以绣球酚作为有效成分的用于抑制脂肪形成和减少体脂的组合物的制作方法

本发明涉及一种通过减少肥大细胞中的脂肪的积累来抑制肥胖和减少体脂的组合物，更具体地，涉及一种组合物，其中，绣球酚(hydrangenol)通过减少过氧化物酶体增殖剂激活受体γ(peroxisomeproliferator-activatedreceptorgamma)的表达量和减少脂肪细胞分化因子来抑制中性脂肪(甘油三酯)的积累和分泌，从而抑制由于过度营养的接触而引起的脂肪形成并减少体脂。
背景技术：
：肥胖是一种非常严重的疾病，其虽然在世界各国中迅速增加，但是在医学上没有有效的治疗方法。世界卫生组织(who)规定高于或等于30的身体质量指数(bmi：bodymassindex)为肥胖，一项研究结果发表指出，以2014年为准，不仅在全球人口中有13％为肥胖，更在74亿人口中有22亿人患有与超重或肥胖有关的健康问题。肥胖是指由于遗传或生活习惯的原因导致体内脂肪过多积累的状况，其诱发起成人疾病和慢性退行性疾病之类的疾病，并在发达国家中，超重和肥胖引起2％至7％的国民医疗总费用。肥胖可能引起的社会性残障和由于过多的脂肪积累而引起的高脂血症、高血压、动脉硬化、糖尿病和脂肪肝等的并发症成为问题。尽管who于2013年表明肥胖为21世纪的新传染病，并且全世界宣布与肥胖陷入战争，但是世界肥胖人口正在迅速增长。由于诱导个体行为改变以预防肥胖对于在复杂的工业信息化中过着忙碌生活的个体来说不是一个完美的选择，因此在抗肥胖和肥胖治疗领域中出现了新的问题。并且，尽管关于肥胖的医学和生物学上的基础研究已经发展，但肥胖的实际增加表明了这两个因素之间的差异。因此，需要能够更容易接触并且具有长期抗肥胖效果的食品类和化妆品类的开发和研究。3t3-l1脂肪细胞(前脂肪细胞)通过在分化过程中激活许多转录因子来积累脂肪，代表性的分化因子包括c/ebpa(ccaat/增强子结合蛋白α)和由其诱导的过氧化物酶体增殖剂激活受体γ(peroxisomeproliferatoractivatedreceptorgamma)。通过表达这些上位因子，可以合成几种下位蛋白质，这些蛋白质促进对我们身体有害的中性脂肪(甘油三酯)的合成和储存的功能，从而在细胞中积累大量脂肪并诱发肥胖。绣球酚(hydrangenol)是绣球花属(hydrangea)中发现的代表性成分(日本公开专利jp-0029934)，其分子量为256.25g/mol，iupac名为8-羟基-3-(4-羟基苯基)-3,4-二氢色满-1-酮(8-hydroxy-3-(4-hydroxyphenyl)-3,4-dihydroisochromen-1-one)。并且，其衍生物包括(-)-绣球酚4'-o-葡萄糖苷((-)-hydrangenol4'-o-glucoside)和(+)-4'-o-葡萄糖苷((+)-hydrangenol4'-o-glucoside)。据报道，具有皮肤美白(日本公开专利jp-0007546)和抗炎效果(kim,h.j等人，绣球酚通过抑制nf-κb通路和激活nrf2-诱导的ho-1通路来抑制bv2小胶质细胞中的脂多糖诱导的一氧化氮的产生，国际免疫药理学v.35，第61-69页，2016)作为其功能。但是，尚没有关于以绣球酚作为有效成分的用于抑制脂肪形成和减少体脂的组合物的抑制脂肪积累的机理研究。因此，本发明人对使用所述物质抑制脂肪积累进行了直接的效能研究。因此，根据为克服所述现有技术问题而努力研究的结果，本发明人确定绣球酚的物质通过减少诸如pparγ(peroxisomeproliferator-activatedreceptorgamma)的脂肪细胞分化因子抑制中性脂肪(甘油三酯)的积累和分泌来抑制脂肪形成并减少体脂，从而完成本发明。技术实现要素：技术问题一方面提供一种用于预防或改善肥胖的保健功能食品组合物，其以绣球酚(hydrangenol)或其药学上可接受的盐作为有效成分。另一方面提供一种用于预防或治疗肥胖的药物组合物，其以绣球酚(hydrangenol)或其药学上可接受的盐为作为有效成分。另一方面提供一种用于预防或改善肥胖的保健功能食品组合物，其包括含有绣球酚的绣球花提取物作为有效成分。另一方面提供一种用于预防或治疗肥胖的药物组合物，其包括含有绣球酚的绣球花提取物作为有效成分。另一方面提供一种用于预防或改善代谢疾病的保健功能食品组合物，其含有绣球酚或其药学上可接受的盐作为有效成分。另一方面提供一种用于预防或治疗代谢疾病的药物组合物，其含有绣球酚或其药学上可接受的盐作为有效成分。另一方面提供一种用于预防或改善代谢疾病的保健功能食品组合物，其包括含有绣球酚的绣球花提取物作为有效成分。另一方面提供一种用于预防或治疗代谢疾病的药物组合物，其包括含有绣球酚的绣球花提取物作为有效成分。另一方面提供一种预防、改善或治疗肥胖或代谢疾病的方法，其包括向有需要的个体施用有效量的绣球酚或其药学上可接受的盐。另一方面提供一种预防、改善或治疗肥胖或代谢疾病的方法，其包括向有需要的个体施用含有绣球酚的绣球花提取物。另一方面提供一种绣球酚或其药学上可接受的盐在用于制备用于预防、改善或治疗肥胖或代谢疾病的组合物中的用途。另一方面提供一种含有绣球酚的绣球花提取物在用于制备用于预防、改善或治疗肥胖或代谢疾病的组合物中的用途。技术方案一方面提供一种用于预防或改善肥胖的保健功能食品组合物，其以绣球酚(hydrangenol)或其药学上可接受的盐作为有效成分。通常，尽管体重很重，但即使不是肥胖而具有很多肌肉的人的体重也可以很重，因此体内具有多余脂肪组织的状况称为“肥胖”。术语“肥胖(obesity)”是指体脂过多的状况，临床上，身体质量指数在韩国的情况为25，而根据who则为30或更高。通常，这意味着体重高于正常值，但是即使体重不重，但身体的构成成分中的脂肪比例高时，则被诊断为肥胖，并且是指一种皆在成年人和儿童中发病的疾病。这种肥胖不仅引起体重的增加，更可能导致与肥胖有关的疾病，例如暴食、暴饮和暴食症、高血压、糖尿病、血浆胰岛素浓度升高、胰岛素抗性、高脂血症、代谢综合征、胰岛素抗性综合征、与肥胖相关的胃食管反流、动脉硬化征、高胆固醇血症、高尿酸血症、下部背痛症、心脏肥大和左心室肥大、脂肪营养不良、非酒精性脂肪性肝炎、心血管疾病或多囊性卵巢症候群。因此，当使用根据本发明的组合物时，不仅可以预防或治疗肥胖，而且可以同时预防或治疗与肥胖有关的疾病，这些与肥胖有关的疾病的治疗对象包括那些希望减轻体重的人。术语“预防(prevention)”是指部分或完全延迟或预防疾病、障碍或其附加症状的发作或复发、防止获得或重新获得疾病或障碍、减少获得疾病或障碍风险的方法。例如，所述预防是指通过施用根据本发明的组合物来抑制或延迟肥胖或与肥胖相关的疾病、障碍或症状的发生的任何行动。术语“改善”可以指与缓和或治疗病症相关的参数，例如，至少可以减轻症状的程度的所有行动。所述“保健功能食品”是指为健康辅助的目的通过以特定成分作为原料或提取、浓缩、精炼和混合食物原料中的特定成分等的方法来制造和加工的食物，并且是指经过设计和加工以充分发挥由所述成分引起的生物防御、生物节律控制、疾病预防和恢复等生物控制功能的食物，所述用于保健食品的组合物可以执行与预防肥胖和恢复与肥胖相关疾病相关的功能。所述“保健功能食品组合物”可以制剂化成本领域已知的常规保健功能食品的制剂。例如，可以制造成诸如散剂、颗粒剂、片剂、丸剂、胶囊剂、悬浮液、乳剂、糖浆剂、浸剂、液剂和浸膏剂等的一般剂型，也可以制造成肉类、香肠、面包、巧克力、糖果类，小吃类、饼干类、比萨饼、拉面、其他面类、口香糖类、果冻、包括冰淇淋的乳制品、各种汤、饮料、茶、饮剂、酒精饮料和维生素复合剂等的任何保健食物的形式。为所述保健食物的制剂化，可以使用食品学上可接受的载体或添加剂，并且可以将本领域已知的可用的任何载体或添加剂用于制造要制造的制剂。作为所述添加剂，可以含有各种营养剂、维生素、电解质、调味剂、着色剂、果胶酸及其盐、海藻酸及其盐、有机酸、保护胶体增稠剂、ph调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、醇、碳酸饮料中使用的碳酸化剂等。此外，还可以含有用于制备天然果汁、果汁饮料和蔬菜饮料的果肉。这些添加剂成分可以单独使用或组合使用，并且基于组合物的总重量，添加剂的比例可以为0.001重量％至5重量％，具体地为0.01重量％至3重量％。可以根据使用目的(预防或改善)适当地确定所述保健食品组合物中的所述绣球酚或其药学上可接受的盐的含量。通常，可以包括食品总重量的0.01重量％至15重量％，并且当制备为饮料时，基于100ml，可以含有0.02g至10g，更具体地，可以含有0.3g至1g的比例。所述饮料可以进一步包括所述组合物以外的其他成分，并且可以进一步含有通常用于饮料的各种香料或天然碳水化合物等。所述天然碳水化合物可以含有如单糖类(例如：葡萄糖、果糖等)、二糖类(例如：麦芽糖、蔗糖等)、多糖类(例如：糊精、环式糊精等)的常规糖以及如木糖醇、山梨糖醇、赤藓糖醇等的糖醇。另外，香料可以含有天然香料(例如：奇异果甜蛋白(thaumatin)、甜叶菊提取物等)及合成香料(例如：糖精、阿斯巴甜等)。所述天然碳水化合物的比例通常为每100ml饮料约1g至20g，具体地，约5g至12g。根据一实施例，所述绣球酚可以由以下化学式1表示。[化学式1](绣球酚(hydrangenol))根据一实施例，所述绣球酚或其药学上可接受的盐可以抑制脂肪形成或减少体脂。根据一实施例，所述绣球酚可以从绣球花提取物中分离出来。另一方面提供一种用于预防或治疗肥胖的药物组合物，其以绣球酚(hydrangenol)或其药学上可接受的盐作为有效成分。根据一实施例，所述绣球酚或其药学上可接受的盐可以抑制脂肪形成或减少体脂。根据一实施例，所述绣球酚可以从绣球花提取物中分离出来。术语“药物组合物”可以指在施用给对象时赋予几种有利的效果的分子或化合物。有利的效果可以包括：使能够做出诊断性确定；改善疾病、症状、障碍或病态；减少或预防疾病、症状、障碍或疾患的发病；以及通常对对疾病、病状、障碍或病态的反应。所述药物组合物可以在临床施用时以肠胃外施用，并且可以以一般医药物制剂的形式使用。肠胃外施用可以是指通过经口服以外的施用途径来进行施用，例如，直肠、静脉、腹膜、肌肉、动脉、经皮、鼻腔(nasal)、吸入、眼球和皮下。当使用本发明的药物组合物作为医药物时，可以进一步含有一种或多种表现出相同或相似功能的有效成分。可以将所述活性成分递送给个体中的药物活性成分的类型可以包括抗癌剂、造影剂(染料)、激素、抗激素、维生素剂、钙剂、无机物制剂、糖类剂、有机酸制剂、蛋白质氨基酸制剂、解毒剂、酶制剂、代谢制剂、糖尿病组合制剂、组织再生药物、叶绿素制剂、色素制剂、肿瘤药物、肿瘤治疗剂、放射性医药物、组织细胞诊断剂、组织细胞治疗剂、抗生物质制剂、抗病毒剂、复合抗生物质制剂、化学疗法剂、疫苗、毒素、类毒素、抗毒素、钩端螺旋体血清、血液制剂、生物制剂、止痛剂、免疫原性分子、抗组胺剂、过敏药物、非特异性免疫原制剂、麻醉剂、兴奋剂、精神神经用剂、低分子量化合物、核酸、适配体、反义核酸、寡核苷酸、肽、小干扰rna(sirna)和微小rna等。当将所述药物组合物制剂化时，可以通过使用通常使用的稀释剂或赋形剂,如填充剂、增量剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂及表面活性剂等来制备。用于肠胃外施用的制剂包括灭菌的水溶液、非水性溶剂、悬浮剂、乳剂、冷冻干燥制剂和栓剂等。作为非水性溶剂和悬浮剂，可使用丙二醇(propyleneglycol)、聚乙二醇、如橄榄油的植物油及如油酸乙酯的可注射的酯等。栓剂的基质可使用witepsol、聚乙二醇、吐温(tween)61、可可油脂、月桂脂、甘油明胶等。此外，可以将所述药物组合物与诸如生理盐水或有机溶剂的允许作为药物的各种载体(carrier)一起混合来使用，并且为了增加稳定性或吸水性，可以使用如葡萄糖、蔗糖或葡聚糖的碳水化合物、如抗坏血酸(ascorbicacid)或谷胱甘肽(glutathione)的抗氧化剂(antioxidants)、螯合剂(chelatingagents)、低分子蛋白质或其他稳定剂(stabilizers)作为药物。另一方面提供一种用于预防或改善肥胖的保健功能食品组合物，其包括含有绣球酚的绣球花提取物作为有效成分。根据一实施例，所述绣球花提取物可以由水、c1至c4醇或其混合溶剂提取。根据一实施例，所述绣球花提取物可以为热水提取物。所述提取物可以由亲水性溶剂(hydrophilicsolvent)，例如，醇、水或其组合来提取。所述醇可以是具有c1至c10的一个或多个的-oh基的化合物。所述醇可以是c1至c6醇、c3至c6多元醇。所述醇可以是甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、仲丁醇、异丁醇、叔丁醇、正戊醇、正己醇或其混合物。所述溶剂可以是例如水和醇的混合物，即醇水溶液。醇水溶液的醇浓度可以为1％(w/w)至100％(w/w)，例如，1％(w/w)至99.5％(w/w)、10％(w/w)至100％(w/w)、20％(w/w)至100％(w/w)、30％(w/w)至100％(w/w)、40％(w/w)至100％(w/w)、50％(w/w)至100％(w/w)、60％(w/w)至100％(w/w)、70％(w/w)至100％(w/w)、75％(w/w)至100％(w/w)、60％(w/w)至90％(w/w)、60％(w/w)至80％(w/w)、65％(w/w)至75％(w/w)或70％(w/w)。所述醇水溶液可以是甲醇、乙醇或丁醇水溶液。所述提取物可以通过本领域常规方法提取，例如加热提取、加压提取、超声波提取、热水提取、回流冷却提取、亚临界提取或超临界提取等。基于组合物的总重量，可以包括0.001重量％至80重量％的所述提取物，例如，0.01重量％至60重量％、0.01重量％至40重量％、0.01重量％至30重量％、0.01重量％至20重量％、0.01重量％至10重量％、0.01重量％至5重量％、0.05重量％至60重量％、0.05重量％至40重量％、0.05重量％至30重量％、0.05重量％至20重量％、0.05重量％至10重量％、0.05重量％至5重量％、0.1重量％至60重量％、0.1重量％至40重量％、0.1重量％至30重量％、0.1重量％至20重量％、0.1重量％至10重量％或0.1重量％至5重量％。另一方面提供一种用于预防或治疗肥胖的药物组合物，其包括含有绣球酚的绣球花提取物作为有效成分。另一方面提供一种用于预防或改善代谢疾病的保健功能食品组合物，其含有绣球酚或其药学上可接受的盐作为有效成分。代谢疾病可以包括，例如，肥胖、脂肪肝、糖尿病、高脂血症、高血压、高胆固醇血症、高低密度脂蛋白(low-densitylipoprotein；ldl)胆固醇症、心血管疾病和动脉硬化症等以及冠状动脉疾病。根据一实施例，所述代谢疾病可以为高脂血症、高胆固醇血症、糖尿病或血脂异常症。另一方面提供一种用于预防或治疗代谢疾病的药物组合物，其含有绣球酚或其药学上可接受的盐作为有效成分。根据一实施例，所述代谢疾病可以为高脂血症、高胆固醇血症、糖尿病或血脂异常症。另一方面提供一种用于预防或改善代谢疾病的保健功能食品组合物，其包括含有绣球酚的绣球花提取物作为有效成分。另一方面提供一种用于预防或治疗代谢疾病的药物组合物，其包括含有绣球酚的绣球花提取物作为有效成分。另一方面提供一种预防、改善或治疗肥胖或代谢疾病的方法，其包括向有需要的个体施用有效量的绣球酚或其药学上可接受的盐。所述个体可以为哺乳动物。所述哺乳动物可以是人、狗、猫、牛、山羊或猪。所述施用可以通过任何一般途径施用，只要其可以到达靶组织即可。例如，可以通过滴眼施用、腹膜内施用、静脉内施用、肌内施用、皮下施用、皮内施用、经皮贴剂施用、经口服施用、鼻内施用、肺内施用、直肠内施用等的途径施用，具体而言，可以根据目的通过滴眼施用的途径等来施用。所述施用可以全身性或局部性的施用。如本文所用，“治疗”、“治疗的”、“缓和的”或“改善的”可互换使用。这些术语是指获得有利的或期望的结果的方法，包括但不限于治疗益处和/或预防益处。治疗益处是指对在治疗下的一种或多种疾病、疾患或症状的任何治疗上显着的改善或效果。在预防益处方面，组合物可以施用于具有特定疾病、疾患或症状的发病风险的对象或即使尚未出现疾病、疾患或症状但报告有疾病的一种或多种生理学上的症状的对象。术语“有效量”或“治疗有效量”是指足以引起有利或期望结果的试剂的量。治疗有效量可以根据治疗对象和病态、对象的体重和年龄、病态的严重程度和施用方式等中的一种或多种而变化，这可以由本领域技术人员容易地确定。此外，所述术语适用于提供用于由本文所述的成像方法中的任何一个执行的检测的图像的用量。特定用量可以根据特定作用剂、随后的施用疗法、是否与其他化合物组合施用、施用时间、要成像的组织以及传递其的身体递送系统而变化。所述施用可以为每天向每个个体施用以下量的绣球酚或其药学上可接受的盐：0.1mg至1000mg，例如，0.1mg至500mg、0.1mg至100mg、0.1mg至50mg、0.1mg至25mg、1mg至1000mg、1mg至500mg、1mg至100mg、1mg至50mg、1mg至25mg、5mg至1000mg、5mg至500mg、5mg至100mg、5mg至50mg、5mg至25mg、10mg至1000mg、10mg至500mg、10mg至100mg、10mg至50mg或10mg至25mg。但是，可以根据诸如制剂化方法、施用方式、患者的年龄、体重、性别、病理状况、食物、施用时间、施用途径、排泄率和反应敏感性等因素而不同地规定施用量，并且本领域技术人员可以通过考虑这些因素来适当地调整施用量。施用次数可以为一天一次或在临床可接受的副作用范围内施用两次或更多次，施用部位也可以在一个或两个或多个部位处施用，并且通过每天或以2至5天的间隔施用的施用总天数可以在一次治疗中为1至30天。需要时，可以在适当的时间后重复进行相同的治疗。对于除人类以外的动物，可以与人体每kg施用的施用量相同，或根据目标动物与人体的器官(心脏等)的体积比(例如，平均值)等转换的施用量来施用。另一方面提供一种预防、改善或治疗肥胖或代谢疾病的方法，其包括向有需要的个体施用含有绣球酚的绣球花提取物。另一方面提供一种绣球酚或其药学上可接受的盐在用于制备用于预防、改善或治疗肥胖或代谢疾病的组合物中的用途。另一方面提供一种含有绣球酚的绣球花提取物在用于制备用于预防、改善或治疗肥胖或代谢疾病的组合物中的用途。针对所述发明描述的术语和方法等被等同地应用于每个发明。有益效果如上所述，确认了本申请发明通过以绣球酚为有效成分来减少mtor(mammaliantargetofrapamycin)的磷酸化和增加foxo1(forkheadboxo1)的磷酸化，并最终减少如pparγ(peroxisomeproliferator-activatedreceptorgamma)的脂肪细胞分化因子来抑制中性脂肪(甘油三酯)的积累和分泌，从而抑制由于过度营养的接触而引起的脂肪积累并减少体脂。绣球酚是一种天然植物衍生的物质，可以有效地用于保健功能性食品和化妆品领域。附图说明图1为绣球花叶热水提取物(hydrangeaserrata)和在绣球花提取物中含有的绣球酚(hydrangenol)的高效液相色谱(highperformanceliquidchromatography；hplc)分析结果。图2为用于观察处理绣球酚或绣球花提取物后脂肪细胞中的中性脂肪积累的变化而进行的油红-o染色和定量分析的结果照片和图表。图3为用于观察处理绣球酚或绣球花提取物后脂肪细胞中的中性脂肪调节蛋白质的表达而进行蛋白质免疫印迹的结果。图4为示出当与诱导小鼠肥胖一起同时施用绣球花叶热水提取物时的小鼠的体重变化的图表。图5为示出在诱导小鼠肥胖后施用绣球花叶热水提取物时的小鼠的体重变化的图表。图6为用于观察绣球花叶热水提取物的体脂减少效果而使用双能x线吸收测量法(dual-energyx-rayabsorptiometry)测量在与诱导小鼠肥胖一起同时施用绣球花叶热水提取物的情况下的小鼠的脂肪分布图像和体脂含有量的照片。图7a为示出当与诱导小鼠肥胖一起同时施用绣球花叶热水提取物时的小鼠的体脂含有量的图表；图7b为示出当与诱导小鼠肥胖一起同时施用绣球花叶热水提取物时的小鼠的脂肪重量的图表。图8为用于观察绣球花叶热水提取物的体脂减少效果而使用双能x线吸收测量法测量在诱导小鼠肥胖后施用绣球花叶热水提取物的情况下的小鼠的脂肪分布和体脂含有量的照片。图9a为示出当在诱导小鼠肥胖后施用绣球花叶热水提取物时的小鼠的体脂含有量的图表；图9b为示出当在诱导小鼠肥胖后施用绣球花叶热水提取物时的小鼠的脂肪重量的图表。图10为用于观察绣球花叶热水提取物的减少脂肪球大小的效果而拍摄通过显微镜观察的脂肪细胞的照片。图11a为示出在施用绣球花叶热水提取物时的胆固醇量的图表；图11b为示出在施用绣球花叶热水提取物时的低密度脂蛋白(low-densitylipoprotein；ldl)的量的图表。图12a为确认在施用绣球花叶热水提取物时的脂肪组织中的p-ampk蛋白质的表达的结果；图12b为确认在施用绣球花叶热水提取物时的p-ampk蛋白质在肝脏中的表达的结果。图13为示出用于观察绣球酚的体重减少效果而向小鼠施用绣球酚时的体重变化的图表。图14为用于观察绣球酚的体脂减少效果而向小鼠施用绣球酚并使用双能x线吸收测量法测量小鼠的脂肪分布图像和体脂含有量的照片。图15a为在施用绣球酚时的体脂含有量的图表；图15b为在施用绣球酚时的脂肪重量的图表。图16为用于观察绣球酚的减少脂肪球大小的效果而拍摄通过显微镜观察的脂肪细胞的照片。图17a为示出在施用绣球酚时的胆固醇量的图表；图17b为示出在施用绣球酚时的低密度脂蛋白(low-densitylipoprotein；ldl)的量的图表。图18a为确认在施用绣球酚时的脂肪组织中的p-ampk蛋白质的表达的结果；图18b为确认在施用绣球酚时的p-ampk蛋白质在肝脏中的表达的结果。具体实施方式在下文中，将通过实施例更详细地描述本发明。这些实施例仅出于说明本发明的目的，因此不应解释为将本发明的范围限制于这些实施例。实施例1：制造含有绣球酚的绣球花提取物通过以下过程制造本发明的组合物的绣球花提取物。首先，将20kg的干燥绣球花(hydrangeaserrata)原材料和300kg的净化水放入提取槽中，并在100℃下回流提取5小时。提取的样品通过过滤筒(10μm)过滤，然后在减压下浓缩，并通过喷雾干燥来获得水溶性粉末。实施例2：制造源自绣球花提取物的绣球酚(hydrangenol)通过使用diaionhp-20对实施例1中获得的提取物粉末进行凝胶过滤(gelfiltration)。作为展开溶剂，分别使用2l的30％、50％、70％、100％的醇和ch2cl2-meoh(1:1，v/v)的混合溶液进行溶剂分馏，并且将其分为5小分馏(392-70edia1～5)。以甲醇作为展开溶剂，将小分馏392-70edia4使用sephadexlh-20分为7个小分馏(392-70edia4a～4g)，其中，392-70edia4d分馏在甲醇中重结晶，从而获得纯的无定形化合物1(绣球酚)单一物质。通过高效液相色谱(highperformanceliquidchromatography；hplc)和紫外-可见光检测器(uv/visdetector)对在本发明的实施例1中获得的提取物粉末和在实施例2中获得的绣球酚进行分析。使用沃特世e2695系列系统(waterse2695seriessystem)、沃特世24489紫外-可见光检测器(伍斯特，麻萨诸塞州，美国)和lunac18(2)(5μm，250×4.6mm，菲罗门，托伦斯，加利福尼亚州，美国)色谱柱作为hplc仪器，并且使用购自j.t.baker(菲利普斯堡，新泽西州，美国)的hplc级溶剂作为在分析中使用的所有溶剂。在分析时，将柱的温度设定为30℃，注入容量为20μl，并且测量波长为210nm。使用乙腈(acetonitrile；acn)和三次蒸馏水(d.w)作为流动相，并且将acn-d.w(2:8-10:0，v/v)混合溶液以1ml/分钟的速度分析50分钟。作为分析样品，使用通过精确称量100mg的实施例1中获得的提取物粉末并在添加10ml的甲醇后，放在超声波振荡器中溶解20分钟，使其在室温下冷却，并通过0.45μm膜滤器过滤而获得的产物，并且使用通过精确称量10mg的实施例2中获得的绣球酚并在添加40ml的甲醇后，放在超声波振荡器中溶解20分钟，使其在室温下冷却，并通过0.45μm膜滤器过滤而获得的产物。对于每个分析样品，在210nm处提取色谱图，并比较和分析绣球花叶热水提取物的峰和绣球酚的峰(图1)。为了确认所述实施例2的结构，首先在确认esims(正离子模式)的结果，显示出m/z＝257[m+h]+。可以得知，在1h-nmr中，在强磁场下显示出δh5.50中的次甲基质子(methineproton)(h-3)以及δh3.30和3.06中的亚甲基质子(methyleneproton)(h-4)为在彼此邻位偶合(vicinalcoupling)的方面中通过化学位移值源自c环的质子。源自b环的p取代苯环的h-2′，3′和h-6′，5′通过彼此邻位偶和显示为双峰(j＝8.4hz)，h-2′和h-6′的峰以及h-3'和h-5'的峰也彼此正偶合(orthocoupling)来显示为双峰，从而得知它们在羟基周围具有对称结构。a环的1,2,3-三取代的苯中，h-5和7号氢分别与h-6氢偶合，并且h-5和7号氢通过正偶合显示为双峰，h-6质子通过正和元耦合(metacoupling)显示为双峰，从而可以得知两个峰均对应于一个氢。在13c-nmr中显示包括对位(para)-取代体的总共15个峰。可以预期δc172处的四级碳是源自作为化合物1号碳的羰基的峰，δc116.9(c-3′，5′)和129.6(c-2′，6′)是源自芳环的对位取代体的峰，并且δc36.1和83.1处的峰分别源自脂肪族碳和氧化碳。此外，在deptnmr中可以确定7个质子化碳(protonatedcarbons)，并且δc36.1的峰被发现是源自c-4的亚甲基。分析2dnmr以分析其准确的结构。可以从异核单量子关系(hsqc)鉴定峰的准确位置，并且从异核多键相关(hmbc)得知取代基的键合位置。换言之，δh7.26(2h，d，j＝8.4hz，h-2′,6′)的峰显示出与δc36.1的c-4相关，并且源自h-4的δh3.06和3.30的峰显示出与δc83.1(c-3)、119.8(c-5)、110.0(c-9)、142.2(c-10)的峰有关。通过综合以上结果，确认了绣球酚(hydrangenol)。图1为绣球花叶热水提取物和在绣球花提取物(hydrangeaserrata)中含有的绣球酚(hydrangenol)的hplc分析结果。试验例1.通过油红o染色评估脂肪积累抑制在本试验中，为了诱导脂肪细胞分化，将3t3-l1细胞分株到板上并在10％fbs培养基中培养直至细胞密度达到100％。在细胞的分化步骤中，将含有绣球酚的绣球花(hydrangeaserrata)(25ug/ml)或绣球酚(2.5ug/ml)阳性对照组吡咯列酮(10um)分别添加在10％胎牛血清(fetalbovineserum；fbs)分化培养基(胰岛素5μg/ml、地塞米松1μm、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤0.5mm)中。并在10天的处理后，进行油红-o染色和定量分析，从而测定可以抑制多少脂肪积累。为了进行肉眼评估，在染色后拍摄图像，将染色的细胞完全干燥，然后溶解在二甲基亚砜(dimethylsulfoxide；dmso)，并转移到96孔板中，在450nm的吸光度下进行测量。图2为用于观察处理绣球酚或绣球花提取物后脂肪细胞中的中性脂肪积累的变化而进行的油红-o染色和定量分析的结果照片和图表。试验例2.评估在处理绣球酚时的与脂肪细胞分化有关的蛋白质的表达确认了与含有绣球酚的绣球花(hydrangeaserrata)和绣球酚有关的脂肪细胞中的中性细胞的减少的机制。将作为脂肪前驱体细胞的3t3-l1分化10天，并分别处理绣球花(hydrangeaserrata)(25ug/ml)和绣球酚(2.5ug/ml)24小时。然后，使用修饰的溶酶体酸脂肪酶a(modifiedlipabuffer)缓冲液破碎细胞，然后将各20ug用于分析。使用各p-mtor(ab109268，abcam)、p-fox01(9461s，cellsignaling)、pparγ(sc-7273，santacruz)和β肌动蛋白(β-actin)(a5316，sigma)一抗并分析。如图3所示，确认含有绣球酚的绣球花(hydrangeaserrata)和绣球酚通过减少哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammaliantargetofrapamycin；mtor)的磷酸化和增加叉形头转录因子1(forkheadboxo1；foxo1)的磷酸化来最终减少氧化物酶体增生激活受体γ(peroxisomeproliferator-activatedreceptorgamma；pparγ)的表达量，从而抑制脂肪细胞中的中性脂肪形成。图3为用于观察处理绣球酚或绣球花提取物后脂肪细胞中的中性脂肪调节蛋白的表达而进行蛋白质免疫印迹的结果。试验例3.分析绣球花叶热水提取物(whs)的体内(invivo)效果3-1.小鼠和试验设计为了分析绣球花叶热水提取物在体内抗肥胖的效果，首先制作了肥胖的动物模型。将8周龄的雄性c57bl/6n小鼠(无特定病原(specific-pathogen-free；spf)级，20±2g，orientbio)设定为如下7组并每组测试10只小鼠：作为正常对照组，分别放置没有高脂饮食并不进行任何施用的一般小鼠(con)和以30％高脂饮食诱导肥胖并不进行任何施用的肥胖小鼠(hfd)，作为阳性对照组，对肥胖小鼠以口服施用作为肥胖治疗剂的奥利司他(orlistat)。作为试验组，包括向肥胖小鼠分别以口服施用75mg/kg、150mg/kg和300mg/kg的绣球花叶热水提取物以及向一般小鼠以口服施用300mg/kg的绣球花叶热水提取物。此外，通过分为与诱导小鼠肥胖一起同时施用绣球花叶热水提取物12周期间的情况和诱导小鼠肥胖10周之后施用绣球花叶热水提取物的情况来进行试验。绣球花叶热水提取物在施用期间以每周经口服施用5天。黑暗(dark)：光亮(light)的周期保持在12小时：12小时的间隔内，并且让小鼠自由摄取水。3-2.分析由绣球花叶热水提取物引起的体重和脂肪减少效果进行了一项试验，分析了在施用绣球花叶热水提取物后的小鼠的体重和脂肪是否减少。结果，当观察根据每个试验组和时间的小鼠的体重变化时，在阳性对照组和施用绣球花叶热水提取物的组中可以看到体重减小的效果(图4和图5)。此外，在动物实验的最后一周，使用双能x线吸收测量法(dual-energyx-rayabsorptiometry)测量各实验组中的小鼠的脂肪分布图像和体脂含有量，并且通过处死动物并分离包括副睾脂肪的腹部脂肪组织来测量脂肪重量。通过使用sigmaplot统计程序中的t-test在试验结果显示出组之间的显着性差异。(p#<0.05vs正常对照组，p*<0.05，p**<0.01，p***<0.001vs肥胖组)。结果，确认在阳性对照组和施用绣球花叶热水提取物组中减少了体脂(图6、图7、图8和图9)。图4为示出当与诱导小鼠肥胖一起同时施用绣球花叶热水提取物时的小鼠的体重变化的图表。图5为示出在诱导小鼠肥胖后施用绣球花叶热水提取物时的小鼠的体重变化的图表。图6为用于观察绣球花叶热水提取物的体脂减少效果而使用双能x线吸收测量法(dual-energyx-rayabsorpyiomerty)测量在与诱导小鼠肥胖一起同时施用绣球花叶热水提取物的情况下的小鼠的脂肪分布图像和体脂含有量的照片。图7a为示出当与诱导小鼠肥胖一起同时施用绣球花叶热水提取物时的小鼠的体脂含有量的图表；图7b为示出当与诱导小鼠肥胖一起同时施用绣球花叶热水提取物时的小鼠的脂肪重量的图表。图8为用于观察绣球花叶热水提取物的体脂减少效果而使用双能x线吸收测量法测量在诱导小鼠肥胖后施用绣球花叶热水提取物的情况下的小鼠的脂肪分布和体脂含有量的照片。图9a为示出当在诱导小鼠肥胖后施用绣球花叶热水提取物时的小鼠的体脂含有量的图表；图9b为示出当在诱导小鼠肥胖后施用绣球花叶热水提取物时的小鼠的脂肪重量的图表。3-3.分析由绣球花叶热水提取物引起的脂肪细胞大小减少效果为了进行组织学分析，将小鼠的副睾脂肪组织固定在4％多聚甲醛中。在进行几次通过连续的酒精浓度梯度(gradedalcoholseries)和洗涤的脱水(dehydration)后，将组织包埋在石蜡中。将组织切片切成4μm的厚度，并用苏木精(haematoxylin)和伊红(eosin)进行染色。为了检查白色脂肪细胞(whiteadipocyte)的大小，对每个脂肪细胞的区域使用cellsence软件(olympusco.，美国)测量每个切片。结果，确认在与诱导肥胖一起施用绣球花叶热水提取物的组中的脂肪细胞大小被减少(图10)。图10为用于观察绣球花叶热水提取物的减少脂肪球大小的效果而拍摄通过显微镜观察的脂肪细胞的照片。3-4.分析绣球花叶热水提取物对肝脏和肾脏的影响为了确认绣球花叶热水提取物是否引起小鼠的肝脏和肾脏的损害，使用生化学分析仪(au480化学分析仪，贝克曼库尔特，加利福尼亚州，美国)对与诱导肥胖一起施用绣球花叶热水提取物的组的谷草转氨酶(glutamicoxalacetictransaminase；got)、谷丙转氨酶(glutamicpyruvatetransminase；gpt)和血尿素(bloodureanitrogen；bun)进行血清分析。结果，如表1所示，7组之间没有示出显着性差异。这些结果意味着绣球花叶热水提取物不会引起肝脏和肾脏的损害。【表1】3-5.分析由绣球花叶热水提取物引起的血液中的中性脂肪和血液中的胆固醇的变化为了分析绣球花叶热水提取物对血液中的中性脂肪和血液中的胆固醇的影响，使用生化学分析仪(au480化学分析仪，贝克曼库尔特，加利福尼亚州，美国)对与诱导肥胖一起施用绣球花叶热水提取物的组进行血液生化学测试。结果，如表2和图11所示，确认了在与诱导肥胖一起施用绣球花叶热水提取物的组中，总胆固醇、中性脂肪和ldl含量减少，并且高密度脂蛋白(high-densitylipoprotein；hdl)含量无显着性差异。这些结果意味着绣球花叶热水提取物在不影响hdl含量的同时，具有通过减少总胆固醇、ldl含量和中性脂肪来预防肥胖的效果。图11a为示出在施用绣球花叶热水提取物时的胆固醇量的图表；图11b为示出在施用绣球花叶热水提取物时的低密度脂蛋白的量的图表。【表2】3-6.分析由绣球花叶热水提取物引起的与能量代谢相关的蛋白质表达当肝细胞中的能量减少以维持肝脏中的能量稳态时，腺苷-5'-单磷酸激活的蛋白激酶(amp-activatedproteinkinase；ampk)被激活，从而抑制脂肪和胆固醇的合成，反之促进脂肪酸氧化。因此，为了确认施用绣球花叶热水提取物是否增加ampk的表达，分析与诱导肥胖一起施用绣球花叶热水提取物的组的蛋白质表达量。具体地，将脂肪和肝组织与蛋白质提取溶液混合，使用组织研磨机破碎，然后在4℃下以15,000rpm离心分离30分钟，从而获得上清液，之后通过使用布拉德福(bradford)方法创建标准曲线对蛋白质进行定量。将6倍的样品缓冲液添加到30μg蛋白质中并加热5分钟，然后使用10％十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodiumdodecylsulfatepolyacrylamidegelelectrophoresis；sds-page)凝胶执行电泳，并在聚偏氟乙烯(polyvinylidenefluoride；pvdf)膜上免疫印迹1小时20分钟。用包括5％(w/v)脱脂奶的tbst缓冲溶液(tris缓冲盐水-吐温20)封闭1小时后，将抗p-ampk抗体稀释至1：1000，并在4℃下反应18小时。用tbst缓冲溶液在10分钟期间洗涤3次后，在室温下与过氧化物酶(peroxidase)结合的二抗反应2小时。用tbst缓冲溶液在10分钟期间洗涤3次后，使用增强化学发光(enhancedchemiluminescence)试剂盒(amershamlifesciences，安玛西亚，英国)发色和显影成超级胶卷，从而通过蛋白质印迹法(westernblot)确认各对照组和试验组的ampk磷酸化的变化，结果，当施用绣球花叶热水提取物时，确认酸化的ampk蛋白质的量增加(图12)。这些结果意味着绣球花叶热水提取物具有对抗肥胖效果重要的ampk磷酸化诱导效果。图12a为确认在施用绣球花叶热水提取物时的脂肪组织中的p-ampk蛋白的表达的结果；图12b为确认在施用绣球花叶热水提取物时的p-ampk蛋白在肝脏中的表达的结果。试验例4.分析绣球酚(hg)的体内(invivo)效果4-1.小鼠和试验设计为了分析绣球酚在体内抗肥胖的效果，首先制作了肥胖的动物模型。将8周龄的雄性c57bl/6n小鼠(无特定病原级，20±2g，orientbio)设定为如下7组并每组测试10只小鼠：作为正常对照组，分别放置没有高脂饮食并不进行任何施用的一般小鼠(con)和以30％高脂饮食诱导肥胖并不进行任何施用的肥胖小鼠(hfd)，作为阳性对照组，对肥胖小鼠以口服施用作为肥胖治疗剂的奥利司他(orlistat)。作为试验组，包括向肥胖小鼠分别以口服施用20mg/kg、40mg/kg和80mg/kg的绣球酚(hg)以及向一般小鼠以口服施用80mg/kg的绣球酚。与诱导小鼠肥胖一起同时施用绣球酚，并且每周施用绣球酚5天，共施用12周。黑暗(dark)：光亮(light)的周期保持在12小时：12小时的间隔内，并且让小鼠自由摄取水。4-2.分析由绣球酚引起的体重和脂肪减少效果进行了一项试验，分析了在施用绣球酚后的小鼠的体重和脂肪是否减少。结果，当观察根据每个试验组和时间的小鼠的体重变化时，在阳性对照组和施用绣球酚的组中可以看到体重减小的效果(图13)。此外，在动物实验的最后一周，使用双能x线吸收测量法(dual-energyx-rayabsorptiometry)测量各实验组中的小鼠的脂肪分布图像和体脂含有量，并且通过处死动物并分离包括副睾脂肪的腹部脂肪组织来测量重量。通过使用sigmaplot统计程序中的t-test在试验结果显示出组之间的显着性差异(p#<0.05vs正常对照组，p*<0.05，p**<0.01，p***<0.001vs肥胖组)。结果，确认在阳性对照组和施用绣球酚组中减少了体脂(图14和图15)。图13为示出用于观察绣球酚的体重减少效果而向小鼠施用绣球酚时的体重变化的图表。图14为用于观察绣球酚的体脂减少效果而向小鼠施用绣球酚并使用双能x线吸收测量法测量小鼠的脂肪分布图像和体脂含有量的照片。图15a为在施用绣球酚时的体脂含有量的图表；图15b为在施用绣球酚时的脂肪重量的图表。4-3.分析由绣球酚引起的脂肪细胞大小减少效果为了进行组织学分析，将小鼠的副睾脂肪组织固定在4％多聚甲醛中。在进行几次通过连续的酒精浓度梯度(gradedalcoholseries)和洗涤的脱水(dehydration)后，将组织包埋在石蜡中。将组织切片切成4μm的厚度，并用苏木精(haematoxylin)和伊红(eosin)进行染色。为了检查白色脂肪细胞(whiteadipocyte)的大小，对每个脂肪细胞的区域使用cellsence软件(olympusco.，美国)测量每个切片。结果，可以确认当施用绣球酚时，脂肪细胞的大小减小(图16)。图16为用于观察绣球酚的减少脂肪球大小的效果而拍摄通过显微镜观察的脂肪细胞的照片。4-4.分析绣球酚对肝脏和肾脏的影响为了确认绣球酚是否引起肝脏和肾脏的损害，使用生化学分析仪(au480化学分析仪，贝克曼库尔特，加利福尼亚州，美国)对glutamicoxalacetivtransaminase(got)、glutamicpyruvatetransaminase(gpt)和bloodureanitogen(bun)进行血清分析。结果，如表3所示，7组之间没有示出显着性差异。这些结果意味着绣球酚不会引起肝脏和肾脏的损害。【表3】4-5.分析由绣球酚引起的血液中的中性脂肪和血液中的胆固醇的变化为了分析绣球酚对血液中的中性脂肪和血液中的胆固醇的影响，使用生化学分析仪(au480化学分析仪，贝克曼库尔特，加利福尼亚州，美国)进行血液生化学测试。结果，如表4和图17所示，确认了在施用绣球酚时，总胆固醇和ldl含量减少，并且中性脂肪和hdl含量无显着性差异。这些结果意味着绣球酚不影响中性脂肪和hdl含量，但是通过减少总胆固醇和ldl含量而具有改善由肥胖引起的血脂恶化的效果。图17a为示出在施用绣球酚时的胆固醇量的图表；图17b为示出在施用绣球酚时的ldl的量的图表。【表4】4-6.分析由绣球酚引起的与能量代谢相关的蛋白质表达当肝细胞中的能量减少以维持肝脏中的能量稳态时，ampk(amp-activatedproteinkinase)被激活，从而抑制脂肪和胆固醇的合成，反之促进脂肪酸氧化。因此，进行了试验以确认绣球酚是否增加了ampk的表达。具体地，将脂肪和肝组织与蛋白质提取溶液混合，使用组织研磨机破碎，然后在4℃下以15,000rpm离心30分钟，从而获得上清液，之后通过使用布拉德福方法创建标准曲线对蛋白质进行定量。将6倍的样品缓冲液添加到30μg蛋白质中并加热5分钟，然后使用10％sds-page凝胶执行电泳，并在pvdf膜上免疫印迹1小时20分钟。用包括5％(w/v)脱脂奶的tbst缓冲溶液(tris缓冲盐水-吐温20)封闭1小时后，将抗p-ampk抗体稀释至1：1000，并在4℃下反应18小时。用tbst缓冲溶液在10分钟期间洗涤3次后，在室温下与过氧化物酶结合的二抗反应2小时。用tbst缓冲溶液在10分钟期间洗涤3次后，使用增强化学发光试剂盒(amershamlifesciences，安玛西亚，英国)发色和显影成超级胶卷，从而确认各对照组和试验组的ampk磷酸化的变化，结果，确认在施用绣球酚组中，磷酸化的ampk蛋白质的量增加(图18)。这些结果意味着绣球酚具有对抗肥胖效果重要的ampk磷酸化诱导效果。图18a为确认在施用绣球酚时的脂肪组织中的p-ampk蛋白的表达的结果；图18b为确认在施用绣球酚时的p-ampk蛋白在肝脏中的表达的结果。剂型例1：片剂的制造按照常规的片剂制造方法对绣球酚混合下表5的成分并压片来制成片剂。【表5】剂型例2：胶囊剂的制造按照常规的胶囊剂制造方法对绣球酚混合下表6的成分并填充在明胶胶囊中以制造胶囊剂。【表6】剂型例3：果冻的制造按照常规的果冻制造方法对绣球酚混合下表7的成分并填充在三面布中以制备果冻。【表7】原料名称单位重量(g)绣球酚0.0030食物胶0.3600卡拉胶0.0600乳酸钙0.1000柠檬酸钠0.0600复合黄金提取物0.0200酶处理甜菊糖苷0.0440果寡糖液5.0000红葡萄浓缩液2.4000净化水13.9560剂型例4：营养霜的制造按照常规方法对绣球酚制造成下表8的组成。【表8】通常通过混合合适的成分来将上述组成比组成为剂型例，但是可以根据需要任意改变混合比和原料。由于本发明的样品在所有剂型例试验条件下都是稳定的，因此剂型的稳定性没有问题。当前第1页12