本发明涉及载药囊泡领域，具体为一种用于治疗胸腔积液载药囊泡的制备方法。
背景技术：
恶性胸腔积液是指原发于胸膜的恶性肿瘤或其他部位的恶性肿瘤转移至胸膜引起的胸腔积液，是中晚期肿瘤患者较为常见的并发症。最初对生活质量影响不大，但随着病程进展，会引起呼吸困难、咳嗽胸痛等症状，对病人的危害甚至超过了肿瘤本身。因此，胸腔积液逐渐成为肿瘤治疗的又一难题。
现阶段，治疗胸腔积液主要采用向胸腔注射化疗药物。但是化疗药物或多或少的对机体正常细胞进行杀伤，为了避免化疗药物对正常细胞的非特异性杀伤，现有的方案将化疗药物通过载体包裹起来，使其选择性地在肿瘤部位释放，甚至进入肿瘤细胞内，从而将肿瘤细胞杀伤，如纳米材料(聚乙二醇-脑磷脂共聚物、聚乳醛乙醇酸共聚物等)制成的微粒载体，可以用于包裹化疗药物，并可以将化疗药物定向靶向输送到胸膜的恶性肿瘤或其他部位的恶性肿瘤部位，提高化疗药物对肿瘤细胞的杀伤作用。
但是，由于纳米材料是外源性物质，不仅本身对生物机体存在一定的毒副作用，而且纳米颗粒的粒径穿过正常细胞的细胞膜，从而导致所携带的化疗药物对机体的毒副作用。
基于此，本发明设计了一种用于治疗胸腔积液载药囊泡的制备方法，以解决上述问题。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种用于治疗胸腔积液载药囊泡的制备方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种用于治疗胸腔积液载药囊泡的制备方法，包括如下步骤：
s1、向50～100ml胸腔积液中加入8～10iu/ml肝素，在800～1000rpm离心5～10min，弃上清，将沉淀加入盛有20～30mlrpmi1640与聚蔗糖(1:1，v/v)混合溶液中，混合均匀后，在1500～2000rpm离心10～20min，吸取白膜状细胞层，放入rpmi1640培养基，在36～38℃、4～6％co2培养箱内培养2～4h后，收集悬浮细胞并接种于另一组rpmi1640培养基中，在36～38℃、4～6％co2培养箱内培养18～20h，进行贴壁培养，得到贴壁肿瘤细胞；
s2、无菌条件下，挑取s1中的贴壁肿瘤细胞，放入rpmi1640培养基中，在36～38℃、4～6％co2培养箱内，进行扩大培养，所得肿瘤细胞与培养液合称为肿瘤细胞液；
s3、无菌条件下，将s2的肿瘤细胞液置于紫外线照射36～42h后，对肿瘤细胞液超声破碎20～30min，再对超声破碎后的溶液进行梯度离心，得到肿瘤囊泡溶液；
s4、无菌条件下，按体积比1～2:5，将化疗制剂溶液与s3中肿瘤囊泡溶液在20～25℃，孵育1～3h，得到混合液；
s5、无菌条件下，以2～6℃、15000～20000rpm对混合液离心50～70min，弃上清，所得沉淀即为包含化疗制剂的囊泡；
s6、向s5中的包含化疗制剂的囊泡中加入体积比1:10～12的生理盐水，所得溶液即为载药囊泡溶液。
更进一步地，所述s1与s2中的rpmi1640均选用含有8～12％胎牛血清的rpmi1640。
更进一步地，所述s2中扩大培养后的细胞量为1.5×107～2.0×107。
更进一步地，所述s3中超声破碎温度设置为2～6℃。
更进一步地，所述s3中梯度离心操作步骤如下：
a、在2～6℃下，先以1000～2000rpm对紫外线照射后的肿瘤细胞液离心5～10min，弃沉淀，再以5000～8000rpm对上一组离心后的上清液离心离心5～10min，弃沉淀，上清液液即为初步囊泡液；
b、在2～6℃、15000～20000rpm对初步囊泡液离心50～70min，弃上清，沉淀即为肿瘤囊泡；
c、将肿瘤囊泡溶液置于10～20mlpbs溶液中进行重悬，震荡混合均匀后，所得即为肿瘤囊泡溶液。
更进一步地，所述pbs溶液的ph选用7.2～7.4。
更进一步地，所述s4中的化疗制剂选用足叶乙甙、5-氟脲嘧啶或卡铂(cbp)中的一种。
更进一步地，所述s6中生理盐水的浓度选用0.8～1.0％。
采用上述的技术方案，本发明达到的有益效果是：通过从胸腔积液中提取的肿瘤细胞并对肿瘤细胞扩大培养，并对紫外线照射后的肿瘤细胞进行破碎，使得囊泡从肿瘤细胞内破出，再将化疗制剂导入囊泡，形成载药囊泡；由于该载药囊泡从该肿瘤细胞内提取，提取的囊泡具有与该肿瘤细胞具有同质性，进而使得肿瘤细胞可摄取更多的载药囊泡，同手该载药囊泡具有靶向定位同源肿瘤细胞，进而不会对正常细胞造成杀伤作用，降低载药囊泡的副作用。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种用于治疗胸腔积液载药囊泡的制备方法，包括如下步骤：
s1、向50ml胸腔积液中加入9iu/ml肝素，在800rpm离心8min，弃上清，将沉淀加入盛有20mlrpmi1640与聚蔗糖(1:1，v/v)混合溶液中，混合均匀后，在1800rpm离心14min，吸取白膜状细胞层，放入rpmi1640培养基，在36℃、4％co2培养箱内培养4h后，收集悬浮细胞并接种于另一组rpmi1640培养基中，在36℃、5％co2培养箱内培养18h，进行贴壁培养，得到贴壁肿瘤细胞；
s2、无菌条件下，挑取s1中的贴壁肿瘤细胞，放入rpmi1640培养基中，在36℃、5％co2培养箱内，进行扩大培养，所得肿瘤细胞与培养液合称为肿瘤细胞液；
s3、无菌条件下，将s2的肿瘤细胞液置于紫外线照射36h后，对肿瘤细胞液超声破碎27min，再对超声破碎后的溶液进行梯度离心，得到肿瘤囊泡溶液；
s4、无菌条件下，按体积比1:5，将化疗制剂溶液与s3中肿瘤囊泡溶液在25℃，孵育1h，得到混合液；
s5、无菌条件下，以5℃、15000rpm对混合液离心70min，弃上清，所得沉淀即为包含化疗制剂的囊泡；
s6、向s5中的包含化疗制剂的囊泡中加入体积比1:10的生理盐水，所得溶液即为载药囊泡溶液。
所述s1与s2中的rpmi1640均选用含有10％胎牛血清的rpmi1640。
所述s2中扩大培养后的细胞量为1.8×107。
所述s3中超声破碎温度设置为2℃。
所述s3中梯度离心操作步骤如下：
a、在2℃下，先以1700rpm对紫外线照射后的肿瘤细胞液离心7min，弃沉淀，再以5000rpm对上一组离心后的上清液离心离心5min，弃沉淀，上清液液即为初步囊泡液；
b、在4℃、15000rpm对初步囊泡液离心70min，弃上清，沉淀即为肿瘤囊泡；
c、将肿瘤囊泡溶液置于10mlpbs溶液中进行重悬，震荡混合均匀后，所得即为肿瘤囊泡溶液。
所述pbs溶液的ph选用7.2。
所述s4中的化疗制剂选用足叶乙甙。
更进一步地，所述s6中生理盐水的浓度选用0.9％。
实施例2
一种用于治疗胸腔积液载药囊泡的制备方法，包括如下步骤：
s1、向60ml胸腔积液中加入8iu/ml肝素，在880rpm离心10min，弃上清，将沉淀加入盛有24mlrpmi1640与聚蔗糖(1:1，v/v)混合溶液中，混合均匀后，在1650rpm离心18min，吸取白膜状细胞层，放入rpmi1640培养基，在37℃、5％co2培养箱内培养2h后，收集悬浮细胞并接种于另一组rpmi1640培养基中，在37℃、6％co2培养箱内培养20h，进行贴壁培养，得到贴壁肿瘤细胞；
s2、无菌条件下，挑取s1中的贴壁肿瘤细胞，放入rpmi1640培养基中，在37℃、5％co2培养箱内，进行扩大培养，所得肿瘤细胞与培养液合称为肿瘤细胞液；
s3、无菌条件下，将s2的肿瘤细胞液置于紫外线照射38h后，对肿瘤细胞液超声破碎23min，再对超声破碎后的溶液进行梯度离心，得到肿瘤囊泡溶液；
s4、无菌条件下，按体积比1:5，将化疗制剂溶液与s3中肿瘤囊泡溶液在23℃，孵育2h，得到混合液；
s5、无菌条件下，以4℃、17000rpm对混合液离心60min，弃上清，所得沉淀即为包含化疗制剂的囊泡；
s6、向s5中的包含化疗制剂的囊泡中加入体积比1:11的生理盐水，所得溶液即为载药囊泡溶液。
所述s1与s2中的rpmi1640均选用含有8％胎牛血清的rpmi1640。
所述s2中扩大培养后的细胞量为1.7×107。
所述s3中超声破碎温度设置为4℃。
所述s3中梯度离心操作步骤如下：
a、在4℃下，先以1000rpm对紫外线照射后的肿瘤细胞液离心10min，弃沉淀，再以6000rpm对上一组离心后的上清液离心离心7min，弃沉淀，上清液液即为初步囊泡液；
b、在6℃、17000rpm对初步囊泡液离心65min，弃上清，沉淀即为肿瘤囊泡；
c、将肿瘤囊泡溶液置于13mlpbs溶液中进行重悬，震荡混合均匀后，所得即为肿瘤囊泡溶液。
所述pbs溶液的ph选用7.3。
所述s4中的化疗制剂选用5-氟脲嘧啶。
所述s6中生理盐水的浓度选用1.0％。
实施例3
一种用于治疗胸腔积液载药囊泡的制备方法，包括如下步骤：
s1、向80ml胸腔积液中加入9iu/ml肝素，在940rpm离心6min，弃上清，将沉淀加入盛有28mlrpmi1640与聚蔗糖(1:1，v/v)混合溶液中，混合均匀后，在1500rpm离心20min，吸取白膜状细胞层，放入rpmi1640培养基，在37℃、4％co2培养箱内培养2h后，收集悬浮细胞并接种于另一组rpmi1640培养基中，在37℃、5％co2培养箱内培养19h，进行贴壁培养，得到贴壁肿瘤细胞；
s2、无菌条件下，挑取s1中的贴壁肿瘤细胞，放入rpmi1640培养基中，在37℃、4％co2培养箱内，进行扩大培养，所得肿瘤细胞与培养液合称为肿瘤细胞液；
s3、无菌条件下，将s2的肿瘤细胞液置于紫外线照射40h后，对肿瘤细胞液超声破碎30min，再对超声破碎后的溶液进行梯度离心，得到肿瘤囊泡溶液；
s4、无菌条件下，按体积比2:5，将化疗制剂溶液与s3中肿瘤囊泡溶液在23℃，孵育2h，得到混合液；
s5、无菌条件下，以2℃、19000rpm对混合液离心55min，弃上清，所得沉淀即为包含化疗制剂的囊泡；
s6、向s5中的包含化疗制剂的囊泡中加入体积比1:11的生理盐水，所得溶液即为载药囊泡溶液。
所述s1与s2中的rpmi1640均选用含有8％胎牛血清的rpmi1640。
所述s2中扩大培养后的细胞量为2.0×107。
所述s3中超声破碎温度设置为6℃。
所述s3中梯度离心操作步骤如下：
a、在6℃下，先以2000rpm对紫外线照射后的肿瘤细胞液离心5min，弃沉淀，再以7000rpm对上一组离心后的上清液离心离心9min，弃沉淀，上清液液即为初步囊泡液；
b、在2℃、19000rpm对初步囊泡液离心60min，弃上清，沉淀即为肿瘤囊泡；
c、将肿瘤囊泡溶液置于16mlpbs溶液中进行重悬，震荡混合均匀后，所得即为肿瘤囊泡溶液。
所述pbs溶液的ph选用7.2。
所述s4中的化疗制剂选用5-氟脲嘧啶。
所述s6中生理盐水的浓度选用0.9％。
实施例4
一种用于治疗胸腔积液载药囊泡的制备方法，包括如下步骤：
s1、向100ml胸腔积液中加入10iu/ml肝素，在1000rpm离心5min，弃上清，将沉淀加入盛有30mlrpmi1640与聚蔗糖(1:1，v/v)混合溶液中，混合均匀后，在2000rpm离心10min，吸取白膜状细胞层，放入rpmi1640培养基，在38℃、6％co2培养箱内培养3h后，收集悬浮细胞并接种于另一组rpmi1640培养基中，在38℃、4％co2培养箱内培养19h，进行贴壁培养，得到贴壁肿瘤细胞；
s2、无菌条件下，挑取s1中的贴壁肿瘤细胞，放入rpmi1640培养基中，在38℃、6％co2培养箱内，进行扩大培养，所得肿瘤细胞与培养液合称为肿瘤细胞液；
s3、无菌条件下，将s2的肿瘤细胞液置于紫外线照射42h后，对肿瘤细胞液超声破碎20min，再对超声破碎后的溶液进行梯度离心，得到肿瘤囊泡溶液；
s4、无菌条件下，按体积比2:5，将化疗制剂溶液与s3中肿瘤囊泡溶液在20℃，孵育3h，得到混合液；
s5、无菌条件下，以6℃、20000rpm对混合液离心50min，弃上清，所得沉淀即为包含化疗制剂的囊泡；
s6、向s5中的包含化疗制剂的囊泡中加入体积比1:12的生理盐水，所得溶液即为载药囊泡溶液。
所述s1与s2中的rpmi1640均选用含有12％胎牛血清的rpmi1640。
所述s2中扩大培养后的细胞量为1.5×107。
所述s3中超声破碎温度设置为4℃。
所述s3中梯度离心操作步骤如下：
a、在4℃下，先以1400rpm对紫外线照射后的肿瘤细胞液离心9min，弃沉淀，再以8000rpm对上一组离心后的上清液离心离心10min，弃沉淀，上清液液即为初步囊泡液；
b、在3℃、20000rpm对初步囊泡液离心50min，弃上清，沉淀即为肿瘤囊泡；
c、将肿瘤囊泡溶液置于20mlpbs溶液中进行重悬，震荡混合均匀后，所得即为肿瘤囊泡溶液。
所述pbs溶液的ph选用7.4。
所述s4中的化疗制剂选用卡铂(cbp)。
所述s6中生理盐水的浓度选用0.8％。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。