京尼平苷在制备抗肺纤维化药物中的应用的制作方法

本发明涉及一种京尼平苷在制备抗肺纤维化药物中的应用，属于生物医药技术领域。

背景技术：

肺纤维化(pf)是由多种原因引起的进行性间质性肺病，导致肺泡结构被破坏、肺顺应性降低，使气体交换中断，最终导致呼吸衰竭和死亡。值得注意的是，pf在全球的发病率似乎随时间的推移而增加，保守估计每年每10万人中就有3-9人患病，且诊断后的中位生存期仅为2-4年。肺纤维化患者临床表现主要为干咳，劳力性呼吸困难和患者生活质量的总体进行性恶化。在过去的十年间，对pf的发病机制和管理的认识已经发生改变，到目前已有两种药物(吡非尼酮和尼达尼布)上市并应用于临床；然而，令人遗憾的是这两种药物的肝毒性和胃肠道不良反应严重，使其在临床上的应用受到了限制；另外，虽然两种药物治疗可减缓用力呼气量下降的速度，但对于pf患者的生存质量并没有改善。所以，肺纤维化的治疗仍然是摆在人们面前的一道棘手难题。

京尼平苷(gen)是一种主要存在于茜草科(rubiaceae)植物栀子(gardeniajasminoidesellis)干燥成熟果实中的主要成分，是环烯醚萜苷类化合物，由于京尼平苷具有一些天然优势，首先大量存在于栀子的干燥果实中，制备工艺简洁，制备成本较低，其次，其化学结构稳定便于保存，研究报道，京尼平苷具有多种药理活性，包括保肝和利胆、抗炎、抗氧化等。到目前为止，并没有人报道京尼平苷抗肺纤维化治疗方面的应用。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供京尼平苷在制备抗肺纤维化药物中的应用。

本发明经过研究发现京尼平苷能够明显改善肺纤维化小鼠肺结构破坏和胶原纤维沉积，降低肺组织羟脯氨酸含量，下调纤维化相关蛋白tgf-β1、smad2/3、ctgf和p38蛋白表达，抑制肺纤维化的进程，具有明显的抗肺纤维化作用，因此将可将京尼平苷用于制备抗肺纤维化药物。

本发明所述京尼平苷抗肺纤维化的作用机制与抑制tgf-β1-smad2/3信号通路和tgf-β1-p38mapk信号通路有关。

在实际使用过程中，可以将京尼平苷与其他人体可接受的辅料制备为注射剂、吸入剂、片剂、胶囊或丸剂，用于治疗肺纤维化。

本发明在博来霉素诱导的肺纤维化小鼠模型上，研究了不同浓度的京尼平苷的作用，结果发现京尼平苷能够明显改善肺纤维化小鼠肺结构破坏和胶原纤维沉积，降低肺组织羟脯氨酸含量，具有明显的抗肺纤维化作用。

本发明所述京尼平苷在抗肺纤维化治疗过程中，小鼠给药最佳剂量为100mg/kg，按照人与小鼠体表面积换算后，通常推荐人体给药剂量用量为11mg/kg，每日给药1次；如成人体重60kg，则推荐给药剂量为660mg，每日1次。

本发明的有益效果：

(1)本发明在博来霉素诱导的肺纤维化小鼠模型上，首次评价了京尼平苷的抗肺纤维化作用，结果发现，京尼平苷能够明显改善肺纤维化小鼠肺结构破坏和胶原纤维沉积，降低肺组织羟脯氨酸含量，下调纤维化相关蛋白tgf-β1、smad2/3、ctgf和p38蛋白表达，表明京尼平苷能够抑制肺纤维化的进程，具有明显的抗肺纤维化作用。

(2)本发明所述京尼平苷与已上市药物吡非尼酮和尼达尼布比较，可以克服这两种药物的肝毒性，可用于肝功能障碍的肺纤维化患者，因此，将京尼平苷用于抗肺纤维化治疗有很好的前景。

附图说明

图1为本发明的实验方案原理图。

图2为京尼平苷(gen)改善博莱霉素(blm)诱导的肺纤维化小鼠肺系数，与ns组，model组和pfd组相比，*p<0.05，**p<0.01；#p<0.05，##p<0.01；and△p<0.05，△△p<0.01；dmx：●p<0.05，●●p<0.01。

图3为京尼平苷(gen)改善博莱霉素(blm)诱导的肺纤维化小鼠的生长曲线。

图4京尼平苷((gen)显著改善博莱霉素(blm)诱导的肺纤维化病变；图中ns：气管内滴注无菌生理盐水；model:blm；pfd：blm+吡非尼酮(50mg·kg^-1)；dxm：blm+地塞米松(2.5mg·kg^-1)；gen25：blm+gen(25mg·kg^-1)；gen50：blm+gen(50mg·kg^-1)；gen100：blm+gen(100mg·kg^-1)。

图5京尼平苷(gen)显著下调博来霉素诱导的pf小鼠肺组织中hyp的含量，图中a、b分别代表第14天和第28天时肺组织中hyp的含量。与ns组，model组和pfd组相比，*p<0.05,**p<0.01；#p<0.05,##p<0.01；and△p<0.05,△△p<0.01；dmx：●p<0.05,●●p<0.01。

图6为第14天时京尼平苷(gen)显着下调博莱霉素诱导的pf小鼠肺组织中tgf-β1和smad2/3的表达；ns,model,pfd,dxm,gen25/50/100组与图2中的相同；与ns组，model组和pfd组相比，*p<0.05,**p<0.01；#p<0.05,##p<0.01；and△p<0.05,△△p<0.01；dmx：●p<0.05,●●p<0.01。

图7为第28天时京尼平苷(gen)显着下调博莱霉素诱导的pf小鼠肺组织中tgf-β1和smad2/3的表达；

图8为第14天时京尼平苷(gen)显着下调博莱霉素诱导的pf小鼠肺组织中ctgf和p38的表达，ns,model,pfd,dxm,gen25/50/100组与图2中的相同；与ns组，model组和pfd组相比，*p<0.05,**p<0.01；#p<0.05,##p<0.01；and△p<0.05,△△p<0.01；dmx：●p<0.05,●●p<0.01。

图9为第28天时京尼平苷(gen)显着下调博莱霉素诱导的pf小鼠肺组织中ctgf和p38的表达。

图中：*、**代表与ns组统计比较的结果；#、##代表与model组比较的结果；△代表与pfd组比较的结果；●代表与dmx组比较的结果；其中，一个符号代表p<0.05，两个相同的符号代表p<0.01。

具体实施方式

下面结合附图及具体实施例本发明作进一步的详细说明，但本发明的保护范围并不限于所述内容。

实施例1

1、材料与方法

1.1药物制备

京尼平苷的提取分离：将10公斤栀子果实粉碎后以95％乙醇浸泡三次，每次12小时，过滤；合并乙醇提取液，过氧化铝柱后回收乙醇经硅胶柱层析分离，依次以氯仿、氯仿-乙醇(9:1)、氯仿-乙醇(8:2)、乙醇洗脱；氯仿-乙醇洗脱部分得到京尼平苷结晶500克，纯度>98％。

京尼平苷注射液的制备：微量分析天平准确称取京尼平苷200mg，溶解于20ml无菌生理盐水中，混匀后采用0.22μm微孔滤膜滤过除菌，分装于灭菌的试管中。

1.2动物治疗与实验方案

将总共98只昆明种成年雄性spf小鼠(7周龄，20±2g，昆明医科大学，中国)随机分配至7个组中(n＝14)：①暴露气管后一次性气管内滴注生理盐水(ns组)；②暴露气管后一次性气管内滴注blm(海正辉瑞,中国)5mg·kg^-1体重(model组)；③处理后的②+吡非尼酮(大连美仑生物技术有限公司，中国)50mg·kg^-1体重i.g.(阳性对照组，pfd组)；④处理后的②+地塞米松磷酸钠(西南制药有限公司，中国)2.5mg·kg^-1体重i.p.(阳性对照组，dxm组)；⑤处理后的⑥+生理盐水溶解的gen100mg·kg^-1体重i.p.(gen高剂量组，gen100组)；⑥处理后的②+生理盐水溶解的gen50mg·kg^-1体重i.p.(gen中剂量组，gen50组)；⑦处理后的②+生理盐水溶解的gen25mg·kg^-1体重i.p.(gen中剂量组，gen50组)。

实验第一天，所有小鼠气管内单独滴注40ul生理盐水(ns组)或生理盐水溶解的blm，随后给予阳性药物pfd(ig)、dxm(ip)或生理盐水溶解的gen(ip)治疗；每天一次，持续28天；在第14天和第28天，用水合氯醛(天津光复精细化工研究院，中国)麻醉每组小鼠并进行处理，用于肺组织病理学观察、羟脯氨酸(hyp)含量测定和蛋白免疫印迹。

将98只昆明种雄性小鼠随机分为7个组，正常对照组(ns组，n＝14)经气管滴注无菌生理盐水(ns)，其余6个组(model、pfd、dxm、gen25/50/100组，n＝14)经气管滴注blm(5mg·kg^-1)，随后每天在同一时间段给各组小鼠相应药物/ns；随后，分别在第14天和28天各处理一批小鼠。

1.3体重和肺系数：从气管滴注的第一天开始，分别于第0、1、2、3、4周的最后一天各称量一次小鼠体重，记录于表格；处理小鼠时将未进行肺泡灌洗的肺组织从小鼠胸腔取出，用湿的滤纸擦去血液并迅速用精确的电子天平称量不含气管的肺组织重量；计算肺系数[肺系数(％)＝全肺湿重(mg)/体重(g)]反应肺水肿的程度。

1.4组织病理学观察：将来自左肺上叶的肺组织在10％中性甲醛中固定24h，然后进行常规组织块脱水、石蜡包埋、切片、苏木精-伊红(h&e)和masson三色染色试剂盒(fuzhoumaxim,china)染色，使用研究级正置相差显微镜(nikoncorporation，japan)进行观察并拍照(x100)。参照组织病理学评分方法，将肺组织病变和纤维化分为4级：0级，正常(-)；1级，轻度病变(+)；2级，中度病变(++)；3级，重度病变(+++)。等级资料用计分方式表示，0级为1分，1级为2分，2级为3分，3级为4分；随机选取每张病理切片的3个视野进行评分并计算平均值；组织染色和显微镜下形态观察及病理学评分分别由专业的技术人员和经验丰富的病理学专家进行。

1.5肺组织中羟脯氨酸的含量(hyp)

通过碱水解法将来自左肺下叶的50mg肺组织样品水解，按照hyp试剂盒(南京建成生物工程研究所，中国)说明书确定hyp的含量。

1.6westernblot半定量肺匀浆中的相关蛋白

westernbiot检测各组肺组织中tgf-β1、smad2/3、ctgf和p38的表达情况。将右肺放在预冷的组织匀浆器中，加入蛋白酶抑制剂和增强型裂解液ripa(solarbio，china)，在冰浴条件下充分匀浆；4℃离心(8000g，10min)后小心取上清液，用bca法测定上清液的蛋白浓度。将离心后的样品上清液与上样缓冲液loadingbuffer(solarbio，china)混合，通过在95℃加热10min使上清液中的蛋白质变性，通过12％sds-page电泳凝胶(20ug/孔)进行分离，然后将蛋白转移至pvdf膜(0.40um)上；用tgf-β1(1:1000；proteintech,usa)、smad2/3(1:1000；cst,usa)、ctgf(1:500；r&dsystems,usa)和p38(1:1000；cst,usa)的一抗4℃孵育过夜，gapdh一抗(1：10000；proteintech，usa)作为内参以评估上样的均衡性。使用ecl化学发光试剂(bio-rad，usa)检测hrp-igg(h+l)二抗(1:5000；proteintech，usa)的结合，通过geheaithcarebio-sciencesab成像系统检测蛋白质条带，并用imagej图像分析软件分析蛋白质条带。

1.7统计分析：所有数据均以均数±sd表示；使用spss20.0统计软件包检验数据的正态分布情况(方差齐性检验)，当方差齐时通过单因素方差分析(anova)和lsd方法确定统计学差异；方差不齐时采用秩和检验(kruskal-wallish)分析；p<0.05认为差异有统计学意义。

2.结果

2.1体重和肺系数

同一阶段，model组的肺系数均显著高于ns组和gen100组(p<0.01),但与pfd组没有统计学差异(p>0.05)；有趣的是，pfd和dxm都是作为阳性对照，但前者的肺系数明显低于后者(p<0.05)(如图2a和2b)。28天时，除了ns和gen100组，model组与余各组间的差异都不显著(p>0.05)；此时ns组和gen100组之间也没有统计学差异(p>0.05)。由小鼠生长曲线可见(如图3所示)，ns组小鼠体重增长最快而dxm组增长最慢，其余各组的增长幅度相似；在除了ns和dxm以外的其余各组中，可见pfd组的体重增长相对较慢，推测是由于长期灌胃引起的，可见灌胃给药的方式对小鼠还是存在一定的伤害。

2.2小鼠肺组织的病理学形态

通过h&e和masson染色的光学显微镜检查，评估gen对blm诱导的小鼠肺泡结构破坏和间质纤维化的影响，并用肺组织病变和纤维化的评分系统描述病理学差异。染色结果显示，与对照组相比model组肺泡壁增厚及肺泡间隔变宽，而28天时可见少量肺泡塌陷，肺泡间隔断裂及淋巴细胞浸润；在肺间质及支气管周围可见大量的胶原沉积，第28天时胶原依然在累积(如图4①和②所示)。gen能显著改善包括肺泡结构破坏和纤维化在内的病理改变，特别是28天时作用更佳；然而，值得注意的是dxm虽然能有效改善肺泡结构病变但是并不能改善肺间质及支气管周围的胶原累积(如图4所示)。

组织病理学评分显示，与ns相比model组的肺泡结构病变及间质纤维化评分显著增加(p<0.01)，且肺泡结构病变评分在14天时达到峰值，随后降低；但间质纤维化评分在第28天时才达到峰值；与同期的model组相比，gen治疗能明显减弱肺泡结构病变和间质纤维化评分的增加(p<0.01)，且其作用与pfd相当(p>0.05)；遗憾的是，dxm却不能减弱间质纤维化评分的增加(p>0.05)，(如表1所示)

表1.京尼平苷(gen)显着降低博来霉素诱导的肺纤维化小鼠的组织病理学评分

与ns组，model组和pfd组相比，*p<0.05,**p<0.01；#p<0.05,##p<0.01；and△p<0.05,△△p<0.01；dmx：●p<0.05,●●p<0.01

2.3肺组织中hyp含量

小鼠肺组织中hyp的检查显示,与ns组相比，blm显著增加了model组肺组织中hyp的含量(p<0.01),且28天时达到峰值。与model组相比，gen100能显著降低hyp的含量(p<0.01)并与pfd相似(p>0.05)；另外，gen的这种效应还存在剂量依赖性。可以看到，作为新批准的用于治疗pf的pfd表现出了很好的效果(p<0.01)，但是具有抗炎优势的dxm却不能改善肺组织中hyp的含量(p>0.05)(如图5所示)。

2.4tgf-β1/smad2/3蛋白在肺组织中的表达

第14天时与ns和pfd组相比，model组tgf-β1和smad2/3的相对表达量明显增加(p<0.01)；与model组相比，gen100能显著降低肺组织中tgf-β1和smad2/3的相对表达量(p<0.01)且与pfd组相似(p>0.05)(如图6所示)；gen25组除了在第28天时能降低sand2/3的相对表达量外(p<0.05)其余均与model组不存在差异(p>0.05)，说明gen以剂量依赖的方式抑制tgf-β1和smad2/3的表达；另外，第28天时dxm与ns组之间差异存在统计学意义(p<0.05)(如图7所示)，说明dxm并不能有效抑制tgf-β1和smad2/3在肺组织中的表达。

2.5ctgf和p38在肺组织中的表达

在blm诱导后的第14和第28天，小鼠肺组织中ctgf和p38蛋白的表达均显著升高(p<0.01)；而与model组相比，gen100组的表达水平却显著降低(p<0.01)，但在gen25组中仅第28天时p38的表达显著降低(p<0.05)，这表明geniposide以剂量依赖性抑制肺纤维化小鼠肺组织中ctgf和p38的表达；另外，在第28天时dxm组中表达的ctgf与ns组之间是存在统计学差异的(p<0.01)，这表明地塞米松并不能有效降低pf小鼠肺组织中ctgf的表达；有趣的是，第28天时pfd组表达的p38也有类似的结果(p<0.01)，如图8～9所示。

3、结论

京尼平苷能够明显改善肺纤维化小鼠肺结构破坏和胶原纤维沉积，降低肺组织羟脯氨酸含量，下调纤维化相关蛋白tgf-β1、smad2/3、ctgf和p38蛋白表达，抑制肺纤维化的进程，具有明显的抗肺纤维化作用。

京尼平苷抗肺纤维化的作用机制与抑制tgf-β1-smad2/3信号通路和tgf-β1-p38mapk信号通路有关。