用于治疗肠道菌群紊乱及肠屏障功能受损的灵芝子实体微生物发酵制剂的制作方法

本发明涉及发酵工程领域，具体是涉及一种用于治疗肠道菌群紊乱及肠屏障功能受损的灵芝子实体微生物发酵制剂。

背景技术：

灵芝(学名：ganodermalucidumkarst)，外形呈伞状，菌盖肾形、半圆形或近圆形，为多孔菌科真菌灵芝的子实体。灵芝对神经衰弱、炎症、高脂血症、冠心病心绞痛等各有不同程度的疗效。

子实体(fruitingbody)是高等真菌的产孢构造，即果实体，由已组织化了的菌丝体组成，是食用菌、药用菌的主要食用、药用的部分。灵芝子实体粉指的是灵芝子实体经过超微粉碎技术粉碎后的粉末，实际上就是灵芝子实体的粉状形态，相对于灵芝子实体来说更容易消化吸收利用。

枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)，是芽孢杆菌属的一种，需氧菌，这种微生物的特性是：

1、作为β-葡聚糖酶(可分解灵芝多糖)的主要产生菌。

2、可迅速消耗肠道中的游离氧，造成肠道低氧，促进有益厌氧菌生长，间接抑制其它致病菌生长。

3、刺激免疫器官的生长发育，激活t、b淋巴细胞，提高免疫球蛋白和抗体水平，提高群体免疫力。

4、菌体生长过程中产生的枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短杆菌肽等活性物质，对致病菌或条件致病菌有明显的抑制作用。

如何合理利用灵芝子实体与枯草芽孢杆菌共同发酵以制备一种用于治疗肠道菌群紊乱及肠屏障功能受损的灵芝子实体微生物发酵制剂，是一项值得深入研究的课题，目前未见相关文献报道。

技术实现要素：

针对现有技术中存在的技术问题，本发明的目的在于提供一种用于治疗肠道菌群紊乱及肠屏障功能受损的灵芝子实体微生物发酵制剂，能有效改善因菌群紊乱导致的肠屏障功能受损。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案为：一种用于治疗肠道菌群紊乱及肠屏障功能受损的灵芝子实体微生物发酵制剂，利用灵芝子实体提取液和益生菌菌株共同发酵获得发酵产品，以改善因菌群紊乱导致的肠屏障功能受损。

一种用于治疗肠道菌群紊乱及肠屏障功能受损的灵芝子实体微生物发酵制剂的制备方法，步骤如下：

1)、配制含灵芝提取液的mrs培养基：

将灵芝子实体粉制成灵芝提取液，然后加入到mrs培养基中，经过高压处理，制成含灵芝提取液的mrs培养基；

2)、接种、发酵

将益生菌菌株接入到上述含灵芝提取液的mrs培养基中，发酵得到灵芝子实体微生物发酵制剂。

作为本发明的优选技术方案，制备方法中：

优选首先将灵芝子实体粉配制成浓度为5-35mg/ml的灵芝提取液，然后加入到含糖0.1-1％的mrs培养基中。进一步优选首先将灵芝子实体粉配制成浓度为33.2mg/ml的灵芝提取液，然后加入到含糖0.5％的mrs培养基中。

优选接种的益生菌为枯草芽孢杆菌，将枯草芽孢杆菌菌株以1％的浓度接入到上述含灵芝提取液的mrs培养基中，接种后在37℃环境下厌氧培养48h进行发酵。

与现有技术相比，本发明的有益效果表现在：

本发明的灵芝子实体微生物发酵制剂，利用灵芝子实体提取液和益生菌菌株共同发酵获得发酵产品，可以改善因菌群紊乱导致的肠屏障功能受损。

附图说明

图1是益生菌生长曲线图。

图2是总糖含量曲线图。

图3是发酵前后组分对比图。

图4是小鼠体重变化图。

图5是盲肠指数变化图。

图6是盲肠大小对比图。

图7是结肠he染色病理切片。

图8是血清检测结果图。

图9-12分别是脾脏cd3⁺t细胞、cd4⁺t细胞、cd8⁺t细胞、巨噬细胞变化情况图。

图13-16分别是16srdna高通量测序检测肠道菌群图的alpha多样性、beta多样性、otu(genuslevel)、lefse。

具体实施方式

为进一步描述本发明，下面结合实施例对本发明作进一步详细说明，但并不因此将本发明限制在的实施例范围之内。

实施例1

一种用于治疗肠道菌群紊乱及肠屏障功能受损的灵芝子实体微生物发酵制剂的制备方法，步骤如下：

1)、菌种筛选：从下列几种益生菌菌种中筛选出能在灵芝培养基中生长的菌种，包括枯草芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌、短双岐杆菌、干酪乳杆菌、假小链双歧杆菌和加氏乳杆菌。

2)、配制含低、中、高三种浓度灵芝提取液的mrs培养基

用水将灵芝子实体粉分别配制成8.8mg/ml、16.6mg/ml、33.2mg/ml三种浓度的灵芝提取液，然后分别加入到含糖0.5％的mrs培养基中，经过高压处理，制成含灵芝提取液的mrs培养基。

3)、接种、发酵

将上述各种益生菌菌株分别以1％的浓度接入到上述各种含灵芝提取液的mrs培养基中，37℃环境下厌氧培养48h，得到灵芝子实体微生物发酵制剂产品。

下面通过实施例来观察各组实验微生物生长情况及测定总糖含量，并且将其应用于模动物型以观察各组实验获得生物发酵制剂的应用效果。

实施例2

灵芝子实体益生菌发酵液中益生菌生长情况、总糖含量测定。

微生物生长情况：在620nm处测定od值并进行生长曲线绘制，得到益生菌生长情况。

总糖含量测定：葡萄糖为标准品，采用苯酚-浓硫酸法，取干净试管6支并编号，分别吸取0.1mg/ml标准葡萄糖溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml于试管内，再用蒸馏水补足至1ml，各试管分别加6％苯酚1ml以及浓硫酸5ml，充分混匀并静置10min。30℃水浴锅反应20min，取适量反应液在490nm处测定吸光度，以葡萄糖浓度(ug/ml)为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。取发酵液2ml，加水5ml，浓盐酸1.5ml，100℃水浴3h，蒸馏水定容至25ml。吸取上述液体0.1ml于试管中，加蒸馏水0.9ml，各试管分别加1.0ml苯酚试剂及5.0ml浓硫酸，反应液充分混合，静置10min，30℃水浴锅中反应20min。取适量反应液在490nm处检测吸光度，按公式计算发酵液中总糖浓度(mg/ml)。从而了解发酵液中糖类分解规律，检测发酵前后是否产生组分变化。

检测结果如图1-3所示，可以看出枯草芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌、短双歧杆菌菌株可以利用灵芝子实体提取液生长(图1所示)，且浓度33.2mg/ml时条件较为适宜、其总糖含量较高(图2所示)。通过液相色谱检测，枯草芽孢杆菌发酵前后组分改变较为明显(图3所示)。下面通过利用枯草芽孢杆菌发酵获得的益生菌发酵液观察其在肠道菌群紊乱及肠屏障功能受损模动物型上的应用。

实施例3

灵芝子实体-枯草芽孢杆菌发酵液(通过枯草芽孢杆菌(如dm9610等)接种发酵获得，制备方法同实施例1)在肠道菌群紊乱及肠屏障功能受损模动物型上的应用。

主要观察动物体重变化情况、粪便情况、盲肠指数；结肠组织he染色病理学检测；流式细胞仪分析脾脏cd3⁺t细胞、cd4⁺t细胞、cd8⁺t细胞、巨噬细胞变化情况；elisa双抗体夹心法检测il-10、il-6、tnf-α、lps；16srdna高通量测序检测肠道菌群。具体步骤为：

用6～8周龄雄性balb/c小鼠构建动物模型，并分为5组(每组7只)，分别为对照(con)组、抗生素(cs)组，发酵液治疗(ft)组，发酵液预防(fp)组，灵芝(gl)组。除con组、fp组外其余3组小鼠给予400mg/ml头孢曲松钠0.2ml，1天2次灌服7天，建立肠道受损模型。第8天起给予ft组灵芝发酵液0.2ml，gl组灵芝液0.2ml、连续灌喂7日。fp组全程头孢曲松钠与灵芝发酵液混合灌喂。第15日摘眼球处死各组小鼠。取血，结肠，粪便，脾等组织。绘制小鼠体重变化曲线；各组盲肠指数；结肠组织he染色病理学检测；流式细胞仪分析脾脏t细胞、cd4⁺t细胞、cd8⁺t细胞、巨噬细胞变化情况。elisa双抗体夹心法检测il-10、il-6、tnf-α、lps；16srdna高通量测序检测肠道菌群。

实验结果表明：

1、灵芝子实体-枯草芽孢杆菌发酵液使抗生素诱导的肠道菌群紊乱及肠屏障受损小鼠体重恢复(图4所示)，可以看出抗生素模型组(cs)体重最低，发酵液治疗组(ft)与发酵液预防组(fp)体重恢复到与正常对照组相当的水平，且恢复体重效果优于灵芝提取液组(gl)，且通过观察稀便情况缓解更快。

2、盲肠指数显示与抗生素组(cs)相比，各组均上升(图5所示)。

3、抗生素组(cs)盲肠大小明显大于其他各组(图6所示)。

4、结肠he染色病理切片显示：con组小鼠结肠组织完好，未见炎细胞浸润。cs组粘膜及粘膜下层以中性粒细胞为主的大量炎性细胞浸润，水肿明显。ft、fp、gl各组粘膜及粘膜下层浸润减轻(图7所示)。

5、elisa(双抗体夹心法)检测血清结果显示cs组il-6、tnf-α、lps高于其他各组，il-10低于其他各组。经过灵芝子实体发酵液、灵芝子实体提取液治疗各炎症指标均下降、肠道通透性降低。(图8所示)。

6、流式细胞术显示：灵芝子实体-枯草芽孢杆菌发酵液可缓解t细胞、cd4⁺t细胞、cd8⁺t细胞比例的过度上调(图9-12所示)。

7、16srdna高通量检测肠道菌群，灵芝子实体发酵液可增加菌群丰富度，上调乳酸菌属、布劳特氏菌属、毛螺菌属、拟杆菌属等(图13-16所示)。

以上所述仅仅是对本发明的构思所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明的构思或者超越本权利要求书所定义的范围，均属于本发明的保护范围。