一种胶原凝胶支架及其在提高自体脂肪细胞移植存活率中的应用的制作方法

本发明属于生物医学领域，具体涉及一种胶原凝胶支架及其在提高自体脂肪细胞移植存活率中的应用。

背景技术：

喉癌手术或单侧声带麻痹可导致严重的声门闭合不良进而导致永久性失音，这是声带治疗中最具挑战性的临床问题之一。声门闭合不良是由发音时声带闭合不足引起的。声门功能不全越严重，患者的症状强度越大。研究表明，声门功能不全患者的语音质量不理想，会显著降低患者的生活质量。通过腔内注射自体脂肪可以再生部分声带结构或改善声带麻痹。但是，由于细胞易扩散、存活率低和脂肪可能被再吸收等原因，自体脂肪移植的长期预后可能会逐渐变差，存在较大的不确定性。以患者年龄段进行分组，患者声带内注射自体脂肪1年后平均失败率接近20％(在1％-42％之间)。因此，创造一个良好的环境限制和改善脂肪细胞的移植是至关重要的。

技术实现要素：

本发明的目的是提高脂肪细胞移植的存活率。

本发明首先保护一种胶原凝胶支架的制备方法，可依次包括如下步骤：

(1)取牛肌腱组织，丙酮浸泡处理5-15h(如5-10h、10-15h、5h、10h或15h)；

(2)naoh处理10-30min(如10-20min、20-30min、10min、20min或30min)；

(3)去除水分；

(4)先用醋酸浸泡36-60h(如36-48h、48-60h、36h、48h或60h)；再搅拌12-24h(如12-18h、18-24h、12h、18h或24h)；

(5)透析，收集沉淀；

(6)去除水分；

(7)用缓冲液溶解，获得胶原凝胶支架。

完成步骤(1)后、进行步骤(2)之前，还包括步骤(a)；所述步骤(a)为：充分清洗(如用水充分清洗)。

完成步骤(2)后、进行步骤(3)之前，还包括步骤(a)；所述步骤(a)为：充分清洗(如用水充分清洗)。

上述任一所述充分清洗具体可为去离子水清洗10-20次，每次清洗20min。

所述步骤(1)中，牛肌腱组织的制备方法可为：取牛腱子肉，彻底刮除脂肪组织和肌肉组织，充分清洗(如用水充分清洗)，获得牛肌腱组织。

所述步骤(1)中“丙酮浸泡处理5-15h”，期间每隔0.5h以上(如0.5h、1h、2h)更换一次丙酮。

所述步骤(2)中，naoh处理的浓度可为1-4m(如1-2m、2-4m、1m、2m或4m)。

所述步骤(2)中，naoh具体可为naoh溶液。naoh溶液具体可为naoh水溶液。

所述步骤(3)和所述步骤(6)中，去除水分通过15-25℃(如15-20℃、20-25℃、15℃、20℃或25℃)、真空冻干36-60h(如36-48h、48-60h、36h、48h或60h)实现。

所述步骤(4)中，浸泡的温度可为2-6℃(如2-4℃、4-6℃、2℃、4℃或6℃)。

所述步骤(4)中，搅拌的温度可为16℃以下(如3-10℃、10-16℃、3℃、10℃12℃、14℃或16℃)。

所述步骤(4)中，醋酸以醋酸溶液的形式存在。醋酸溶液的浓度可为3-10％(如3-7％、7-10％、3％、7％或10％)(体积比)。完成步骤(3)后获得的组织和醋酸溶液比例可为(1-5)g：150ml(如(1-3)g：150ml、(3-5)g：150ml、1g：150ml、3g：150ml或5g：150ml)。醋酸溶液可为醋酸水溶液。

所述步骤(5)中，透析至透析液的ph值达到6.8-7.2(如6.8-7.0、7.0-7.2、6.8、7.0或7.2)。透析液可为去离子水或注射水。透析液的温度可为0-10℃(如0-5℃、5-10℃、0℃、5℃或10℃)。所述透析使用的透析袋截留分子量可为3万-10万(如3万-7万、7万-10万、3万、7万或10万)。

所述步骤(5)中，收集沉淀可为取透析后的体系，4℃、5000g离心30min，收集沉淀。

所述步骤(7)中，胶原凝胶支架的浓度可为1-4％(如1-3％、3-4％、1％、3％或4％)(质量体积比)。

所述步骤(7)中，缓冲液可为磷酸盐缓冲液或生理盐水。

上述任一所述方法制备的胶原凝胶支架也属于本发明的保护范围。

本发明还保护上述任一所述方法制备的胶原凝胶支架的应用，可为a1)或a2)：

a1)提高细胞移植存活率；

a2)负载细胞。

本发明还保护上述任一所述方法制备的胶原凝胶支架的应用，可为b1)-b6)中的至少一种：

b1)修复声门损伤；

b2)治疗声门损伤；

b3)修复声门功能不全；

b4)治疗声门功能不全；

b5)制备用于减缓由缺少细胞引起的疾病的试剂；

b6)减缓由缺少细胞引起的疾病。

本发明还保护上述任一所述方法制备的胶原凝胶支架和细胞的应用，可为b1)-b6)中的至少一种：

b1)修复声门损伤；

b2)治疗声门损伤；

b3)修复声门功能不全；

b4)治疗声门功能不全；

b5)制备用于减缓由缺少细胞引起的疾病的试剂；

b6)减缓由缺少细胞引起的疾病。

上述任一所述的应用中，所述细胞可为脂肪细胞。所述脂肪细胞为自体脂肪细胞。

将10例未经手术治疗的严重声门损伤或声门功能不全患者随机分为对照组和胶原支架组(每组5例)；然后将植入物(胶原支架组的植入物为2ml胶原凝胶支架和2ml脂肪细胞液(约10⁵-10⁶个脂肪细胞)，对照组的植入物为4ml脂肪细胞液(约10⁵-10⁶个脂肪细胞)放入装有19号针头的布鲁宁注射器中，经口注射至粘膜下组织和甲状腺杓状肌中，同侧杓状软骨的声带侧突单点注射；注射深度约0.5cm，注射至杓状软骨的声带突内侧移位，真正声带出现凸弓(过矫正)。结果表明，所有患者注射的脂肪细胞均有不同程度的吸收和扩散，但胶原支架组的患者在任何情况下都没有观察到完全吸收。由此可见，胶原支架被移植到声带，从而提供了空间，无需移除额外的组织，并使环境变得稳定，更有利于细胞的存活。脂肪细胞负载的胶原凝胶支架在临床上可以有效地改善患者语音质量，从而使语音质量得到更好、更持久的恢复。与仅注射脂肪细胞相比，在患者体内注射“胶原凝胶支架和脂肪细胞”，脂肪细胞的存活时间的显著延长。本发明提供的胶原凝胶支架，不仅可有效负载脂肪细胞，而且是多孔的、可生物降解的，其可将细胞限制在移植部位，并与自体脂肪细胞联合对患有严重声带损伤和声门功能不全患者的起到很好的治疗作用。本发明具有重要的应用价值。

附图说明

图1为注射器中的胶原凝胶支架和胶原凝胶支架的电镜扫描结果。

图2为荧光显微镜下gfp阳性细胞的观察结果。

图3为胶原支架组和对照组注射3d后和7d后gfp阳性细胞的统计结果。*表示统计上的显著差异；**表示统计上的极显著差异。

图4为右侧声带迷走神经麻痹24个月的45岁女性术前和术后的声带观察。a为注射混合物前；b为注射混合物(即胶原凝胶支架装载的自体脂肪细胞)后。

图5为胶原支架组和对照组患者术前及随访不同时间的平均vhi(嗓音障碍指数)统计结果，*表示胶原支架组和对照组之间统计上的显著差异(p＝0.018)，**表示随访时间之间统计上的显著差异(p＝0.0004)，presurgery表示术前，1m表示术后1个月，3m表示术后3个月，6m表示术后6个月，12m表示术后12个月，24m表示术后24个月。

图6为胶原支架组和对照组患者术前及所有各随访点的平均mpt(最大发音时间)统计结果。presurgery表示术前，1m表示术后1个月，3m表示术后3个月，6m表示术后6个月，12m表示术后12个月，24m表示术后24个月。

图7为胶原支架组和对照组患者术前和术后不同时间点的平均振幅微扰统计结果。presurgery表示术前，1m表示术后1个月，3m表示术后3个月，6m表示术后6个月，12m表示术后12个月，24m表示术后24个月。

图8为胶原支架组和对照组患者术前和术后不同时间点的平均频率微扰统计结果。presurgery表示术前，1m表示术后1个月，3m表示术后3个月，6m表示术后6个月，12m表示术后12个月，24m表示术后24个月。

图9为胶原支架组某患者的ct图像结果。其中a为术前，b为刚刚完成手术，c为术后6月，d为术后24个月。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

pbs缓冲液：将8.0gnacl、0.2gkcl、1.44gna2hpo4和0.24gkh2po4溶于蒸馏水，调节ph值至7.2-7.4，然后用蒸馏水定容至1l。

实施例1、胶原凝胶支架的制备及其负载作用的验证

一、胶原凝胶支架的制备

1、取牛腱子肉，彻底刮除脂肪组织和肌肉组织，然后用去离子水彻底清洗，得到牛肌腱组织。

2、完成步骤1后，取所述牛肌腱组织，先用丙酮浸泡处理5-15h(期间每隔1h换液一次)，然后用去离子水清洗10-20次，每次清洗20min。

3、取完成步骤2的组织，先用浓度为2m的naoh水溶液浸泡处理20min，然后用去离子水清洗20次(ph值达到中性)，每次清洗5min。

4、取完成步骤3的组织，20℃、真空(0.1mpa真空度)冻干48h。

5、取完成步骤4的组织1-5g，加入150ml预冷的浓度为3％-10％(v/v)醋酸水溶液，4℃浸泡48h，然后低温(16℃以下)搅拌12-24h。

6、将完成步骤5的体系装入透析袋(透析袋截留分子量为3万-10万)，透析外液为0-10℃去离子水，然后透析7-14d(每天换液2-5次)，直至透析外液的ph值与去离子水接近。

7、完成步骤6后，取透析袋内的体系，4℃、5000g离心30min，收集沉淀。

8、完成步骤7后，取所述沉淀，20℃、真空(0.1mpa真空度)冻干48h，得到冻干后物质。

9、完成步骤8后，将所述冻干后物质溶于缓冲液(如磷酸盐缓冲液或生理盐水)，得到浓度为1-4％(m/v)的注射型胶原凝胶。

步骤9得到的浓度为1-4％(m/v)的注射型胶原凝胶即为制备的胶原凝胶支架。

图1中a为注射器中的胶原凝胶支架。

用扫描电镜检测胶原凝胶支架。结果见图1中b(150倍放大，比例尺为100μm)和图1中c(500倍放大，比例尺为10μm)。结果表明，胶原凝胶支架内部为适合细胞附着的胶原纤维的网状结构。

二、胶原凝胶支架对大鼠脂肪细胞的负载作用验证

1、gfp标记大鼠的脂肪细胞的制备

gfp标记大鼠由本发明的发明人委托北京维通利华实验动物技术有限公司构建而成。

(1)将gfp标记大鼠处死，然后用75％(v/v)乙醇水溶液消毒5min。

(2)完成步骤(1)后，取gfp标记大鼠的腹股沟脂肪垫，剥离脂肪组织中的淋巴结，用pbs缓冲液浸泡3次，每次5min。

(3)取完成步骤(2)的腹股沟脂肪垫，先用剪刀切碎(大小约为0.5mm×0.5mm)，然后加入i型胶原酶溶液，37℃、60rpm振荡消化2h，最后用滤膜(直径为80μm)过滤，收集滤液。

i型胶原酶溶液为广州鼎国生物技术有限公司的产品，产品目录号为dh070。使用浓度为0.1％(v/v)。

(4)完成步骤(3)后，取所述滤液，1000rpm离心5min，收集沉淀；然后用含10％(v/v)胎牛血清的dmem培养基重悬，37℃、5co2培养，隔天换液，得到gfp标记大鼠的脂肪细胞。

2、胶原凝胶支架对大鼠脂肪细胞的负载作用验证

取6周龄、体重为160-180g的sd大鼠6只，随机分为胶原支架组和对照组两组(每组3只)，进行如下实验：

a、胶原支架组

每只sd大鼠进行如下操作：

(1)将200μl胶原凝胶支架和4×10⁵个gfp标记大鼠的脂肪细胞混合，然后注射至sd大鼠皮下组织；

(2)完成步骤(1)第3d或第7d，收集所有含有gfp标记的组织，先用4％(m/v)多聚甲醛水溶液固定，之后用20％(m/v)蔗糖水溶液脱水24h，最后用30％(m/v)蔗糖水溶液脱水24h；

(3)取完成步骤(2)的组织，先用包埋剂包埋，然后采用徕卡cm1950冷冻切片机进行10μm切片，切片采用gfp抗体(abcam公司的产品，产品目录号为ab290)和dapi染色，最后利用荧光显微镜统计gfp阳性细胞的数量。

b、对照组

按照胶原支架组的步骤，将步骤(1)中的胶原凝胶支架替换为pbs缓冲液，其它步骤均不变。

实验结果见图2(a为对照组(第3d)，b为胶原支架组(第3d)，c为对照组(第7d)，d为胶原支架组(第7d))。结果表明，向sd大鼠皮下组织注射“pbs缓冲液和gfp标记大鼠的脂肪细胞”，第3d和第7d均没有gfp阳性细胞；向sd大鼠皮下组织注射“胶原凝胶支架和gfp标记大鼠的脂肪细胞”，第3d和第7d均发现大量的gfp阳性细胞。胶原支架组和对照组在第3d和第7d分别具有显著的统计学差异(见图3)，说明胶原凝胶支架促进了注射部位外源性细胞(即gfp标记大鼠的脂肪细胞)的驻留。

上述结果表明，实施例1制备的胶原凝胶支架对大鼠脂肪细胞具有负载作用，可以促进外源性细胞的驻留。

实施例2、胶原凝胶支架在治疗声门损伤或声门功能不全中的应用

1、患者情况

10例未经手术治疗的严重声门损伤或声门功能不全患者转诊至北京协和医院耳鼻喉科。在基线评估和声门功能不全分级后，10例患者被随机分为对照组和胶原支架组(每组5例)。

2、临床试验

每位患者进行的临床试验如下：

(1)患者经气管插管全身麻醉后，在严格无菌的条件下，从下腹部取自体脂肪细胞(autologousfatcells，afcs)。

(2)完成步骤(1)后，取所述afcs，利用科尔曼自体脂肪移植技术在1-2atm负压下获取脂肪细胞液。

(3)取步骤(2)获取的脂肪细胞液，室温静置5min，此时由上而下分为三层(由上而下依次命名为层1、层2和层3)。

(4)完成步骤(3)后，取层2(含有最多的脂肪细胞)，过滤，收集滤液；将滤液排干，得到脂肪细胞液。

(5)将2ml胶原凝胶支架和2ml脂肪细胞液(约10⁵-10⁶个脂肪细胞)混合，得到约4ml混合物。

(6)将植入物(胶原支架组的植入物为4ml混合物，对照组的植入物为4ml脂肪细胞液(约10⁵-10⁶个脂肪细胞)放入装有19号针头的布鲁宁注射器中，然后经口注射至粘膜下组织和甲状腺杓状肌中(见图4)，同侧杓状软骨的声带侧突单点注射。注射深度约0.5cm，注射至杓状软骨的声带突内侧移位，真正声带出现凸弓(过矫正)。

一名外科医生进行了全部手术。术后24h给予预防性抗生素，未使用类固醇。

3、术后随访

关于病理情况和功能恢复情况，通过患者定期复诊(1个月、3个月、6个月、12个月和24个月)获得，无失访情况。10例患者随访至少24个月，术后24个月无患者死亡。

性别、年龄、相关神经病变、相关肺切除术、潜在瘤变、损伤原因、损伤侧、起病延迟和症状严重程度等独立因素也被检测与最终成功的腔内注射是否存在相关性。

4、语音评价

语音评价方法：利用简体中文版“语音障碍指数”(嗓音障碍指数)为量表进行评价，共30项，分为三个亚量表，以评估语音障碍所造成的功能、身体及情绪上的障碍。亚量表得分范围从0到50，总分范围从0到150，得分越高表明损伤程度越高。

语音声学分析数据采用praat程序进行分析(paulboersma和davidweenink，荷兰)。持续的元音“a”在隔音室录制。研究中考虑三个变量：频率微扰(％)、振幅微扰(％)和最大发声时间(mpt)。声学分析在所有10例中都是可行的。使用mpt测试声门效率：受试者将元音“a”保持在一个舒适的音高和音量；连续进行了三次试验，取最佳结果。

使用grbas量表进行感知语音评估。该评估得分包括：主观评分言语障碍分级(g),粗糙度(r)、气息(b)、无力(a)和紧张(s)。声音样本使用距离病人口部5cm的动圈式麦克风(美国美国舒尔sm81)在一个隔音的房间里进行记录。患者发出持续的“a”，重复单一的单词和句子,并进行对话。随后，三位有经验的独立听者对录音进行评估，并以常规的方式评分(0＝正常；1＝轻微扰动；2＝中度扰动；和3＝严重扰动)。计算g、r、b评分进行结果评价。

实验结果如下：

所有的评估中(见表1)，嗓音障碍指数自我评估被认为是最可靠的语音质量评估。两组嗓音障碍指数均较术前发生变化，且在随访时间不同的基线间有显著改善(见图5)，说明无论有无胶原凝胶支架的afcs均能提高语音质量。但胶原支架组与对照组在整体上也有显著性差异(见图5)，从术前到之后的所有随访，胶原支架组的改善情况均优于对照组。

将年龄和性别作为协变量纳入静态模型，因为它们可能是潜在的影响因素。从曲线图上看，似乎出现了“反弹”现象，对照组注射6个月后开始失效，而胶原支架组则没有出现这种失效。

客观声学分析，包括最大发音时间、频率微扰和振幅微扰(见表1)。两组之间的最大发音时间、振幅微扰和频率微扰均无显著性差异(见图6、图7和图8)。

所有被分析的变量(性别、年龄、相关症状、损伤原因或损伤发生之间的延迟)在统计上均与afcs注射后的最终功能结果无关。

表1.术前和术后1、3、6、12、24个月随访的10例患者的语音声学评估数据

(数据显示为平均值±标准偏差)

5、脂肪细胞在患者体内的存活时间

分别在术前、术后(刚刚完成手术)、术后6月和术后24个月进行计算机断层扫描(ct)，一方面确定注射部位的准确性，另一方面对脂肪细胞的存活率进行粗略估计。

结果表明，所有患者注射的脂肪细胞均有不同程度的吸收和扩散，但胶原支架组的患者在任何情况下都没有观察到完全吸收。胶原支架组某患者的ct图像结果见图9。结果表明，与仅注射脂肪细胞相比，在患者体内注射“胶原凝胶支架和脂肪细胞”，脂肪细胞的存活时间的显著延长。