本申请要求日本专利申请号2018-078272的优先权权益，其完整内容通过引用结合于此。
本公开涉及用于保护心肌细胞的组合物。
背景技术：
在心脏疾病诸如心肌梗死(myocardialinfarction)和扩张型心肌病(dilatedcardiomyopathy)中，负责心脏的泵功能的心肌细胞受损并且最终变性或坏死。由于通常心肌细胞不能再生，因此这样的疾病的一种可能的治疗可以是保护受损的心肌细胞以防止它们的变性和坏死。然而，尚未确立这样的疗法。
心肌梗死是其中冠状动脉的阻塞或狭窄使血流量减少而引起心肌缺血和坏死的疾病。这是慢性心力衰竭(chronicheartfailure)的主要原因。已经通过用于治疗急性心肌梗死的再灌注疗法来改善归因于心肌梗死的死亡率和预后，其中通过溶栓或使用诸如气囊导管或支架的设备的外科技术来恢复冠状动脉的血流量。然而，再灌注疗法造成再灌注损伤的新问题，其意味着在再灌注期间由钙离子的细胞内流入和活性氧物质的产生引起的对心肌细胞的损害。伴随着再灌注疗法的发展，对抑制再灌注损伤的需求不断增长。尽管已知一些减少活性氧物质的药剂(非专利文献1和2)，但是没有一种已经应用于临床实践。同样地，尚未确立通过任何其他机制的再灌注损伤的抑制。
某些4-氨基-萘-1-磺酸衍生物具有vcp(含缬酪肽蛋白)atp酶抑制活性，并且被认为对于治疗多种疾病是有效的(专利文献1)。尤其是，已知它们在治疗或预防一些眼病和瘦素抵抗方面有效(专利文献2至5)。
参考文献
专利文献
[专利文献1]wo2012/014994
[专利文献2]wo2012/043891
[专利文献3]wo2014/129495
[专利文献4]wo2015/129809
[专利文献5]wo2015/033981
非专利文献
[非专利文献1]duanj等，protectiveeffectofbutinagainstischemia/reperfusion-inducedmyocardialinjuryindiabeticmice:involvementoftheampk/gsk-3β/nrf2signalingpathway(紫铆素对糖尿病小鼠中的缺血/再灌注引起的心肌损伤的保护作用：涉及ampk/gsk-3β/nrf2信号转导通路).scirep.2017；7:41491。
[非专利文献2]baes,parkm,kangc,dilmens,kangth,kangdg,keq,leesu,leed,kangpm.hydrogenperoxide-responsivenanoparticlereducesmyocardialischemia/reperfusioninjury(过氧化氢响应性纳米粒子减少心肌缺血/再灌注损伤).jamheartassoc.2016年11月14日；5(11)。
概述
本公开的一个目的是提供一种用于保护心肌细胞的组合物。
本发明人已经发现，vcp抑制剂可以保护心肌细胞并且对于治疗心脏疾病(诸如心肌梗死)是有效的。
因此，本公开的一个方面提供了一种用于保护心肌细胞的组合物，所述组合物包含式(i)的化合物或者其酯、氧化物、前药、药用盐或溶剂化物：
其中
ra选自由以下各项组成的组：卤素、羟基、烷基、卤素取代的烷基、芳基、卤素取代或烷基取代的芳基、烷氧基、羟基取代或羧基取代的烷氧基、芳氧基、卤素取代或烷基取代的芳氧基、cho、c(o)-烷基、c(o)-芳基、c(o)-烷基-羧基、c(o)-亚烷基-羧基酯和氰基，并且
m为选自0至4的整数。
本公开的另一个方面提供了一种用于治疗心肌梗死的药物组合物，所述药物组合物包含式(i)的化合物或者其酯、氧化物、前药、药用盐或溶剂化物。
根据本公开，提供了一种用于保护心肌细胞的组合物。
附图说明
图1示出了人体器官中的vcp的表达水平。
图2示出了小鼠器官中的vcp的表达水平。
图3示出了从小鼠心脏分离的心肌细胞和成纤维细胞中的vcp的表达水平。
图4示出了在具有衣霉素(tunicamycin)的情况下在内质网应激(erstress)下培养的大鼠成心肌细胞(cardiomyoblast)的细胞数量和atp水平。向kus121(+)组中加入25、50、100或200μmkus121。*：p<0.05vs.tm(+)kus(-)。
图5示出了在具有衣霉素的情况下在内质网应激下培养的大鼠成心肌细胞中的chop和bip的蛋白质印迹的结果。向kus121(+)组中加入200μmkus121。
图6示出了通过葡萄糖耗尽在内质网应激下培养的大鼠成心肌细胞的细胞数量和atp水平。向kus121(+)组中加入25、50、100或200μmkus121。*：p<0.05vs.葡萄糖(-)kus(-)。
图7示出了通过葡萄糖耗尽在内质网应激下培养的大鼠成心肌细胞中的chop和bip的蛋白质印迹的结果。向kus121(+)组中加入200μmkus121。
图8示出了在缺血之前和在再灌注之后将kus121腹膜内施用至心脏缺血和再灌注损伤模型小鼠的时间表的示意图。在缺血之前以及在再灌注之后每24小时，以160mg/kg的剂量腹膜内施用kus121。
图9示出了心脏缺血和再灌注损伤模型小鼠中的梗死面积与左心室面积的比率和chop的表达水平，其中在缺血之前和在再灌注之后向所述心脏缺血和再灌注损伤模型小鼠腹膜内施用kus121。
图10示出了在心脏缺血和再灌注损伤模型小鼠中评价的心脏功能，其中在缺血之前和在再灌注之后向所述心脏缺血和再灌注损伤模型小鼠腹膜内施用kus121。左图：左心室缩短分数，右图：左心室射血分数。
图11示出了来自a组小鼠的心脏缺血和再灌注损伤模型小鼠的心脏atp水平，其中在缺血之前向所述心脏缺血和再灌注损伤模型小鼠腹膜内施用kus121。
图12示出了在再灌注之后将kus121施用至心脏缺血和再灌注损伤模型小鼠的时间表以及在手术后7天确定的梗死面积与左心室面积的比率。在再灌注之后，立即以80mg/kg体重的剂量静脉内施用kus121，并且以80mg/kg体重的剂量冠状动脉内施用kus121。随后，每24小时以160mg/kg体重的剂量腹膜内施用kus121。
图13示出了在再灌注之后将kus121施用至心脏缺血和再灌注损伤模型小鼠的时间表以及在手术后7天确定的梗死面积与左心室面积的比率。在再灌注之后，立即以25mg/kg体重的剂量静脉内施用kus121，并且以25mg/kg体重的剂量冠状动脉内施用kus121。
图14示出了在再灌注之后将kus121施用至心脏缺血和再灌注损伤模型小鼠的时间表以及在手术后7天确定的梗死面积与左心室面积的比率。在再灌注之后，立即以8mg/kg体重的剂量静脉内施用kus121，并且以8mg/kg体重的剂量冠状动脉内施用kus121。
图15示出了将kus121施用至心脏缺血和再灌注损伤模型猪的时间表的示意图。剂量为4mg/kg体重的kus121的静脉内输注在缺血后45分钟开始并且持续3小时。另外，在再灌注之后，立即以0.16mg/kg体重的剂量冠状动脉内施用kus121。
图16示出了在心脏缺血和再灌注损伤模型猪中的梗死面积与左心室面积的比率。
图17示出了在心脏缺血和再灌注损伤模型猪中评价的心脏功能。图a：左心室射血分数，图b：舒张末期容积，图c：收缩末期容积，图d：心输出量，图e：左心室质量。
图18示出了在心脏缺血和再灌注损伤模型猪中的组织学分析的结果。左图：相对于左心室的危险面积(areaatrisk)，右图：相对于危险面积的梗死面积。
图19示出了在再灌注之后在心脏缺血和再灌注损伤模型猪中的kus121的冠状动脉内施用的时间表，梗死面积与左心室的比率(左)，危险面积与左心室的比率(中)，以及梗死面积与危险面积的比率(右)。在再灌注之后，以0.64、2.5或5.0mg/kg体重的剂量冠状动脉内施用kus121。
详述
当数值伴有术语“约”时，该值旨在表示在所述值的-10％至所述值的+10％范围内的任何值。例如，“约20”意指“从18到22的值”。用下限值和上限值限定的范围涵盖从下限到上限的所有值，包括两个界限值。当范围伴有术语“约”时，两个界限被解读为伴有该术语。例如，“约20至30”被解读为“18至33”。
除非另外限定，本文中使用的术语如诸如有机化学、医学科学、药物科学、分子生物学和微生物学的技术领域中的技术人员通常所理解的进行解读。本文中使用的一些术语如下定义。本文中的定义优先于一般的理解。
术语“烷基”是指具有1至10个、优选1至6个碳原子的一价饱和脂族烃基。烷基基团的实例包括但不限于直链和支链的烃基，诸如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基和新戊基。
作为修饰基团名称的用语的术语“取代的”表示该基团的一个或多个氢原子相同地或不同地被一个或多个指定取代基取代。
术语“亚烷基”是指具有1至10个、优选1至6个碳原子的二价饱和脂族烃基。亚烷基基团包括支链和直链的烃基。
术语“烷氧基”是指-o-烷基基团，其中烷基基团如本文中所定义。烷氧基基团的实例包括但不限于甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、叔丁氧基、仲丁氧基和正戊氧基。
术语“芳基”是指具有单个环(例如苯基)或多个稠合环(例如萘基或蒽基)的6至14个碳原子的一价芳族碳环基团。典型的芳基基团包括苯基和萘基。
术语“芳氧基”是指-o-芳基基团，其中芳基基团如本文中所定义。芳氧基基团的实例包括苯氧基和萘氧基。
术语“氰基”是指-cn基团。
术语“羧基(carboxyl或carboxy)”是指-cooh基团或其盐。
术语“羧基酯”是指-c(o)o-烷基基团，其中烷基基团如本文中所定义。
术语“卤素(halo)”是指卤素(halogen)，尤其是氟、氯、溴或碘。
术语“羟基”是指-oh基团。
除非另外指明，本文中未明确定义的取代基通过以下方式命名：首先描述取代基的末端官能团的名称，随后描述朝向与化合物的其余部分结合的点的一个或多个相邻官能团。例如，取代基“芳基烷基氧基羰基”是指(芳基)-(烷基)-o-c(o)-。
一些式(i)的化合物具有对映异构体或非对映异构体，这取决于它们的取代基的排列。一些式(i)的化合物可以作为外消旋混合物提供，或者可以以通过已知方法分离的立体异构纯形式提供。一些式(i)的化合物可以是互变异构体。
术语“酯”是指在体内水解的酯，其可以在人体内容易地分解以留下母体化合物或其盐。合适的酯包括例如来源于药用脂族羧酸(尤其是烷酸、烯酸、环烷酸和烷二酸(alkanedioicacid))的那些，其中每个烷基或烯基基团具有例如不超过六个碳原子。酯的实例包括甲酸酯、乙酸酯、丙酸酯、丁酸酯、丙烯酸酯和乙基琥珀酸酯。
术语“氧化物”是指其中杂芳基基团中的氮被氧化而形成n-氧化物的氧化物。
术语“前药”是指在合理医学判断范围内适用于与人和动物组织接触而无过度的不良作用(诸如毒性、刺激性和变态反应)、与合理的收益/风险比相称并且在其预期用途方面有效的化合物的前药。前药例如通过在血液中水解而在体内快速地转化以生成由上式表示的母体化合物。在t.higuchi和v.stella,pro-drugsasnoveldeliverysystems(作为新型递送体系的前药),thea.c.s.symposiumseries的第14卷和在edwardb.roche编著,bioreversiblecarriersindrugdesign(药物设计中的生物可逆载体),americanpharmaceuticalassociationandpergamonpress,1987中提供了一般讨论，这二者均通过引用结合于此。
术语“药用盐”可以表示式(i)的化合物与无机酸或有机酸的盐。优选的盐包括：与无机酸诸如盐酸、氢溴酸、磷酸和硫酸的盐，以及与有机羧酸和磺酸诸如乙酸、三氟乙酸、丙酸、马来酸、富马酸、苹果酸、柠檬酸、酒石酸、乳酸、苯甲酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、甲苯磺酸、萘磺酸和萘二磺酸的盐。
药用盐还包括与常规碱的盐，诸如碱金属盐，例如钠盐和钾盐，碱土金属盐，例如钙盐和镁盐，来源于氨和有机胺(例如二乙胺、三乙胺、乙基二异丙胺、普鲁卡因、二苄胺、n-甲基吗啉、二氢松香胺(dihydroabiethylamine)、甲基哌啶、l-精氨酸、肌酸、胆碱、l-赖氨酸、乙二胺、n,n-二苄基乙二胺(benzathine)、乙醇胺、葡甲胺和氨丁三醇)的铵盐，尤其是钠盐。
术语“溶剂化物”意指与固态或液态的溶剂分子配位形成配合物的式(i)的化合物。合适的溶剂化物是水合物。
如本文中使用的术语“式(i)的化合物”旨在包括其酯、氧化物、前药、药用盐和溶剂化物，只要情况允许即可。
在一个实施方案中，式(i)中的每个ra基团都独立地选自由以下各项组成的组：卤素、羟基、烷基、卤素取代的烷基和烷氧基。
在一个实施方案中，式(i)中的每个ra基团都独立地选自由卤素和烷基组成的组。
在一个实施方案中，式(i)具有两个ra基团，所述两个ra基团是卤素和烷基。
在一个实施方案中，式(i)的化合物选自下表1中列出的化合物：
[表1-1]
[表1-2]
[表1-3]
在一个实施方案中，活性成分是由下式表示的4-氨基-3-[6-(4-氟-2-甲基苯基)吡啶-3-基偶氮基]萘-1-磺酸：
或其酯、氧化物、前药、药用盐或溶剂化物，尤其是钠盐。
在wo2012/014994(专利文献1)中详细描述了式(i)的化合物(尤其是上面列出的化合物)的特征以及其合成方法。
如以下实施例所证实的，式(i)的化合物可以保护心肌细胞。因此，本公开的一个方面提供了一种用于保护心肌细胞的组合物，所述组合物包含式(i)的化合物。如本文中使用的术语“保护心肌细胞”或“心肌细胞保护”意指抑制心肌细胞死亡和/或抑制心肌细胞的缺血性损伤和/或再灌注损伤或其进展。在一个实施方案中，通过保护心肌细胞，可以维持心脏功能，和/或可以抑制对心脏功能的损害，因此可以治疗或预防与心肌细胞死亡相关的心脏疾病，诸如心肌梗死、慢性心力衰竭、高血压性心力衰竭或扩张型心肌病。
如其中深入地试验了式(i)的化合物在治疗心肌梗死中的效果的实施例中所证实的，即使在式(i)的化合物在再灌注期间通过单次冠状动脉内施用进行施用时，它们也可以有效地抑制对心脏功能的损害。因此，本公开的一个方面提供了一种用于治疗心肌梗死的药物组合物，所述药物组合物包含式(i)的化合物。此外，因为式(i)的化合物可以减少患有心肌梗死的患者中的心肌坏死的面积，并且因此降低发生心力衰竭的风险，所以式(i)的化合物可以用于治疗或预防由心肌梗死引起的心力衰竭或在心肌梗死之后的心力衰竭，尤其是慢性心力衰竭。
如本文中使用的术语“治疗(treating或treatment)”意指在患有疾病的受试者中减少或消除病因，延迟或停止疾病的进展，和/或减少、减轻、改善或消除疾病的症状。
如本文中使用的术语“预防(preventing或prevention)”意指在受试者尤其是易患病但尚未患病的受试者中防止疾病发病或者降低疾病发病的可能性。
易患心脏疾病但尚未患有该疾病的受试者的实例包括具有诸如以下各项的风险因素的受试者：衰老、冠状动脉疾病的家族史、吸烟、高血压(hypertension)、肥胖(obesity)、糖耐量减低(impairedglucosetolerance)、高胆固醇血症(hypercholesterolemia)、高甘油三酯血症(hypertriglyceridemia)、低hdl胆固醇血症(hypo-hdlcholesterolemia)、代谢综合征、应激和睡眠不足。易患心肌梗死但尚未患有该疾病的受试者的实例包括具有诸如以下各项的风险因素的受试者：吸烟、高胆固醇血症、糖尿病(diabetes)、高血压、心绞痛(angina)或心肌梗死的家族史、衰老、应激、肥胖、痛风(gout)、高尿酸血症(hyperuricemia)、血液透析、高同型半胱氨酸血症(hyperhomocysteinemia)和牙周病。易患慢性心力衰竭但尚未患有该疾病的受试者的实例包括患有诸如冠状动脉疾病、心肌病、心脏瓣膜疾病和高血压的疾病的受试者，尤其是患有心肌梗死的受试者。易患高血压性心力衰竭但尚未患有该疾病的受试者的实例包括患有高血压的受试者。易患扩张型心肌病但尚未患有该疾病的受试者的实例包括具有扩张型心肌病的遗传易感性的受试者。
治疗或预防的受试者包括动物，典型是哺乳动物(例如，人、小鼠、大鼠、仓鼠、兔、猫、狗、牛、绵羊或猴)，尤其是人。
药物组合物可以通过通常已知的施用途径以任何方式施用，例如，通过口服施用、肠胃外施用、注射或输注。所述组合物可以是适合于各施用途径的剂型。在一个实施方案中，冠状动脉内施用所述药物组合物。
适合于口服施用的剂型包括颗粒剂、细粒剂、粉剂、包衣片剂、片剂、栓剂、细粉剂、胶囊剂、微胶囊剂、咀嚼片剂、液体剂、混悬剂和乳剂。适合于注射的剂型可以是一般剂型，例如适合于在冠状动脉中施用、静脉内注射、输注或用于活性成分的延长释放的制剂的那些。用于在冠状动脉中施用、静脉内注射或输注的剂型包括：水性和非水性可注射溶液，其可以包含赋形剂，诸如抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂或等渗剂；以及水性和非水性可注射混悬剂，其可以包含赋形剂，诸如悬浮剂或增稠剂。这样的剂型可以作为密封的安瓿或小瓶中的液体剂提供，或者作为冻干产品提供并且在使用前通过加入无菌液体诸如注射用水而立即制备。可注射溶液或混悬剂可以由粉剂、颗粒剂或片剂制备。
这样的剂型可以通过用常规方法配制活性成分来制备。如果制剂需要的话，可以加入各种药用赋形剂中的任一种。可以根据所采用的剂型使用任何赋形剂。赋形剂的实例包括缓冲剂、表面活性剂、稳定剂、防腐剂、填充剂、稀释剂、添加剂、崩解剂、粘合剂、包衣剂、润滑剂、润滑试剂、调味剂、甜味剂和增溶剂。
基于诸如受试者的动物物种、健康状况、年龄和重量，施用途径以及所采用的剂型的因素，药物组合物的给药的剂量和次数可以由本领域技术人员适当地设定，使得将有效量的式(i)的化合物施用至受试者。本领域技术人员在给定情形下可以通过常规实验容易地确定有效量，这在临床医师的普通技术和判断的范围内。例如，式(i)的化合物可以在约0.001至1000mg/kg体重/天、约0.01至300mg/kg体重/天、约0.1至100mg/kg体重/天、约1至100mg/kg体重/天、约2至50mg/kg体重/天、约2.5至20mg/kg体重/天、约2.5至10mg/kg体重/天或约5至10mg/kg体重/天的范围内施用。在一个实施方案中，药物组合物在心肌梗死后的再灌注期间施用一次或多次，尤其施用一次。
在一个实施方案中，药物组合物在心肌梗死后的再灌注期间冠状动脉内施用一次。在这样的情况下，式(i)的化合物可以在约0.01至100mg/kg体重、约0.05至50mg/kg体重、约0.1至50mg/kg体重、约0.1至20mg/kg体重、约0.1至10mg/kg体重、约1至10mg/kg体重、约2至10mg/kg体重、约2.5至10mg/kg体重、约2.5至5mg/kg体重或约5至10mg/kg体重的范围内施用。
式(i)的化合物可以单独使用或者与至少一种另外的活性成分组合使用，尤其是用于治疗或预防心脏疾病诸如心肌梗死的活性成分。例如，药物组合物可以包含除式(i)的化合物以外的至少一种活性成分。
当组合使用一些成分时，可以采用含有全部成分的剂型或单独含有所述成分的剂型的组合。所述成分可以同时或依次施用，或者任一种成分都可以在稍后的时间点施用，只要所述成分用于保护心肌细胞或者预防和/或治疗心脏疾病即可。可以组合使用两种以上的另外的活性成分。适合组合使用的活性成分的实例包括抗炎剂、血管扩张剂、血栓溶解剂、抗血小板剂、抗凝剂和抑制素(statin)。
可以将非药物疗法与式(i)的化合物的施用组合。合适的疗法的实例包括使用诸如气囊导管、支架或药物洗脱支架(des)的设备的冠状动脉介入(pci)，外科手术诸如血栓抽吸，基因疗法和再生疗法。
本公开的一个方面提供了一种用于保护心肌细胞的方法，所述方法包括将式(i)的化合物施用至需要其的受试者。
本公开的一个方面提供了用于保护心肌细胞的式(i)的化合物。
本公开的一个方面提供了式(i)的化合物用于保护心肌细胞的用途。
本公开的一个方面提供了式(i)的化合物用于制备用于保护心肌细胞的药物组合物的用途。
本公开的一个方面提供了一种用于治疗心肌梗死的方法，所述方法包括将式(i)的化合物施用至需要其的受试者。
本公开的一个方面提供了用于治疗心肌梗死的式(i)的化合物。
本公开的一个方面提供了式(i)的化合物用于治疗心肌梗死的用途。
本公开的一个方面提供了式(i)的化合物用于制备用于治疗心肌梗死的药物组合物的用途。
例如，本公开提供了以下实施方案。
[1]一种用于保护心肌细胞的药物组合物，所述药物组合物包含式(i)的化合物或者其酯、氧化物、药用盐或溶剂化物：
其中
ra选自由以下各项组成的组：卤素、羟基、烷基、卤素取代的烷基、芳基、卤素取代或烷基取代的芳基、烷氧基、羟基取代或羧基取代的烷氧基、芳氧基、卤素取代或烷基取代的芳氧基、cho、c(o)-烷基、c(o)-芳基、c(o)-烷基-羧基、c(o)-亚烷基-羧基酯和氰基，并且
m为选自0至4的整数。
[2]根据项目1所述的药物组合物，其中保护心肌细胞包括抑制所述心肌细胞的死亡。
[3]根据项目1或2所述的药物组合物，所述药物组合物用于治疗心肌梗死、慢性心力衰竭、高血压性心力衰竭或扩张型心肌病。
[4]根据项目1至3中任一项所述的药物组合物，所述药物组合物用于治疗心肌梗死。
[5]一种用于治疗心肌梗死的药物组合物，所述药物组合物包含式(i)的化合物或者其酯、氧化物、药用盐或溶剂化物：
其中
ra选自由以下各项组成的组：卤素、羟基、烷基、卤素取代的烷基、芳基、卤素取代或烷基取代的芳基、烷氧基、羟基取代或羧基取代的烷氧基、芳氧基、卤素取代或烷基取代的芳氧基、cho、c(o)-烷基、c(o)-芳基、c(o)-烷基-羧基、c(o)-亚烷基-羧基酯和氰基，并且
m为选自0至4的整数。
[6]根据项目5所述的药物组合物，所述药物组合物用于进一步治疗或预防心力衰竭。
[7]根据项目5或6所述的药物组合物，所述药物组合物用于进一步治疗或预防慢性心力衰竭。
[8]根据项目1至7中任一项所述的药物组合物，其中每个ra基团独立地选自由以下各项组成的组：卤素、羟基、烷基、卤素取代的烷基和烷氧基。
[9]根据项目1至8中任一项所述的药物组合物，其中每个ra基团独立地选自由卤素和烷基组成的组。
[10]根据项目1至9中任一项所述的药物组合物，其中式(i)具有两个ra基团，所述两个ra基团是卤素和烷基。
[11]根据项目1至10中任一项所述的药物组合物，其中所述式(i)的化合物选自表1中列出的化合物。
[12]根据项目1至11中任一项所述的药物组合物，其中所述式(i)的化合物是4-氨基-3-[6-(4-氟-2-甲基苯基)吡啶-3-基偶氮基]萘-1-磺酸。
[13]根据项目1至12中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物是冠状动脉内施用的。
[14]根据项目1至13中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物在心肌梗死后的再灌注期间施用。
[15]根据项目1至14中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物在心肌梗死后的再灌注期间施用一次。
[16]根据项目13至15中任一项所述的药物组合物，其中施用约0.01至100mg/kg体重的所述式(i)的化合物。
[17]根据项目13至16中任一项所述的药物组合物，其中施用约1至10mg/kg体重的所述式(i)的化合物。
[18]根据项目13至17中任一项所述的药物组合物，其中施用约2至10mg/kg体重的所述式(i)的化合物。
本文中引用的文件的全部内容通过引用结合于此。
上述实施方案是非限制性的，并且可以在不偏离所附权利要求所限定的本发明的范围的情况下进行改变。以下实施例是非限制性的，并且仅提供用于说明本发明。
实施例
在试验实施例中，采用以下化合物。
kus121：4-氨基-3-[6-(4-氟-2-甲基苯基)吡啶-3-基偶氮基]萘-1-磺酸钠盐
kus121通过wo2012/014994(专利文献1)中公开的方法制备。
试验1：人体器官中的vcp的表达
使用人总rnamasterpanelii(humantotalrnamasterpanelii)(clontechlaboratories,inc.)和总rna：人脂肪(totalrna:humanadipose)(biochaininstituteinc.)，通过qpcr对人体器官中的vcp的表达水平进行定量。首先，使用versocdna合成试剂盒(versocdnasynthesiskit)(thermofisherscientific)将1μg的各rna样品逆转录为cdna。利用steponeplus(thermofisherscientific)和thunderbirdqpcrmix(toyobo)，通过qpcr分析cdna以测定vcp的表达水平。结果在图1中示出。心脏中的vcp的表达水平相对较高，并且与中枢神经系统中的表达水平相当。
试验2：小鼠器官中的vcp的表达
将器官从8周龄c57bl/6j小鼠(japanslc,inc.)中分离，并且使用tripure分离试剂(tripureisolationreagent)(roche)按照制造商的方案提取rna。然后，使用versocdna合成试剂盒将1μg的各rna样品逆转录为cdna。利用steponeplus和thunderbirdqpcrmix，通过qpcr分析cdna以测定vcp的表达水平。结果在图2中示出。心脏中的表达水平相对较高。
试验3：小鼠心脏中的vcp的表达
将心脏从1日龄新生c57bl/6j小鼠中分离，并且使用胶原酶进行处理。使用mitotrackergreenfm(m7514，thermofisherscientific)和thy1.2-apc(ebioscience,inc.)，通过facs将得到的细胞分离为心肌细胞和成纤维细胞。使用与试验2中相同的程序，通过qpcr对vcp的表达水平进行定量。结果在图3中示出。心肌细胞中的表达水平高。
试验4：kus121在大鼠成心肌细胞中的效果
在补充有5％胎牛血清的杜尔贝克改良伊格尔培养基(dulbecco'smodifiedeagle'smedium，dmem)中，在诱导内质网应激的0.1μg/ml衣霉素(sigma-aldrichco.llc)以及25、50、100或200μmkus121的存在下，培养h9c2细胞即大鼠成心肌细胞达24小时。通过countessii(thermofisherscientific)对细胞进行计数。使用“cell”atp测定试剂(toyob-netco.,ltd)测量细胞内atp水平。用arvox3(perkinelmer,inc.)测量表示atp水平的荧光素酶活性。结果在图4中示出。细胞数量随着kus121的剂量增加。atp水平在衣霉素的存在下降低，但是随着kus121的剂量升高。
对如上所述培养的细胞进行蛋白质印迹。使用含有100mmtris-hcl(ph7.4)、75mmnacl和1％tritonx-100(nacalaitesque)的裂解缓冲液从细胞中提取蛋白质，在即将使用之前向所述裂解缓冲液中加入completemini蛋白酶抑制剂混合物(roche)、0.5mmnaf和10mmna3vo4。在使用bca蛋白质测定试剂盒(bio-rad，5000006ja)测量蛋白质浓度之后，将15μg的蛋白质样品在nupage4-12％bis-trismini凝胶(thermofisherscientific)中分离并且转移至protran硝酸纤维素转移膜(whatman)。将该膜用含有5％脱脂奶的pbs封闭30分钟，在4℃与第一抗体一起温育过夜，用pbs-0.05％tween-20(pbs-t)洗涤，在室温与第二抗体一起温育1小时，并且用pbs-t洗涤。使皮尔斯蛋白质印迹底物(piercewesternblottingsubstrate)(thermofisherscientific)或皮尔斯蛋白质印迹底物plus版(piercewesternblottingsubstrateplus)(thermofisherscientific)与第二抗体反应以产生颜色，并且通过las-4000mini系统(fujifilm)测量颜色强度。第一抗体是chop(sc575，santacruzbiotechnology,inc.)、bip(#3183，cellsignalingtechnology,inc.)、gapdh(#2118，cellsignalingtechnology,inc.)和β-肌动蛋白(sigma-aldrichco.llc)。结果在图5中示出。在kus121的存在下，内质网应激标志物chop和bip的表达得到抑制。
使用在无葡萄糖培养基中培养的细胞进行类似的实验。结果在图6和7中示出。细胞数量随着kus121的剂量增加。atp水平在不存在葡萄糖的情况下降低，但是随着kus121的剂量升高。在kus121的存在下，内质网应激标志物chop和bip的表达得到抑制。
结果表明，kus121抑制了在内质网应激下的心肌细胞和成心肌细胞中的atp消耗，并且通过抑制内质网应激而抑制了细胞死亡。
试验5：小鼠心脏缺血和再灌注损伤模型(在缺血之前的kus施用)
使用八周龄c57bl/6j小鼠。将每只小鼠用腹膜内施用的戊巴比妥(pentobarbital)(64.8mg/kg)麻醉。在麻醉诱导后插入气管内导管，并且提供正压通气。
将每只小鼠以右侧卧位固定，通过在第三肋间隙中的左侧开胸术将胸腔打开以暴露心脏。轻轻剥离心包，并且在距离左心房下缘1或2mm更接近于心尖的部位处用7-0prolene缝合线和pe10管将冠状动脉左前降支结扎。通过观察心肌的颜色变化来确认冠状动脉血流的阻塞。缺血持续45分钟，然后通过移除pe10管引起再灌注。通过检查心肌颜色的恢复来确认再灌注。用7-0prolene缝合线缝合胸腔，并且用4-0丝缝线缝合皮肤。在观察到从麻醉中醒来之后，移除气管内导管。
在缺血之前的kus施用
在缺血诱导之前注射溶解于生理盐水中的kus121。图8示出了施用时间表的示意图。首先，在再灌注之前2小时，即在缺血开始前约1小时，以160mg/kg的剂量腹膜内施用kus121。随后，每24小时以160mg/kg的剂量腹膜内施用kus121，持续6天。
组织学分析
在手术后七天时，将小鼠用戊巴比妥麻醉，用4％多聚甲醛(pfa)灌注以进行固定，并且将心脏分离。将分离的心脏在4％pfa中进一步固定过夜。将心脏包埋在石蜡中，并且制备切片。用masson三色染色评价梗死区。使用显微镜(bz-9000，keyence)获取图像，并且使用imagej(nih)测量梗死面积。结果在图9中示出。kus121组中的梗死面积小于对照组中的梗死面积。蛋白质印迹显示，在kus121组中，在边缘区域和非缺血区域中抑制了内质网应激标志物chop的表达。
超声波心动描记术
为了评价心脏功能，在小鼠缺血和再灌注损伤模型中进行超声波心动描记术(vevo(注册商标)2100，visualsonics)。将小鼠保持在使用2％异氟烷的吸入麻醉下。通过在胸骨旁短轴视图中测量左心室缩短分数和左心室射血分数来评价左心室收缩功能。结果在图10中示出。kus121组的左心室收缩功能很好地保持在与假手术组中的左心室收缩功能几乎相同的水平。
试验6：小鼠心脏缺血和再灌注损伤模型(atp可视化小鼠)
使用由山本正道(masamichiyamamoto)医生(肾内科，医学研究生院，京都大学)开发的atp可视化小鼠(a组小鼠)。在a组小鼠中，根据细胞内atp水平发生从gfp到ofp的荧光共振能量转移(fret)。ofp/gfp比与atp水平成比例。
在每只a组小鼠中用4％异氟烷诱导麻醉，并且在手术期间用2％异氟烷维持麻醉。在麻醉诱导后插入气管内导管，并且提供正压通气。在两侧切开胸侧区域和肋下边缘，并且打开胸腔以暴露心脏。在距离左心房下缘1或2mm更接近于心尖的部位处用7-0prolene缝合线和pe10管将冠状动脉左前降支结扎。缺血持续45分钟，然后通过移除pe10管引起再灌注。在再灌注之前2小时以160mg/kg的剂量腹膜内施用kus121。为了测量atp水平，以470/40激发荧光，并且对于gfp以515/30检测荧光，并且对于ofp以575/40检测荧光，以获取图像。使用metamorph(moleculardevices)分析ofp/gfp比。结果在图11中示出。缺血期间的atp水平在对照组中降低，但是在kus121组中得以保持。
试验7：小鼠心脏缺血和再灌注损伤模型(在再灌注之后的kus施用)
如试验5中那样制备小鼠心肌梗死模型。
(1)160mg/kg
首先，在再灌注之后，立即以80mg/kg的剂量静脉内施用kus121，并且以80mg/kg的剂量腹膜内施用kus121。随后，每24小时以160mg/kg的剂量腹膜内施用kus121，持续4天。在手术后七天时，如试验5中那样进行组织学分析以确定梗死面积。图12示出了施用时间表的示意图和结果。kus121组中的梗死面积小于对照组中的梗死面积。
(2)50mg/kg
在再灌注之后，立即以25mg/kg的剂量静脉内施用kus121，并且以25mg/kg的剂量腹膜内施用kus121。随后，不进行kus121的施用。在手术后七天时，如试验5中那样进行组织学分析以确定梗死面积。图13示出了施用时间表的示意图和结果。kus121组中的梗死面积小于对照组中的梗死面积。
(3)16mg/kg
在再灌注之后，立即以8mg/kg的剂量静脉内施用kus121，并且以8mg/kg的剂量腹膜内施用kus121。随后，不进行kus121的施用。在手术后七天时，如试验5中那样进行组织学分析以确定梗死面积。图14示出了施用时间表的示意图和结果。在kus121组和对照组之间未观察到显著的梗死面积差异。
试验8：猪心脏缺血和再灌注损伤模型(kus的静脉内和冠状动脉内施用)
通过在全身麻醉下将导管插入到约克夏猪(yorkshirepig)中并且用气囊阻塞左冠状动脉来制备猪心肌梗死模型。通过将kus121(4mg/kg)溶解于250ml葡萄糖溶液中来制备输液剂，并且通过静脉内输注进行施用，所述静脉内输注在冠状动脉阻塞后45分钟开始，并且持续3小时。在阻塞后60分钟释放气囊，并且冠状动脉内输注10ml输液剂。图15示出了施用时间表的示意图。
(1)通过mri评价的梗死尺寸和心脏功能
在阻塞后一周，通过晚期钆增强mri评价梗死尺寸。图16示出了相对于左心室的梗死面积。通过经由mri确定左心室射血分数、舒张末期容积、收缩末期容积、心输出量和左心室质量来评价心脏功能。结果在图17中示出。通过kus121施用改善了左心室收缩功能。
(2)组织学分析
在mri之后，再次用气囊导管将左冠状动脉的阻塞部分阻塞，并且将1％伊文思蓝(evansblue)注射到左冠状动脉和右冠状动脉(左冠状动脉注射60ml，并且右冠状动脉注射30ml；非梗死区域被染成蓝色)。另外，通过阻塞气囊的导丝管腔注射30ml的1％ttc溶液。然后通过静脉内注射氯化钾进行安乐死。将心脏分离，并且平行于房室沟制备10-mm厚的切片。在37℃将切片进一步浸入1％ttc溶液中10分钟(未被心肌梗死损害的区域被染成红色)。将所有切片称重并且拍照。将它们在10％甲醛中固定并且用于后续的组织学分析。结果在图18中示出。左图示出了相对于左心室的危险面积，并且右图示出了相对于危险面积的梗死面积。假手术组和kus组之间的危险面积未发现差异，但是kus的施用减少了相对于危险面积的梗死面积。
试验9：猪心脏缺血和再灌注损伤模型(在再灌注之后的kus施用)
如试验8中那样制备猪心肌梗死模型。在阻塞后60分钟释放气囊，并且立即以0.64、2.5或5.0mg/kg的剂量通过冠状动脉内注射施用kus121达3分钟。在手术后七天时，通过mri评价梗死尺寸，并且通过如试验8中的组织学分析来确定梗死面积。图19示出了施用时间表的示意图和结果。在kus121组中，通过mri评价的梗死面积/左心室(lv)面积的比率以剂量依赖性方式降低。kus121组的梗死面积/危险面积(aar)的比率与对照组的梗死面积/危险面积(aar)的比率相当。在kus121组中，梗死面积/aar的比率以剂量依赖性方式降低。通过masson三色染色可视化的梗死区域的外观与通过ttc染色可视化的梗死区域的外观相当。数据表明，在猪心肌梗死模型中，在心脏损害后冠状动脉内施用kus121提供了显著的益处。
试验1至9的结果表明，式(i)的化合物在缺血-再灌注期间保护心肌细胞并且抑制细胞死亡，因此对于治疗心肌梗死是有效的。
工业实用性
本公开提供了一种用于保护心肌细胞的方法，并且可以用于医疗领域。例如，该方法可以用于治疗和预防与心肌细胞死亡相关的疾病，尤其是用于治疗心肌梗死。