中，马钱苷元对大鼠血清alt、ast含量的影响呈剂量依赖性关系，并且与泼尼松组相比有显著性差异(p<0.05或p<0.01)，此结果表明：马钱苷元在对大鼠自身免疫性肝炎的预防或治疗上优于泼尼松。
[0101]
表2马钱元对大鼠模型肝功能的影响
[0102][0103]
与正常对照组相比，
##
p<0.01；
[0104]
与模型组相比，
﹩
p<0.05，
﹩﹩
p<0.01；
[0105]
与泼尼松组相比，
&
p<0.05，
&&
p<0.01。
[0106]
3.2肝脏指数
[0107]
肝脏指数试验结果详见表3，试验结果表明：模型组大鼠肝指数与正常组相比有极显著性差异；各给药组的大鼠的肝指数与模型组相比有显著性差异(p<0.05或p<0.01)，均具有统计学意义，其中，马钱苷元对自身免疫性肝炎大鼠的肝脏指数影响呈剂量依赖关系，中、高剂量组泼尼松组相比有显著性差异或极显著性差异(p<0.05或p<0.01)，此结果表明：马钱苷元在对大鼠自身免疫性肝炎进行治疗时，在降低肝脏指数方面显著优于现有治疗药物泼尼松。
[0108]
表3马钱苷元对大鼠肝脏指数的影响
[0109]
组别体重(g)肝湿重(g)肝脏指数(％)正常组414土2211.07土1.092.67土0.97模型组423土1925.55土3.456.04土1.01
##
泼尼松组417土1819.09土2.024.58土0.88
﹩
马钱苷元低剂量组421土2118.22土3.784.33土0.67
﹩
马钱苷元中剂量组409土2016.26土1.963.98土0.82
﹩﹩&
马钱苷元高剂量组410土2312.38土1.003.03土0.56
﹩﹩&&
[0110]
与正常对照组相比，
##
p<0.01；
[0111]
与模型组相比，
﹩
p<0.05，
﹩﹩
p<0.01；
[0112]
与泼尼松组相比，
&
p<0.05，
&&
p<0.01。
[0113]
药效实施例3马钱苷元对刀豆蛋白a所致小鼠急性肝损伤的作用
[0114]
1.动物分组给药与造模
[0115]
将所有健康小鼠称重，按照体重以简化随机法分为六组，分别为正常组、模型组、马钱苷组(30mg/kg)、马钱苷元低、中、高剂量组(0.3、1、3mg/kg)。分组完成后，正常组、模型组腹腔注射10ml/kg氯化钠注射液，马钱苷元低、中、高剂量组分别腹腔注射0.3、1、3mg/kg马钱苷元(制剂实施例5所得)，每天一次，连续七天。第七次给药1h后，称重，正常组尾静脉注射10ml/kg氯化钠注射液，其它四组尾静脉注射18mg/kg刀豆蛋白a造模。造模3h后给药一次，正常组、模型组腹腔注射10ml/kg氯化钠注射液，马钱苷元低、中、高剂量组分别腹腔注射0.3、1、3mg/kg马钱苷元。
[0116]
2.指标测定
[0117]
最后一次给药后，禁食不禁水，第二天进行剖检。将所有存活小鼠以戊巴比妥钠麻醉，麻醉后，称重；腹主静脉采血，将血液放入黄色促凝管中促凝，静置30min后3000rpm，离心10min，取血清，检测血清中ast和alt。
[0118]
3.数据统计与分析
[0119]
数据表示，采用spss15.0软件进行方差分析。
[0120]
4.结果与讨论
[0121]
(1)与正常对照组相比，模型对照组小鼠血清alt、ast均显著升高，表明造模成功；马钱苷元各给药组处理小鼠后，均能降低小鼠血清alt、ast，与模型对照组相比均具有统计学差异(p<0.05或p<0.01)，而马钱苷组虽然能降低大鼠血清alt、ast，降低幅度并不明显，与模型组相比无统计学意义。
[0122]
(2)马钱苷元对大鼠血清alt、ast的降低作用呈现剂量依赖关系，其中中、高剂量组与马钱苷组相比，具有显著(p<0.01)差异。
[0123]
以上结果表明：马钱苷和马钱苷元在治疗由刀豆蛋白致小鼠急性肝损伤时，马钱苷元的效果显著优于马钱苷。
[0124]
表4马钱苷元对刀豆蛋白致小鼠急性肝损伤的的影响
[0125][0126]
与正常对照组相比，
##
p<0.01；
[0127]
与模型组相比，
﹩
p<0.05，
﹩﹩
p<0.01；
[0128]
与泼尼松组相比，
&
p<0.05，
&&
p<0.01。