温泉水作为皮肤外用剂的应用及含其的皮肤外用剂的制作方法

本发明涉及化妆品领域，具体涉及一种温泉水作为皮肤外用剂的应用及含其的皮肤外用剂。
背景技术：
：细胞以分裂的方式进行不断增殖，产生新的细胞或个体，因此细胞增殖是生物体的重要生命特征，在生物体生长、发育、繁殖的过程中起到重要作用。皮肤是机体最外层覆盖面积最大的器官，由表皮和真皮组成，借皮下组织与机体深层组织连接。皮肤能够保护机体免受外界异物与病原体的侵入，并且能防止机体水分丢失。此外皮肤对机体的体温调节、水盐代谢、排泄代谢废物及在机体的免疫监视中也有重要的作用。在日常生活中，由于紫外线、污染以及化学物质的影响，皮肤会出现松弛、皱纹以及弹性丧失等衰老表现，并且伴随皮肤细胞增殖和迁移能力的减弱。因此，研究如何提高细胞的增殖和修复能力，对于延缓皮肤衰老具有重要意义。皮肤衰老是一个受多种因素影响的复杂生理现象，分为内在衰老和外在衰老，两者一般伴随发生。内在衰老主要是指基因或年龄引起的衰老，表现为皮肤干燥，皮下脂肪不足引起皮肤细小皱纹等。外在衰老即外在环境导致的衰老现象，包括光照、污染及化学物质等引起的衰老。文献报道中的衰老效应大多发生在真皮层，但也可能出现在真表皮连接处和表皮层。衰老过程中，皮肤细胞中的一些蛋白酶激活，引起皮肤真皮层中弹性纤维和胶原等重要蛋白的流失，引起皮肤松弛、弹性减弱、皮肤粗糙及皱纹增加等衰老现象。例如衰老皮肤中真皮层中的胶原i、iii及真表皮连接处基底膜区域的胶原vii、iv以及增殖角质细胞标志物ki67和细胞粘附相关蛋白laminin5的表达均减少。拉月村位于西藏拉萨市林芝县鲁朗镇，该区域属于亚热带季风气候区，常年气候温和，雨量充足。拉月村温泉区水质透明，含有多种有益人体健康的微量元素和矿物离子，包括钙、镁、钾、钠以及锶等等，符合国家理(医)疗热矿泉水水质标准。在功能上能够镇定安神，调节生理平衡，改善心血管功能，尤其对各种皮肤病、风湿病具有独特的疗效。然而，据文献报道目前还鲜有研究将拉月村温泉水用于具有抗衰老功效的化妆品中。技术实现要素：本发明所解决的技术问题是为了开发出一种具有良好皮肤改善作用的护肤制剂，而提供了一种温泉水作为皮肤外用剂的应用及含其的皮肤外用剂。本发明中的含温泉水的皮肤外用剂具有提高受损细胞修复能力(修复皮肤表皮划痕)和促进细胞增殖的作用，可有效延缓皮肤衰老。本发明人研究发现：位于西藏拉萨市林芝县鲁朗镇境内的拉月村温泉水可促进受损细胞的自我修复，并能够明显促进角质细胞的增殖，达到抗衰老的功效。由此，对拉月村温泉水的成分进行了表征分析，通过大量研究发现温泉水中的离子可协同提高受损细胞修复能力、促进细胞增殖，进而达到抗衰老功效。本发明提供了一种温泉水作为皮肤外用剂的应用，每升所述温泉水含有如下成分：na+95-120mg、ca2+100-130mg、k+15-30mg、mg2+25-40mg和sr+0.5-1.2mg。本发明中，所述温泉水的ph一般为6.5-8.5，较佳地为6.95-7.02。本发明中，每升所述温泉水中，所述na+的含量较佳地为110-120mg，例如116mg。本发明中，每升所述温泉水中，所述ca2+的含量较佳地为100-110mg，例如107mg。本发明中，每升所述温泉水中，所述k+的含量较佳地为20-25mg，例如22mg。本发明中，每升所述温泉水中，所述mg2+的含量较佳地为25-35mg，例如30mg。本发明中，每升所述温泉水中，所述sr+的含量较佳地为0.5-1.0mg，例如0.8mg。本发明中，较佳地，每升所述温泉水还含有li+、al3+、h2sio3、co32-、cl-、so42-和f-中的一种或多种。其中，每升所述温泉水中，所述li+的含量较佳地为0.2-0.6mg，更佳地为0.2-0.5mg，例如0.3mg。其中，每升所述温泉水中，所述al3+的含量较佳地为0.5-0.8mg，更佳地为0.5-0.7mg，例如0.6mg。其中，每升所述温泉水中，所述h2sio3的含量较佳地为120-155mg，更佳地为135-145mg，例如141mg。其中，当所述温泉水中含有co32-时，较佳地：每升所述温泉水中，所述co32-的含量为<3mg。其中，每升所述温泉水中，所述cl-的含量较佳地为75-90mg，更佳地为75-85mg，例如81.8mg。其中，每升所述温泉水中，所述so42-的含量较佳地为120-156mg，更佳地为135-145mg，例如142.7mg。其中，每升所述温泉水中，所述f-的含量较佳地为1.05-1.23mg，更佳地为1.10-1.20mg，例如1.19mg。在本发明一较佳实施例中，每升所述温泉水含有如下成分：na+95-120mg、ca2+100-130mg、k+15-30mg、mg2+25-40mg、sr+0.5-1.2mg、li+0.2-0.6mg、al3+0.5-0.8mg、h2sio3120-155mg、co32-<3mg、cl-75-90mg、so42-120-156mg和f-1.05-1.23mg。在本发明一较佳实施例中，每升所述温泉水含有如下成分：na+110-120mg、ca2+100-110mg、k+20-25mg、mg2+25-35mg、sr+0.5-1.0mg、li+0.2-0.5mg、al3+0.5-0.7mg、h2sio3135-145mg、co32-<3mg、cl-75-85mg、so42-135-145mg和f-1.10-1.20mg。在本发明一较佳实施例中，每升所述温泉水含有如下成分：na+116mg、ca2+107mg、k+22mg、mg2+30mg、sr+0.8mg、li+0.3mg、al3+0.6mg、h2sio3141mg、co32-<3mg、cl-81.8mg、so42-142.7mg和f-1.19mg。本发明中，所述温泉水还可能含有其它极微量的离子，例如zn离子、cu离子、mn离子、fe离子和se离子中的一种或多种。此处极微量是指含量低于检测方法的检测限。本发明中，所述温泉水的水源地不作特殊限定，只要该温泉水包括如上含量范围内的离子即可。较佳地，所述温泉水的取水口为拉月村温泉，所述拉月村温泉位于拉萨市林芝县鲁朗镇境内，海拔4000余米；所述拉月村温泉的地表温度一般在65-83℃之间。其中，所述拉月村温泉的具体取水时节、取水位点、取水深度等不同，温泉水中的上述成分含量会有所不同，但只要所需的成分含量在本发明限定的范围内，即可实现显著提高受损细胞修复能力和细胞增殖能力的效果，可有效延缓皮肤衰老。本发明中，所述温泉水较佳地采用滤膜进行过滤除菌，所述滤膜的孔径较佳地为0.22μm。本发明中，较佳地，所述温泉水作为所述皮肤外用剂中的抗衰老活性成分。其中，所述抗衰老活性成分较佳地为提高受损细胞修复能力的抗衰老活性成分和/或提高细胞增殖能力的抗衰老活性成分。所述受损细胞是指细胞发生水肿、脂肪变、玻璃样变、黏液样变和病理性色素沉着中的一种或多种病变。本领域技术人员知晓，细胞受损可由多种因素导致，例如划痕等。所述提高受损细胞修复能力的抗衰老活性成分优选为修复表皮细胞的形态和完整结构、改善皮肤状态的抗衰老活性成分。所述提高细胞增殖能力的抗衰老活性成分较佳地为提高角质细胞增殖能力的抗衰老活性成分。所述提高细胞增殖能力的抗衰老活性成分较佳地为促进ki67和laminin5表达的抗衰老活性成分。所述提高细胞增殖能力的抗衰老活性成分较佳地为促进真皮和表皮之间的连接的抗衰老活性成分。本发明中，所述皮肤外用剂是通常用于皮肤外部的所有成分的统称概念，例如可以是化妆品或药品。其中，所述化妆品为本领域技术术语，指以涂抹、喷洒或者其他类似方法，散布于人体表面的任何部位，如皮肤、毛发、指趾甲、唇齿等，以达到清洁、保养、美容、修饰和改变外观，或者修正人体气味，保持良好状态为目的的化学工业品或精细化工产品，包括护肤品和彩妆品。其中，所述化妆品的种类不作特殊限定，其可为基础化妆品、面部妆容化妆品、身体用化妆品等。本发明中，对于化妆品的剂型也无特殊限定，具体可根据不同目的进行合理选择。本发明中，所述温泉水应用于皮肤外用剂时，一般是将温泉水从取水时的较高温度冷却到常温再使用，其中，所述常温为本领域技术术语，一般为15-35℃。本发明中，所述温泉水应用于皮肤外用剂时，所述温泉水可直接应用于所述皮肤外用剂中，还可稀释后应用于所述皮肤外用剂中。当所述温泉水直接应用于所述皮肤外用剂时，所述皮肤外用剂可制成喷雾剂使用。当所述温泉水稀释后应用于所述皮肤外用剂时，较佳地，将所述温泉水和其它溶剂混合，制备得到稀释后的温泉水再应用于所述皮肤外用剂中。其中，所述稀释后温泉水的浓度较佳地为0.01％-10％，更佳地为0.1％-5％，最佳地为0.4％-0.6％，所述百分比为温泉水的体积占所述皮肤外用剂总体积的百分比。其中，所述其他溶剂一般是指除温泉水以外的常规可用于皮肤外用剂中的溶剂，例如去离子水、蒸馏水或超纯水等，较佳地为去离子水。本发明还提供了一种皮肤外用剂，其含有所述的温泉水，所述温泉水的质量占所述皮肤外用剂的总质量的0.1％-100％。本发明中，当所述温泉水的质量在所述皮肤外用剂的总质量中的占比为100％时，所述皮肤外用剂中仅包含所述温泉水，一般可制成喷雾剂使用。本发明中，当所述温泉水的质量在所述皮肤外用剂的总质量中的占比小于100％时，所述皮肤外用剂还可含有其它类型的水。所述其它类型的水指除温泉水以外的常规用于皮肤外用剂中的水的类型，包括去离子水、蒸馏水或超纯水等，较佳地为去离子水。本发明中，较佳地，所述温泉水的质量占所述皮肤外用剂的总质量的0.1％-80％，例如0.5％、1％、2％、4％或70.9％。本发明中，所述的皮肤外用剂还可含有其他成分，所述其他成分较佳地为溶剂、皮肤调理剂、增稠剂、防腐剂、润肤剂、表面活性剂和赋香剂中的一种或多种，例如，所述其他成分包含溶剂、皮肤调理剂、增稠剂、防腐剂、润肤剂和赋香剂；再例如，所述其他成分包含溶剂、皮肤调理剂、增稠剂、防腐剂、润肤剂、表面活性剂和赋香剂。所述其他成分的含量为本领域常规的含量。其中，所述溶剂可为丁二醇和/或去离子水。所述溶剂的含量可为5-75％，例如7％、64.6％或71.59％，百分比是指在所述皮肤外用剂中的质量百分比。当所述溶剂为丁二醇时，所述溶剂的含量较佳地为5-10％，例如7％，百分比是指在所述皮肤外用剂中的质量百分比。当所述溶剂为去离子水时，所述溶剂的含量较佳地为60-70％，例如64.6％，百分比是指在所述皮肤外用剂中的质量百分比。所述溶剂可为7％丁二醇或“7％丁二醇和64.6％去离子水”，百分比是指在所述皮肤外用剂中的质量百分比。其中，所述皮肤调理剂可为甘油和/或生育酚乙酸酯。所述皮肤调理剂的含量可为0.1-10％，例如0.1％、3％、3.1％或6％，百分比是指在所述皮肤外用剂中的质量百分比。当所述皮肤调理剂为甘油时，所述皮肤调理剂的含量较佳地为2-10％，例如3％或6％，百分比是指在所述皮肤外用剂中的质量百分比。当所述皮肤调理剂为生育酚乙酸酯时，所述皮肤调理剂的含量较佳地为0.1-3％，例如0.1％、3％、3.1％或6％，百分比是指在所述皮肤外用剂中的质量百分比。所述皮肤调理剂可为“3％甘油和0.1％生育酚乙酸酯”或6％甘油，百分比是指在所述皮肤外用剂中的质量百分比。其中，所述增稠剂可为黄原胶、聚丙烯酸酯13、聚异丁烯和聚山梨醇酯20中的一种或多种，例如，所述增稠剂包含黄原胶、聚丙烯酸酯13、聚异丁烯和聚山梨醇酯20；再例如，所述增稠剂包含聚丙烯酸酯13、聚异丁烯和聚山梨醇酯20。所述增稠剂的含量可为0.1-2.0％，例如0.1％、0.15％、0.3％、0.45％、0.6％、0.9％、1.0％或1.6％，百分比是指在所述皮肤外用剂中的质量百分比。当所述增稠剂为黄原胶时，所述增稠剂的含量较佳地为0.1-0.3％，例如0.1％，百分比是指在所述皮肤外用剂中的质量百分比。当所述增稠剂为聚丙烯酸酯13时，所述增稠剂的含量较佳地为0.1-1.0％，例如0.6％或0.9％，百分比是指在所述皮肤外用剂中的质量百分比。当所述增稠剂为聚异丁烯时，所述增稠剂的含量较佳地为0.1-0.6％，例如0.3％或0.45％，百分比是指在所述皮肤外用剂中的质量百分比。当所述增稠剂为聚山梨醇酯20时，所述增稠剂的含量较佳地为0.1-0.3％，例如0.1％或0.15％，百分比是指在所述皮肤外用剂中的质量百分比。当所述增稠剂包含聚丙烯酸酯13、聚异丁烯和聚山梨醇酯20时，所述聚丙烯酸酯13和所述聚异丁烯的质量比较佳地为(1.25-3.5):1，例如2:1；所述聚丙烯酸酯13和所述聚山梨醇酯20的质量比较佳地为(3.33-14):1，例如6:1。所述增稠剂可为“0.1％黄原胶、0.9％聚丙烯酸酯13、0.45％聚异丁烯和0.15％聚山梨醇酯20”或“0.6％聚丙烯酸酯13、0.3％聚异丁烯和0.1％聚山梨醇酯20”，百分比是指在所述皮肤外用剂中的质量百分比。其中，所述防腐剂可为羟苯甲酯和/或苯氧乙醇。所述防腐剂的含量可为0.1-0.4％，例如0.1％、0.3％或0.4％，百分比是指在所述皮肤外用剂中的质量百分比。当所述防腐剂为羟苯甲酯时，所述防腐剂的含量较佳地为0.1-0.3％，例如0.1％，百分比是指在所述皮肤外用剂中的质量百分比。当所述防腐剂为苯氧乙醇时，所述防腐剂的含量较佳地为0.3-0.4％，例如0.3％，百分比是指在所述皮肤外用剂中的质量百分比。所述防腐剂可为0.1％羟苯甲酯和0.3％苯氧乙醇，百分比是指在所述皮肤外用剂中的质量百分比。其中，所述润肤剂可为氢化聚异丁烯、辛酸/癸酸甘油酯类、聚二甲基硅氧烷、鲸蜡硬脂醇和矿油中的一种或多种，例如，所述润肤剂包含氢化聚异丁烯、辛酸/癸酸甘油酯类和聚二甲基硅氧烷；再例如，所述所述润肤剂包含辛酸/癸酸甘油酯类、聚二甲基硅氧烷、鲸蜡硬脂醇和矿油。所述润肤剂的含量可为0.5-20％，例如1％、2％、3％、4％、5％、8％、14％或17％，百分比是指在所述皮肤外用剂中的质量百分比。当所述润肤剂为氢化聚异丁烯时，所述润肤剂的含量较佳地为5-14％，例如8％，百分比是指在所述皮肤外用剂中的质量百分比。当所述润肤剂为辛酸/癸酸甘油酯类时，所述润肤剂的含量较佳地为1-8％，例如3％或5％，百分比是指在所述皮肤外用剂中的质量百分比。当所述润肤剂为聚二甲基硅氧烷时，所述润肤剂的含量较佳地为1-5％，例如2％或4％，百分比是指在所述皮肤外用剂中的质量百分比。当所述润肤剂为鲸蜡硬脂醇时，所述润肤剂的含量较佳地为0.5-2％，例如1％，百分比是指在所述皮肤外用剂中的质量百分比。当所述润肤剂为矿油时，所述润肤剂的含量较佳地为5-14％，例如8％，百分比是指在所述皮肤外用剂中的质量百分比。所述润肤剂可为“4％聚二甲基硅氧烷、5％辛酸/癸酸甘油酯类和8％氢化聚异丁烯”或“1％鲸蜡硬脂醇、2％聚二甲基硅氧烷、3％辛酸/癸酸甘油酯类和8％矿油”，百分比是指在所述皮肤外用剂中的质量百分比。其中，所述表面活性剂可为peg-100硬脂酸酯和/或甘油硬脂酸酯。所述表面活性剂的含量可为1-5％，例如3％，百分比是指在所述皮肤外用剂中的质量百分比。所述表面活性剂可为3％peg-100硬脂酸酯，百分比是指在所述皮肤外用剂中的质量百分比。其中，所述赋香剂可为香精。所述赋香剂的含量可为0.01-0.03％，例如0.01％，百分比是指在所述皮肤外用剂中的质量百分比。在本发明一较佳实施例中，所述皮肤外用剂包括如下重量百分比的组分：溶剂5-75％、皮肤调理剂0.1-10％、增稠剂0.1-2.0％、防腐剂0.1-0.4％、润肤剂0.5-20％、表面活性剂1-5％和赋香剂0.01-0.03％，余量为所述温泉水，百分比为各组分质量占所述皮肤外用剂总质量的百分比。在本发明一较佳实施例中，所述皮肤外用剂包括如下重量百分比的组分：溶剂5-10％、皮肤调理剂0.1-4％、增稠剂0.1-2.0％、防腐剂0.1-0.4％、润肤剂8-17％和赋香剂0.01-0.03％，余量为所述温泉水，百分比为各组分质量占所述皮肤外用剂总质量的百分比。在本发明一较佳实施例中，所述皮肤外用剂包括如下重量百分比的组分：溶剂60-70％、皮肤调理剂4-10％、增稠剂0.1-2.0％、防腐剂0.1-0.4％、润肤剂1-14％和赋香剂0.01-0.03％，余量为所述温泉水，百分比为各组分质量占所述皮肤外用剂总质量的百分比。在本发明一较佳实施例中，所述的皮肤外用剂为润肤水，所述润肤水含有所述的温泉水，所述温泉水的质量占所述皮肤外用剂的总质量的0.1％-80％。在本发明一较佳实施例中，所述润肤水包括如下重量百分比的组分：丁二醇7％、甘油3％、黄原胶0.1％、羟苯甲酯0.1％、氢化聚异丁烯8％、辛酸/癸酸甘油酯类5％、生育酚乙酸酯0.1％、聚二甲基硅氧烷4％、聚丙烯酸酯130.9％、聚异丁烯0.45％、聚山梨醇酯200.15％、苯氧乙醇0.3％和香精0.01％，余量为所述温泉水，百分比为各组分质量占润肤水总质量的百分比。在本发明一较佳实施例中，所述润肤水包括如下重量百分比的组分：甘油6％、丁二醇7％、所述温泉水4％、羟苯甲酯0.1％、peg-100硬脂酸酯3％、鲸蜡硬脂醇1％、辛酸/癸酸甘油酯类3％、矿油8％、聚二甲基硅氧烷2％、聚丙烯酸酯130.6％、聚异丁烯0.3％、聚山梨醇酯200.1％、苯氧乙醇0.3％和香精0.01％，余量为去离子水，百分比为各组分质量占润肤水总质量的百分比。在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。本发明所用试剂和原料均市售可得。本发明的积极进步效果在于：本发明首次发现位于西藏拉萨市林芝县鲁朗镇境内的拉月村温泉水中的离子可协同促进受损细胞的自我修复，可明显促进角质细胞的增殖，达到抗衰老的功效。附图说明图1为实施例4中终浓度为0.5％的拉月村温泉水处理组与对比例1中未处理组(nt)的细胞增殖率柱状图。图2为实施例1-2中不同终浓度的拉月村温泉水处理组与对比例1中未处理(nt)组的细胞划痕修复照片，其中，a图表示未处理组(nt)细胞划痕修复照片，b图表示2％的拉月村温泉水处理组细胞划痕修复照片，c图表示4％的拉月村温泉水处理组细胞划痕修复照片。图3为实施例1和实施例2中不同终浓度的拉月村温泉水处理组与对比例1中未处理(nt)组的细胞划痕修复率柱状图。图4为未处理组(nt)和2％的拉月村温泉水处理组中，3d皮肤模型中皮肤细胞形态变化对比图。图5为未处理组(nt)和2％的拉月村温泉水处理组中，3d皮肤模型中ki67的表达图。图6为未处理组(nt)和2％的拉月村温泉水处理组中，3d皮肤模型中laminin5的表达图。具体实施方式下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。下述实验中，所用的拉月村温泉水取自位于西藏拉萨市林芝县鲁朗镇的拉月村温泉。下述实验中，所用温泉水中的成分含量采用国家标准gb/t8538-2008饮用天然矿泉水检验方法进行检测。下述实验中，所用的其它原料和试剂皆可市售获得。实施例1-4拉月村温泉水的功效评估一、拉月村温泉水活性物的配制本实验中所用的拉月村温泉水的成分如下表1所示。表1表1中，金属离子通过电感耦合等离子体质谱法测定(参照《化妆品安全技术规范》2015版)；碳酸根、氯离子、硫酸根、氟离子以及偏硅酸的检测方法参照gb8538-2016。实施例1-4中按照下表2配制拉月村温泉水活性物。表2注：百分比为温泉水的体积占温泉水和培养基的总体积的百分比。二、细胞培养细胞培养：人永生表皮细胞、mem完全培养基(购自biologicalindustries货号11-025-1k)在37℃的5％co2细胞培养箱培养，至90％铺板率时(铺板率是指细胞生长面积占培养皿总面积的百分比)，消化后种在96孔板和6孔板上，设置对照。三、增殖试验96孔板中细胞正常培养至细胞铺板率为70-80％时，加入如表2所示的不同浓度的拉月村温泉水进行共培养。培养1天后，移除培养基，加入现配的0.5mg/ml的mtt溶液，3小时后小心吸去上清液，加入二甲亚砜(dmso)，用酶标仪在550nm波长下检测吸光度；以未处理孔作为参照，定义样品孔为t，未处理孔为nt，以nt作为100％，样品孔t/nt的比值作为增殖率。人永生表皮细胞属于角质细胞，主要位于皮肤表皮层，其生长代谢状况是反应皮肤状态的重要代表，如果添加拉月村温泉水后，角质细胞的细胞数量明显升高，可认为其具有促进细胞增殖的功效。具体测试结果如下表3、表4和图1所示。表3终浓度t/nt％变异系数(cv)0.50％107.40.467％*nt1002.16％与nt组相比，*：p<0.05。表4终浓度t/nt％1％109.92％113.84％121.0nt100从表3、表4和图1可知：(1)与未处理(nt)对照组相比，拉月村温泉水在终浓度为0.5％时，细胞增值率为107.4％，显著高于对照组；(2)与未处理(nt)对照组相比，拉月村温泉水在终浓度为1％、2％和4％时，细胞增值率分别为109.9％、113.8％和121.0％，明显高于对照组；由此可知，本申请中的温泉水具有促进细胞增殖的功效。四、划痕实验6孔板中细胞正常培养至铺板率约为100％时，用200μl枪头在细胞中划痕，吸去培养基，用pbs洗两次，加入如表2所示的不同浓度的拉月村温泉水进行共培养。培养1天后，吸去培养基，用pbs洗两次，冷甲醇固定，再用giemsa染液(购自国药，货号：71020246)对细胞进行染色，最后用流水冲洗，晾干。使用倒置荧光显微镜拍照监测划痕的闭合程度。每个样品设置3次重复。人永生表皮细胞主要位于皮肤表皮层，其生长代谢状况是反应皮肤状态的重要代表。在划痕试验中，如果相对于未添加温泉水的细胞组，细胞划痕的闭合程度明显变多，修复面积增大，可推断拉月村温泉水可以促进细胞的自我修复功能，从而达到抗衰老的功效。具体测试结果如下表5和图2所示。表5与nt组相比，*：p<0.05；**；p<0.01；***：p<0.001。如图2、图3和表5所示，加入拉月村温泉水处理后的细胞划痕修复率均显著高于未处理组，证明拉月村温泉水对细胞损伤有明显的修复能力。结论通过加入或不加入拉月村温泉水培养人永生表皮细胞发现，加入0.5％的拉月村温泉水能有效地促进细胞的增殖(增值率增加了7.4％)。并且通过加入不同浓度的拉月村温泉水进行划痕修复实验发现，加入温泉水的细胞修复率更高(修复率增加了17.94％、19.61％)。说明拉月村温泉水能够促进细胞的修复迁移，并且在0.5％的浓度下能显著促进细胞增殖，以利于皮肤的结构的稳定，最终起到抗衰老的作用。五、功效评价1.3d重建皮肤模型培养及加药处理：(1)复苏人原代成纤维细胞(nhdf，提取方法利用本领域常规的原代细胞提取技术制得，并且提取后通过本领域常规操作验证所提细胞是否能用于皮肤模型的培养)：将冷冻管从液氮中取出，迅速投入37℃水浴融化，离心机1000rpm/min离心10min。用dmem培养基进行重悬(gibco；10569-010)，接种于t175瓶中在37℃的二氧化碳培养箱中进行培养，隔2天换一次液。(2)培养一周后，将细胞用0.05％胰蛋白酶(gibco；25300-062)消化，加入完全dmem培养基(在基本dmem培养基的基础上添加1％v/v抗生素和10％v/v血清所得)，转移到50ml离心管中，1000rpm/min离心10min后弃上清。(3)用dmem将细胞重悬，与胶原(本领域常规商购胶原即可)混合后放37℃的二氧化碳培养箱中进行真皮阶段培养，培养3～4天。(4)复苏人原代角质细胞(nhek，提取方法利用本领域常规的原代细胞提取技术制得，并且提取后通过本领域常规操作验证所提细胞是否能用于皮肤模型的培养)，可接种于到真皮阶段的皮肤模型表面，加培养基(本领域常规的培养皮肤模型的培养基即可)没过皮肤模型进行浸没培养，每2天换液一次。(5)一周后换成气相培养(气相培养是让将皮肤放在一定的支撑物上，使其下方接触培养基，上方暴露于空气中使表面的角质细胞分化形成角质层)，将拉月村温泉水按体积比2％的比例加入(配制方法见表2)，同时作未处理组(即表2的0％组，只添加了气相培养专用的培养基(本领域常规的气相培养用培养基即可)而未加拉月村温泉水)。(6)培养至18天得到完整的3d皮肤模型。2.免疫荧光及he染色：(1)将上述3d皮肤模型用刀片切成两份，一份做石蜡切片，一份做冰冻切片。(2)将石蜡切片切成厚度5μm的薄片，进行苏木精-伊红(he)染色，显微镜下观察皮肤模型各层细胞的形态变化，结果如图4所示。(3)将冰冻切片切成厚度5μm的薄片，进行免疫荧光实验(使用常规免疫荧光实验步骤)。不同之处在于检测皮肤细胞中ki67和laminin5的表达水平，统计分析数据，结果如图5和图6所示。其中，ki67是核蛋白，与细胞增殖和rna转录有关，常被用作增殖细胞的标志。如果活性物处理后能使表达ki67的细胞增多，即表示具有增殖能力的角质细胞增多，能不断补充新的角质细胞使皮肤保持年轻活力，抵抗衰老。真表皮连接处能够将真皮和表皮连接，主要成分包括胶原iv、胶原vii以及laminin5(层粘连蛋白5)。laminin5能与细胞间基质相互作用，介导细胞的附着和迁移以及真表皮的连接。laminin5表达增加能引起真皮和表皮内聚力升高，增加皮肤紧致程度，延缓衰老。因此如果活性物质能够改善基底膜细胞形态和结构，并且使ki67和laminin5表达增加，则说明该活性物具有抗衰老的功效和潜力。图4-6中，2％tsw即指2％拉月村温泉水处理组。tsw为thermalspringwater。从图4可知：与未处理组相比，3d皮肤模型用2％拉月村温泉水处理后，表皮层中的角质层厚度增加，并且颗粒层和基底层完整且明显，说明拉月村温泉水能够修复表皮细胞的形态和真表皮连接处的整体结构。从图5可知：3d皮肤模型用2％拉月村温泉水处理后，3d皮肤模型中ki67阳性的角质细胞增多，相对表达量达15.14％，与未处理组相比增加了3倍，说明2％的拉月村温泉水能促进基底层角质细胞的增殖。从图6可知：与未处理组相比，3d皮肤模型用2％的拉月村温泉水处理后，3d皮肤模型中laminin5荧光强度增强，即表示laminin5蛋白表达增强，说明2％拉月村温泉水能促进laminin5的表达。由上述结果可得出结论：与未处理组相比，加入2％浓度的拉月村温泉水能修复表皮细胞的形态和完整结构，改善皮肤状态。另外2％的拉月村温泉水能够通过促进ki67和laminin5的表达来促进基底层角质细胞的增殖及真表皮的连接，从而使皮肤保持年轻和弹性，减缓衰老进程。因此将拉月村温泉水应用于化妆品中能有效改善皮肤衰老情况，对现代化妆品研究和发展具有重要意义。实施例5拉月村温泉水的功效评估一、拉月村温泉水活性物的配制本实施例所用的拉月村温泉水ph在6.95-7.02之间，其成分如下表6所示。表6取上述温泉水10ml加入蒸馏水进行稀释，获得终浓度为0.5％的拉月村温泉水活性物，百分比为温泉水的体积占温泉水和去离子水的总体积的百分比。按照实施例1-4的方法进行增殖试验和划痕实验，结果表明该浓度下的温泉水能够明显促进细胞的增殖，且其划痕修复率同样明显上升，损伤细胞的修复能力得到提高，进而起到抗衰老的作用。实施例6拉月村温泉水的功效评估一、拉月村温泉水活性物的配制本实施例所用的拉月村温泉水ph在7.0-7.1之间，其成分如下表7所示。表7取上述温泉水10ml加入超纯水进行稀释，获得终浓度为0.5％的拉月村温泉水活性物，百分比为温泉水的体积占温泉水和超纯水的总体积的百分比。按照实施例1-4的方法进行增殖试验和划痕实验，结果表明该浓度下的温泉水能够明显促进细胞的增殖，且其划痕修复率同样明显上升，损伤细胞的修复能力得到提高，进而起到抗衰老的作用。实施例7实施例7的化妆品为润肤水，其具体组成见下表8。表8实施例8实施例8的化妆品为润肤水，其具体组成见下表9。表9原料名称质量百分比(％)去离子水64.59甘油6丁二醇7拉月村温泉水4羟苯甲酯0.1peg-100硬脂酸酯3鲸蜡硬脂醇1辛酸/癸酸甘油酯3矿油8聚二甲基硅氧烷2聚丙烯酸酯130.6聚异丁烯0.3聚山梨醇酯200.1苯氧乙醇0.3香精0.01按照本领域常规的润肤水的制备方法制得实施例7-8的润肤水。同样地，将实施例7-8的润肤水按照实施例1-4的方法进行增殖试验和划痕实验，结果表明该些润肤水能够明显促进细胞的增殖，起到抗衰老的作用。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12