靶特异性胞外囊泡的制作方法

本发明涉及工程化靶特异性胞外囊泡的领域。本发明还涉及产生所述靶特异性胞外囊泡的方法。
背景技术：
：在近十年，随着外泌体被认为是细胞间通讯[1]的重要媒介，对其的研究也日益深入。外泌体在与质膜融合后从多囊泡体中释放出来，释放的囊泡作为将功能性rna、外泌体dna和包括受体在内的跨膜蛋白传递到周围环境的细胞中的递送载体而发挥功效[2]。鉴于其作为潜在治疗部分的优势，包括诸如低免疫原性和低细胞毒性等有利性质，对其应用的兴趣已经引发了进一步的发展，例如新的包封方法，改进外泌体内容物的胞浆释放，增强细胞摄取和更特异的细胞靶向性[3]。外泌体的囊泡摄取是细胞类型特异性的，可涉及膜融合或内吞作用，甚至可以通过刺激致癌性癌受体来诱导[4]。为了实现组织特异性递送，可以通过工程化源细胞来优化外泌体的靶向性，以过度表达外泌体膜蛋白，例如四跨膜蛋白，含有受体特异性配体肽作为识别单元[5]。四跨膜蛋白被称为分子促进剂，与称为四跨网(tetraspan-web)的大细胞信号传导复合物缔合，也涉及其他蛋白质家族的成员，如整合素和协同受体分子。此外，这种大的膜蛋白组装体可能与脂筏有关联[6-7]。而且，四跨膜蛋白cd9、cd63和cd81配体的内吞外泌体的作用已有报道[8-10]，但其摄取机制尚未阐明。尽管它几乎无处不在的分布，四跨蛋白cd81是富集在多囊泡体的外泌体部分中的主要蛋白[11]。在拓扑上位于跨膜结构域3和4之间的cd81的大细胞外环(lel)的特征在于五个螺旋元件形成蘑菇状结构[12-13]，由两对半胱氨酸来稳定。该基序在四跨膜蛋白家族的蛋白质成员中是保守的[14]，半胱氨酸键的氧化是丙型肝炎病毒(hcv)的e2包膜蛋白(cd81的天然配体)高亲和力结合的先决条件[15]。为了被抗体m38识别[16]，描述了半胱氨酸的正确配对，该抗体m38不与变性或还原的蛋白质结合，但可以与膜结合的hcd81以及纯化的可溶性hcd81的天然形式反应。在处溶解的hcd81lel的晶体结构揭示了一种新型的蛋白质折叠[12]，随后对160个四跨膜蛋白家族成员的序列分析表明，它们的折叠和关键结构特征是保守的[17]。除了半胱氨酸桥，hcd81lel还通过不变残基gly157和pro176来稳定，定位该不变残基gly157和pro176以容纳半胱氨酸连接，而tyr127则被完全掩埋并与his151和cys190一起形成氢键网络。可溶性hcd81lel围绕2倍轴组装成二聚体，并且原聚体之间的接触是每个相互作用伴侣的螺旋之间以及相对的原聚体的b螺旋和c末端残基之间的低极性区域。原聚体的n末端和c末端落在组装的二聚体的相对面上的中央区域，类似于在细胞表面上二聚体组装，其中也存在跨膜区段。第二低极性区域包括螺旋c和d的溶剂暴露表面，这在能量上是不利的。根据溶液研究，螺旋d是相当无结构的，仅在与某些抗原结合后才获得螺旋构象[18]。实际上，四跨膜蛋白家族成员的序列比对显示该区域的可变性增加，包括插入和缺失[19]。这表明，该表面积可能参与了物种或四跨膜蛋白特异性识别过程，[20]这可能暗示了异二聚体四跨膜蛋白物种组装的可能性[21]。特别地，cd81的d区段应该能够指导特定的同聚体聚类[22]。wo2014/168548公开了一种治疗性递送囊泡，其可以是例如外泌体或微囊泡，在其膜上附着有多肽结构，该多肽结构包含融合到信号不全的诱饵受体的载体多肽。wo2016/073864公开了一种b细胞靶向剂，包括与纳米粒、脂质基载体分子或胞外囊泡耦合的cd19或cd21靶向抗体。wo2018/075825公开了生物工程化的外泌体，包含融合蛋白，该融合蛋白包括与癌干细胞靶向肽融合的外泌体的区段。wo2018/015535a1公开了用含fc结合结构域的蛋白质包被的ev。示例性ev携带包含与蛋白a/g、a蛋白的z结构域或zz结构域等fc结合剂融合的外泌体蛋白的融合构建体。us2018/0015182a1公开了通过工程化四跨膜蛋白递送生物活性货物的外泌体，该四跨膜蛋白包含与蛋白质的融合物或者包括将蛋白质附接到外泌体的末端或环肽附接位点。elandaloussi等人(先进药物递送评论(advanceddrugdeliveryreviews)2013，65：391-397)描述了用于靶向sirna递送的外泌体。示例性靶向外泌体包括lamp2b-脑特异性肽(rvg，29聚体肽)融合蛋白。drummer等人(病毒学杂志(journalofvirology)2002，76(21)：11143-11147)描述了在与丙型肝炎病毒e2糖蛋白结合的cd81的lel上的结合位点。为了增强其作为下一代治疗载体的潜力，需要进一步开发外泌体介导的递送系统，特别是以改善其固有的细胞摄取效率低的问题。特别需要包含稳定性增加和靶向特异性得到改善的外泌体膜蛋白的外泌体介导的递送系统。技术实现要素：本发明的目的是提供靶向结合特征得到改善的靶特异性胞外囊泡。本发明的另一目的是提供靶向结合特征得到改善的靶特异性ev表面蛋白及其结合结构域。本发明解决了上述问题。根据本发明，提供一种生产包含胞外囊泡(ev)表面蛋白的靶特异性囊泡外结构域(ted)的蛋白质的方法，该方法包含通过诱变法修饰包含编码ev表面蛋白的囊泡外结构域(ed)的核苷酸序列的多核苷酸，在ed氨基酸序列内的至少一个长度为3～20个连续氨基酸的修饰区，该修饰区在其n末端和c末端的野生型ed序列的区域两侧，以使靶结合位点包含在ed内，从而产生编码多种ted的多核苷酸库，每个多核苷酸库包含不同的靶向结合位点，并且筛选特异性鉴定预定靶的ted，生成包含所筛选的ted的蛋白质。特别应理解的是，蛋白质，特别是本发明描述的靶结合分子(“结合剂”、“靶特异性分子”)的所有特征均是表征本发明方法的特征，反之亦然。具体地，包含ted的蛋白可以由ted组成，或者包含ted的蛋白是一种或多种另外的区域，例如，另一ed和/或跨膜结构域，或者特别包含异源性序列的重组融合蛋白。具体地，多核苷酸库包含在基因包中，该基因包在外表面展示有多种ted，优选地使用展示系统，该展示系统选自由以下物质组成的组：酵母、噬菌体、细菌、核糖体、mrna或哺乳动物细胞展示的。具体地，当修饰区从ted中分离时具有较低的靶结合亲和力。具体地，靶结合位点包括至少一个另外的结合区，该结合区位于距离至少2个氨基酸的另一修饰区内，或位于野生型ed序列内。所述至少一个另外的结合区优选地具有相同的ed和/或以本发明所述的另外的某一距离位于相同的ted内。具体地，ted与野生型ed有至少70％的序列同一性。具体地，野生型ed源自(或是)ev表面蛋白，该ev表面蛋白选自由以下物质组成的组：四跨膜样蛋白(tetraspan-likeprotein)、整合素家族蛋白、蛋白聚糖、五跨膜结构域蛋白、i型跨膜蛋白、notch家族蛋白、酶膜蛋白、免疫调节性表面蛋白、间充质干细胞表面标记物、糖蛋白或通道蛋白。具体地，四跨膜样蛋白是四跨膜蛋白，优选地选自由以下物质组成的组：a)cd81，其包含鉴定为seqidno：87的氨基酸序列；b)cd9，其包含鉴定为seqidno：89的氨基酸序列；c)cd53，其包含鉴定为seqidno：90的氨基酸序列；d)tspan32，其包含鉴定为seqidno：91的氨基酸序列；e)cd82，其包含鉴定为seqidno：92的氨基酸序列；f)cd63，其包含鉴定为seqidno：93的氨基酸序列；g)cd151，其包含鉴定为seqidno：94的氨基酸序列；h)cd37，其包含鉴定为seqidno：95的氨基酸序列或者其中该四跨膜样蛋白是溶酶体相关膜蛋白，优选地，lamp2包含鉴定为seqidno：96的氨基酸序列。具体地，野生型ed是以下中的任意一种：a)cd81，其中ed包含鉴定为seqidno：130或seqidno：131的氨基酸序列中的任意一种；b)cd9，其中ed包含鉴定为seqidno：132、seqidno：182或seqidno：133的氨基酸序列中的任意一种；c)cd53，其中ed包含鉴定为seqidno：134或seqidno：135的氨基酸序列中的任意一种；d)tspan32，其中ed包含鉴定为seqidno：136或seqidno：137的氨基酸序列中的任意一种；e)cd82，其中ed包含鉴定为seqidno：138或seqidno：139的氨基酸序列中的任意一种；f)cd63，其中ed包含鉴定为seqidno：140或seqidno：141的氨基酸序列中的任意一种；g)cd151，其中ed包含鉴定为seqidno：142或seqidno：143的氨基酸序列中的任意一种；h)cd37，其中ed包含鉴定为seqidno：144或seqidno：145的氨基酸序列中的任意一种；或者i)lamp2，其中ed包含鉴定为seqidno：146的氨基酸序列。具体地，蛋白质在ed氨基酸序列中包含环状结构，该环状结构在一种或多种半胱氨酸的位置稳定，以允许形成一种或多种二硫键。具体地，修饰区位于ed的环状区内。具体地，ed是a)cd81，该氨基酸序列经修饰引入半胱氨酸以允许形成野生型ed序列中非天然存在的一种或多种二硫键，优选地在位置134与144和/或130和146和/或135和168之间，其中人cd81的编号鉴定为seqidno：87，或者b)cd9，该氨基酸序列经修饰引入半胱氨酸以允许形成野生型ed序列中非天然存在的一种或多种二硫键，优选地在位置20与28之间，其中所述位置的编号是cd9大细胞外环(lel，seqidno：118)。具体地，ed是cd81，修饰区位于位置160和172内，其中人cd81的编号鉴定为seqidno：187。具体地，ted包含位于位置132与141之间或位置180与189之间的至少一个另外的结合区，其中人cd81的编号鉴定为seqidno：87。具体地，ed是cd9，修饰区位于位置155～166、位置128～142、位置130～140或位置169～180中任意一个位置内，其中人cd9的编号鉴定为seqidno：89。具体地，选自由以下物质组成的组：细胞靶，优选有丝分裂受体、细胞因子受体、唾液糖蛋白受体(asyaloglycoprotein)、膜转运蛋白、脂蛋白、脂糖、糖蛋白、蛋白聚糖或脱细胞靶，优选细胞因子、人工蛋白或人工表面结构。具体地，包含ted的蛋白质是包含ted和至少一个跨膜结构域的靶特异性ev表面蛋白(tsp)。具体地，跨膜结构域与源自哺乳动物ev表面蛋白的跨膜结构域有至少70％的序列同一性。具体地，跨膜结构域是以下中的任意一种：a)cd81，其中跨膜结构域包含鉴定为seqidno：147、seqidno：148、seqidno：149或seqidno：150的氨基酸序列中的任意一种；b)cd9，其中跨膜结构域包含鉴定为seqidno：151、seqidno：152、seqidno：153或seqidno：154的氨基酸序列中的任意一种；c)cd53，其中跨膜结构域包含鉴定为seqidno：155、seqidno：156、seqidno：157或seqidno：158的氨基酸序列中的任意一种；d)tspan32，其中跨膜结构域包含鉴定为seqidno：159、seqidno：160、seqidno：161或seqidno：162的氨基酸序列中的任意一种；e)cd82，其中跨膜结构域包含鉴定为seqidno：163、seqidno：164、seqidno：165或seqidno：166的氨基酸序列中的任意一种；f)cd63，其中跨膜结构域包含鉴定为seqidno：167、seqidno：168、seqidno：169或seqidno：170的氨基酸序列中的任意一种；g)cd151，其中跨膜结构域包含鉴定为seqidno：171、seqidno：172、seqidno：173或seqidno：174的氨基酸序列中的任意一种；h)cd37，其中跨膜结构域包含鉴定为seqidno：175、seqidno：176、seqidno：177或seqidno：178的氨基酸序列中的任意一种；或者i)lamp2，其中跨膜结构域包含鉴定为seqidno：179的氨基酸序列。具体地，ed和跨膜结构域都源自相同的ev表面蛋白，优选地，其中ev表面蛋白选自由以下物质组成的组：a)cd81，其包含鉴定为seqidno：87的氨基酸序列；b)cd9，其包含鉴定为seqidno：89的氨基酸序列；c)cd53，其包含鉴定为seqidno：90的氨基酸序列；d)tspan32，其包含鉴定为seqidno：91的氨基酸序列；e)cd82，其包含鉴定为seqidno：92的氨基酸序列；f)cd63，其包含鉴定为seqidno：93的氨基酸序列；g)cd151，其包含鉴定为seqidno：94的氨基酸序列；h)cd37，其包含鉴定为seqidno：95的氨基酸序列；以及i)lamp2，其包含鉴定为seqidno：96的氨基酸序列。本发明还提供了一种生产靶特异性胞外囊泡(tev)制剂的方法，包括：a)提供编码包含由权利要求1至19中任意一项所述的方法获得的ted的蛋白质的多核苷酸；b)将多核苷酸引入至源细胞或源细胞混合物；b)在产生胞外囊泡的条件下培养细胞；c)分离包含tev的部分，该tev包含ted的靶结合位点；以及d)生产包含在该部分中的tev的制剂。具体地，包含ted的蛋白质是包含ted和至少一个跨膜结构域的靶特异性ev表面蛋白(tsp)，tev在其膜的外表面展示靶结合位点。具体地，本发明所述的方法还包括用囊泡外负荷加载tev，其中该负荷包含以下中的任意一种或多种：肽、多肽、蛋白结构域、蛋白质、脂类、基因、核酸(如mrna、mirna)、rnai介导分子(尤其是锁定的核酸或硫代磷酸酯)、dna、dna片段、质粒(如微环dna)、药物(如小分子，尤其是化疗剂或解衰老剂)。具体地，源细胞或源细胞混合物源自(或是)真核或原核来源，优选地是身体组织、体液或细胞培养物。具体地，源细胞或源细胞混合物从受试者中获得，tev制剂是为自体使用而配制的。根据一个具体的方面，本发明提供了一种由本发明所述的方法获得的tev制剂。根据一个具体的方面，本发明提供了一种由本发明所述的方法生产的自体tev制剂，其中源细胞或源细胞混合物由受试者和为同一受试者自体使用而配制的tev制剂。本发明进一步提供了此自体tev制剂的医疗用途，特别是用于治疗有需要的受试者，其中源细胞或源细胞混合物从受试者中获得。具体地，受试者是患者，特别是患有病症或疾病的人患者。根据一个具体的方面，本发明提供一种蛋白质，包含由本发明所述的方法获得的胞外囊泡(ev)表面蛋白的靶特异性囊泡外结构域(ted)。根据一个具体的方面，本发明提供了一种胞外囊泡(ev)表面蛋白的靶特异性囊泡外结构域(ted)，该靶特异性囊泡外结构域与哺乳动物ev表面蛋白序列的野生型囊泡外结构域(ed)有至少70％的序列同一性，并且包含至少一个长度为3～20个连续氨基酸的修饰区，该修饰区在其n末端和c末端的野生型ed序列的区域两侧，该修饰区是野生型ed中非天然存在的靶结合位点的至少一部分，其中当所述修饰区从ted分离时具有较低的靶结合亲和力和/或其中所述靶结合位点包含在距离至少2个氨基酸的另一修饰区内或在野生型ed序列内的至少一个另一结合区。根据一个具体的方面，本发明提供了一种靶特异性ev表面蛋白(tsp)，包含至少一个跨膜结构域和囊泡外结构域(ed)，所述囊泡外结构域(ed)与哺乳动物ev表面蛋白序列的野生型ed有至少70％的序列同一性，并且包含至少一个长度为3～20个连续氨基酸的修饰区，该修饰区在其n末端和c末端的野生型ed序列的区域两侧，所述修饰区是在野生型ed中非天然存在的靶结合位点的至少一部分，其中当所述修饰区从ted分离时具有较低的靶结合亲和力和/或其中所述靶结合位点包含在距离至少2个氨基酸的另一修饰区内或在野生型ed序列内的至少一个另一结合区。根据一个具体的方面，本发明提供了一种多核苷酸，该多核苷酸编码本发明任意一种靶特异性分子，特别是包含本发明所述的ted的蛋白质、本发明所述的ted或本发明所述的tsp中的任意一种。具体地，多核苷酸是cdna分子。根据一个具体的方面，本发明提供了一种靶特异性胞外囊泡(tev)，包含膜并且在膜的外表面展示靶特异性分子，其中靶特异性分子是本发明所述的靶特异性分子中的任意一种，特别是包含本发明所述的ted的蛋白质、本发明所述的ted或本发明所述的tsp中的任意一种。根据一个具体的方面，本发明提供了一种药物制剂，包含本发明所述的靶特异性分子中的任意一种，特别是包含本发明所述ted的蛋白质、本发明所述的ted或本发明所述的tsp中的任意一种和药学上可接受的载体，或者该药物制剂直接包含本发明所述的tev和优选在用于皮内、皮下、静脉、局部或口服使用的配制剂。根据一个具体的方面，本发明提供了一种靶特异性胞外囊泡(tev)文库，包括多种本发明所述的至少102个tev，该多种至少102个tev包括具有不同修饰区的tev或由其组成，该修饰区在其n末端和c末端由相同的野生型囊泡外结构域(ed)的相同区域的两侧。具体地，tev文库包含tev库，该tev库包括本发明所述的靶特异性分子，其中该库覆盖至少102个不同的修饰区或靶结合位点。根据一个具体的方面，本发明提供了一种产生靶特异性胞外囊泡(tev)文库的方法，包括：a)提供编码多种靶特异性ev表面蛋白(tsp)的多核苷酸库，每个tsp包含不同的靶结合位点；b)将该库引入至所述源细胞中；以及b)分离包含具有不同靶结合特异性的靶特异性胞外囊泡(tev)的部分，产生tev文库，其中，多核苷酸的重现是通过诱变法编码ev表面蛋白的多核苷酸而产生的，以在至少一个长度为3～20个连续氨基酸的修饰区内获得所述ev表面蛋白的囊泡外结构域(ed)的突变，该修饰区在其n末端和c末端的野生型ed序列的区域两侧，以使靶结合位点包含在ed内。根据一个具体的方面，本发明提供了一种由本发明所述的方法获得的tev文库，优选地包含具有不同靶特异性的至少102个tev。根据一个具体的方面，本发明提供了一种胞外囊泡(ev)表面蛋白的靶特异性囊泡外结构域(ted)，其与哺乳动物ev表面序列有至少70％的序列同一性，并包含长度为3～20个连续氨基酸的至少一个修饰区，该修饰区在其n末端和c末端的野生型ed序列的区域两侧，该修饰区是在野生型ed中非天然存在的靶结合位点中的至少一部分，其中ted的特征如本发明进一步所述。具体地，当修饰区从ted中分离时具有较低的靶结合亲和力。具体地，ted与各个野生型ed序列有70％、80％、85％、90％或95％中至少一个的序列同一性。具体地，野生型ed源自ev表面蛋白，如本发明进一步所述。具体的ev表面蛋白是以下中的任意一种(或组合)：a)四跨膜蛋白样蛋白，b)整合素家族的蛋白质，c)蛋白聚糖，d)五跨膜结构域蛋白，e)i型跨膜蛋白，f)notch家族蛋白，g)膜蛋白，尤其是具有酶活性的膜蛋白(酶tm蛋白)，h)免疫调节性表面蛋白，i)间充质干细胞表面标志物，j)糖蛋白，k)通道蛋白，或l)其他外泌体(囊泡)表面蛋白。根据一具体实施方案中，ev表面蛋白是四跨膜蛋白样蛋白，特别是四跨膜蛋白或溶酶体相关膜蛋白。具体地，四跨膜蛋白属于四跨连接复合体超家族，如ii或ii类四跨膜蛋白，优选地选择以下：a)cd81，包含鉴定为seqidno：87的氨基酸序列或由其组成；b)cd9，包含鉴定为seqidno：89的氨基酸序列或由其组成；c)cd53，包含鉴定为seqidno：90的氨基酸序列或由其组成；d)tspan32，包含鉴定为seqidno：91的氨基酸序列或由其组成；e)cd82，包含鉴定为seqidno：92的氨基酸序列或由其组成；f)cd63，包含鉴定为seqidno：93的氨基酸序列或由其组成；g)cd151，包含鉴定为seqidno：94的氨基酸序列或由其组成；和h)cd37，包含鉴定为seqidno：9的氨基酸序列或由其组成。具体地，溶酶体相关膜蛋白是lamp2，其包含鉴定为seqidno：96的氨基酸序列或由其组成。具体地，起源蛋白是人野生型ev表面蛋白或与其有至少90％的序列同一性的人工蛋白(或非人动物的野生型蛋白)。具体地，起源ed是野生型ed，其源自人野生型ev表面蛋白或与其有至少90％的序列同一性的人工蛋白(或非人动物的野生型蛋白)。具体地，野生型ed是哺乳动物ev表面蛋白，如包含人或非人动物氨基酸序列或由其组成。具体地，野生型ed与包含在野生型ec序列或由其构成的ed氨基酸序列中的任意一种有至少90％、95％、98％、99％中至少一种的序列同一性或100％的序列同一性，特别是人ev表面蛋白，其是以下中的任意一种：a)cd81，其中ed包含鉴定为seqidno：130或seqidno：131的氨基酸序列中的任意一种或由其组成；b)cd9，其中ed包含鉴定为seqidno：132、seqidno：182或seqidno：133的氨基酸序列中的任意一种或由其组成；c)cd53，其中ed包含鉴定为seqidno：134或seqidno：135的氨基酸序列中的任意一种或由其组成；d)tspan32，其中ed包含鉴定为seqidno：136或seqidno：137的氨基酸序列中的任意一种或由其组成；e)cd82，其中ed包含鉴定为seqidno：138或seqidno：139的氨基酸序列中的任意一种或由其组成；f)cd63，其中ed包含鉴定为seqidno：140或seqidno：141的氨基酸序列中的任意一种或由其组成；g)cd151，其中ed包含鉴定为seqidno：142或seqidno：143的氨基酸序列中的任意一种或由其组成；和h)cd37，其中ed包含鉴定为seqidno：144或seqidno：145的氨基酸序列中的任意一种或由其组成；或者i)lamp2，其中ed包含鉴定为seqidno：146的氨基酸序列或由其组成。具体地，ed的序列在一端或两端可以不同，以使en延长或缩短若干氨基酸，例如，1、2、3、4或5个氨基酸，这取决于展示ev表面蛋白的ev或确定ed区域的方法。具体地，ed可以是任意的非人哺乳动物来源，如包含各个ec或各个非人同系物的囊泡外环序列或由其组成。具体地，哺乳动物野生型四跨膜蛋白样蛋白与哺乳动物野生型四跨膜蛋白样蛋白有90、95、98或99％的序列同一性中的任意一序列同一性，或者与哺乳动物野生型四跨膜蛋白样蛋白有100％的序列同一性。根据一个具体的实施方案，ev表面蛋白是cd81，修饰区定位在位置160和172内，其中人cd81的编号鉴定为seqidno：87。优选地，包含所述修饰区的此ted包含定位在位置132与141之间或位置180与189之间的至少一个另外的结合区，其中人cd81的编号鉴定为seqidno：87。根据一个具体的实施方案，ev表面蛋白是cd9，修饰区定位在位置155-166、位置128-142、位置130-140或位置169-180中的任意一位置内，其中人cd9的编号鉴定为seqidno：89。根据一具体实施方案，ted内(特别地，包含在把结合位点内的至少两个远端区或ed)的所述至少一个修饰区包括溶剂暴露残余物，优选地其中所述至少一个修饰区位于ed的环状和/或螺旋状区内。位置的溶剂暴露通常表示目标结合的有利接近性。确定溶剂暴露的测试方法是溶剂可接近表面积和相对接近表面积。具体地，溶剂暴露残余物是具有超过20％的相对可接近表面积的那些。根据另一具体实施方案，所述至少一个修饰区位于包含溶剂暴露残余物的ed的α-螺旋状区域内。具体地，α-螺旋状区域包括一系列卷曲，例如，卷曲氨基酸序列，特别是卷曲重复序列，其包含疏水和带电荷的氨基酸残基的重复模式，从而形成肽α-螺旋。具体地，ed的螺旋状区的长度范围为5～30、优选7～8个氨基酸。具体地，螺旋状区中的至少一个是一部分的靶结合位点。由于螺旋状区域通常倾向于二聚或多聚，如果靶结合位点包含在ed单体中，则所述靶结合位点可分别适当地防止二聚化和多聚化。具体地，ed是四跨膜蛋白，如cd81或cd9，靶结合位点包含或涉及四跨膜蛋白的至少一个螺旋状和/或环状结构，特别是分别在cd81和cd9的lel内。具体地，ev表面蛋白是cd81或cd9，特别是人cd81或cd9。具体地，表面蛋白是单体cd81或单体cd9。然而，在一些情况下，ed或ev表面蛋白仅在作为二聚体或多聚体存在时包含靶结合位点。在此情况下，优选工程化非螺旋状区域内的靶结合位点以分别确保二聚化和多聚化以及有效的靶结合。具体地，靶结合位点的位置随不同类型的ed或ev表面蛋白而变化。某些基序是保守的，而其他基序则可以在蛋白家族内或者在不同物种的类似序列中变化。例如，四跨膜蛋白家族的螺旋d相当无结构，仅在与某些抗原结合时才获得螺旋构型。四跨膜蛋白家族成员的序列比对显示出该区域内的天然可变性增加，包括插入和缺失。具体地，此类天然可变性表明定点诱变的耐受性良好。具体地，本发明所述的ed的修饰区定位在野生型ed序列的环状区内，特别是大胞细外环状区内。ev表面蛋白在附接到包括环状结构并且使环暴露于周围的囊泡中时可具有三级结构。此类环状区特别适合工程化ed内的靶结合位点。例如，四跨膜蛋白样分子可具有一种或多种囊泡外环和/或一种或多种大的囊泡外环(lel)。本发明还公开了cd81和cd9的示例性lel序列。在人cd81的情况下，lel序列鉴定为seqidno：7，在人cd9的情况下，lel序列鉴定为seqidno：118。具体地，本发明所述的ted或ev表面蛋白在氨基酸序列中包含环状结构，该环状结构在一种或多种半胱氨酸的位置稳定，以允许形成一种或多种二硫键。具体地，ted或包含本发明所述ted的ev表面蛋白包含至少一个环状区，该环状区由连接至少两个二硫键等氨基酸侧链的分子内键来稳定。ed或ev表现蛋白的环长度可发生变化。具体地，ed或ev表面蛋白包含至少一个大的囊泡外环，环的尺寸较小。大的囊泡外环的长度通常为75至140个氨基酸，优选78至132个氨基酸。具体地，小的环的长度为25至35个氨基酸，优选26至32个氨基酸。具体地，ed或ev表现蛋白包含至少一个螺旋状区或结构域，例如，1、2、3或4个螺旋状区。具体地，螺旋状区域在环状区域内，或者在表面蛋白的末端区内。具体地，ted或包含本发明所述tedev表面蛋白作为单体存在于ev的表面。尽管胞外或囊泡外表面蛋白倾向于二聚化或寡聚化以发挥生物学功能，但是工程化表面蛋白以作为单体进行靶结合。具体地，诱变环状和/或螺旋状区中的至少一个以在ed内产生修饰区，形成把结合位点的至少一部分。具体地，本发明所述的ted包含在靶特异性ev(tev)表面蛋白，该表面蛋白包含与ev(通常为跨膜结构域)锚定的至少一个环状和/或螺旋状结构。具体地，本发明所述的ted内的修饰区的长度为3-20个连续氨基酸，优选至少3、4、5、6、7、8、9、10、11或12，最多例如20、19、18、17、16、15、14、13或12个氨基酸。修饰通常会在任意此类修饰区内导致至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或最多20个点突变。具体地，所述修饰引入了多个点突变，包括在一个位置处的一个氨基酸的取代、插入或缺失，优选氨基酸取代，例如至少(或不超过)3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20中的任意一个氨基酸取代。具体地，优选的是在第一修饰区内连续位置处的多个点突变，例如，编号为3至20，具体为3、4、5、6、7、8、9或10个点突变；以及任选地，在远离所述第一修饰区的连续位置处第二修饰区内的点突变，例如，编号为3至20，具体为3、4、5、6、7、8、9或10个点突变，其中所述第一和第二修饰二者都包含在靶结合位点内。所述第一与第二修饰区之间的距离通常由源自野生型d的侧翼序列。具体地，修饰区与在其n末端和c末端的野生型ed序列的区域侧连，以使得侧翼区与修饰区的各个末端相邻。通常地，侧翼区的特征在于野生型ed的野生型氨基酸序列，其中野生型侧翼序列的长度为至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸，该连续氨基酸与野生型ed的各个(未修饰)序列相同。然而，根据一个具体的实施方案，可不存在侧翼区中的一个(但不是两个)。例如，修饰区可以是包括ed的c末端的末端区。在此类情况下，修饰区与仅在其n末端的野生型ed序列的区域侧连，修饰区是ed的c末端区。具体地，当修饰区定位在ted内时与靶结合，因此，其包含ted的周围二级或三级结构以特异性识别靶。根据一个具体的实施方案中，靶结合位点包含ted的至少所述修饰区和野生型区，和/或ted内、tsp内或包含ted和/或tsp的ev的表面上的另一修饰区。当从ted中分离或者当生产作为由作为修饰区的同一氨基酸序列组成的不同的肽时，通常地，该分离的修饰区具有较低的靶结合亲和力甚或是缺乏结合靶的特异性或选择性。与ted内的修饰区的靶结合相比，分离的修饰区具体地具有更低的亲和力或者更少的选择性结合，其结合常数或结合动力学至少为10倍或至少100倍、至少1000倍差异，如用相同的分析或可比较的设置所确定。本发明所述的ted和分离自所述ted的修饰区的靶结合性质的适宜分析方法可采用以下分析法中的任意一种：elisa、亲和力测定(例如，使用biacore)、生物层干涉法、显示与同源抗原孵育的ted的细胞的荧光测量、等温滴定微量热法、荧光相关光谱法。具体地，靶结合位点包含至少两个区域(其中，它们中的至少一个或两个是修饰区，如本发明所述)，这两个区在同一ev表面蛋白的至少两个不同的ed内，如由ev表面蛋白的至少一个跨膜结构域分离的ed。包含在ted内并包括或者涉及同一ed内或至少两个ed内的所述至少一个修饰区的具体优点是结合特性得到改善。此类改进的结合性质通常是在诱变ed内的预定区以形成包埋在ed内的具有结合特性的修饰区并且根据其靶结合特异性和/或亲和力选择适宜结合剂时获得的。与特定(肽)结合物与ed的可比较融合相比，结合特性得到特别改善，从而产生融合蛋白。这是因为融合后，结合特性通常会发生改变，以使得与分离的结合剂相比，可比融合蛋白在结合剂与ed融合时具有更小的亲和力或更少的选择性结合。具体地，修饰区是靶结合位点的至少一部分或者由靶结合位点组成。根据一个具体实施方案，修饰区包括结合位点的所有接触氨基酸残基。＝根据一个具体实施方案，靶结合位点包括一个以上的修饰结合区，其中至少一个第一修饰定位于距第二修饰区的一定距离。具体地，靶结合位点包含在距离2、3、4、5、6、7、8、9或10个连续氨基酸中的至少任意一个的另一修饰区内或在野生型ed序列内的至少一个另一结合区域。具体地，在所述至少两个远离的修饰区之间的区域包括与本发明所述的在其n末端或c末端的修饰区侧链的区域中的一个，其是野生型ed序列的区域。具体地，靶结合位点包含在所述ted的至少两个远端区内的结合残基。具体地，在所述至少两个远端区内修饰或诱变ted以包含所述靶结合位点。根据一个具体实施方案，靶结合位点包含在ed内、修饰区外的接触氨基酸残基。此类另外的接触氨基酸残基可以定位在ed的一种或多种另外的区域中，所述一种或多种另外的区域可包含例如包括一种或多种点突变的修饰(突变)氨基酸序列，或者可包含ed的野生型序列。根据一个具体实施方案，ed或把结合位点包含所述的至少一个修饰区，和一种或多种另外的点突变，或一系列氨基酸序列内的至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个连续的点突变，特别是某一距离处，例如至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸的距离。根据一个具体实施方案，ed或靶结合位点包含至少两个或三个所述修饰区。在特别优选的实施方案中，靶结合位点是构象结合位点，该构象结合位点包含在同一ed内或至少两个不同ed处的两个或更多个非连续区域，如涉及横跨至少两个区域的结合表面，每个位于某一距离处，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、13、14、15、16、17、18、19或20，通常最多100个或80个氨基酸的距离。具体地，远端结合区彼此不相邻。具体地，远端结合区在各个ev表面蛋白的序列内不连续。具体地，结合位点包含每个远端结合区和ted的任选的一种或多种其他接触点或区。具体地，靶结合位点包含ed的至少两个修饰区(例如，合成的或诱变的)和任选的至少一个其他区内的接触点，该至少一个其他区既不是合成的也不是诱变的，而是ed的天然(野生型)区。具体地，靶由包含在ev表面蛋白(具体地，包含本发明所述ted的部分)的囊泡外部分内的结合位点的构象抗体互补位结合，该互补位包括ted的远端区(例如，环和/或螺旋区)中的接触点。通过诱变远端区内的选定区域而方便地生产适宜的ted和各个ev表面蛋白。例如，在一个、两个或三个远端区内诱变本发明所述的ted。具体地，靶结合位点是识别在野生型ed或野生型ev表面蛋白中非天然存在的特异性预定靶的新结合位点，本发明中也称为“人工结合位点”。根据一个具体的实施方案中，靶结合位点可以是一种或多种ed内的新的或另外的结合位点，以使得ed具有新的或另外的靶结合特异性。这种新的靶结合位点可具有与ed的任意非天然存在的结合位点相同的靶结合特异性，或者具有例如可识别不同靶的不同特异性。根据另一个具体的实施方案中，靶结合位点可以是ed的经修饰的天然存在的结合位点，以使得ed具有与非天然结合位点相同的靶结合特异性(尽管精细特异性或亲和力会发生变化)。根据一个具体的方面，提供作为不同的分子的ted或包含此ted的蛋白质(如ev表面蛋白或tsp)可包含特异性识别相同靶或不同靶的至少一个或两个不同靶结合位点。本发明所述的ted具体地用于医疗用途，例如，以递送包含本发明所述ted的治疗有效量蛋白质或包含此类ted的靶特异性ev表面蛋白(tsp)，特别是在附接到ev时，从而提供了本发明进一步所述的靶特异性胞外囊泡(tev)。具体地，靶选自由以下物质组成的组：细胞靶，优选有丝分裂受体、细胞因子受体、唾液糖蛋白受体、膜转运蛋白、脂蛋白、脂糖、糖蛋白、蛋白聚糖或脱细胞靶，优选细胞因子、人工蛋白质或人工表面结构。根据一个具体的方面，靶是人细胞，例如，源于健康或患病受试者的细胞或者各自的细胞裂解物。将患病表型的人细胞优选用作靶。根据某一方面，靶结合位点特异性识别新型靶，即否则不会被天然存在的ed或ev表面蛋白结合的靶。根据另一个方面，靶结合位点特异性识别是ed或ev表面蛋白的天然配体，但具有修饰的结合特性，如选择性、优良的特异性、亲和性和/或亲和力，例如用于改善的靶结合。例如，四跨膜蛋白的天然配体是例如病原体的抗原或诸如细胞病原体或病毒的病原体。通过修饰由本发明所述的ted、tsp或tev呈现为表面蛋白的四跨膜蛋白的三级结构，可以改善结合特异，例如，以获得增加的选择性和/或结合亲和力，进而靶向各自病原体。具体地，该靶由抗原或抗原的抗原性结构、特别是表位组成，该表位另外地由靶特异性抗体识别。具体地，靶是细胞受体。根据具体的示例，包含本发明所述的ted或tsp的靶向细胞受体的ev可直接与受体细胞膜融合，从而使其膜蛋白并入质粒蛋白中并将其货物递送至受体细胞的细胞质中。具体地，靶是抗原，例如非天然存在的抗原或合成抗原。在某些实施方案中，靶抗原存在于患病患者的血液中，其抗原被ev的表面蛋白结合，进而从患者的心血管和/或淋巴系统中去除。具体的示例是不希望的天然试剂，如病原体、毒素、患病的或癌细胞、细胞因子或代谢物。在某些其他的实施方案中，靶抗原是合成抗原，例如，是固体表面，如移植物或植入物，或者可溶性化合物，如化学品或合成化合物，其在被本发明所述的特殊结合物(例如，ted、tsp或tev)有效结合时被去除。特殊的靶可以是天然靶，该天然靶通常由野生型ev识别。然而，包含在本发明所述的结合物中的靶结合位点可特异性识别新的靶，否则该新的靶不被野生型ev识别。在天然靶之中，存在病原体，如病毒抗原。本发明所述的特殊结合物(例如，ted、tsp或tev)可通过新的结合位点结合此类天然靶，这可提高结合特性，如结合亲和力、亲和性或特异性。根据一个具体的方面，本发明提供了一种靶特异性表面蛋白(tsp)，该靶特异性表面蛋白包含至少一个跨膜结构域和与哺乳动物ev表面蛋白序列有至少70％的序列同一性的至少一个囊泡外结构域(ed)以及至少一个修饰区，该至少一个修饰区的长度为3至20个连续氨基酸，该3至20个连续氨基酸在其n末端和c末端与野生型ed序列的区与侧连，该修饰区是在野生型ed中非天然存在的靶结合位点的一部分，其中tsp的特征进一步如本发明所述。具体地，当修饰区从tsp中分离时具有较低的靶结合亲和力。具体地，本发明所述的tsp的特征在于一种或多种囊泡外结构域，其中它们中的至少一个是靶结合性的(“靶特异性”)。具体地，所述tsp的ed是本发明所述的ted。具体地，所述至少一个跨膜结构域是囊泡膜蛋白，或者人工跨膜结构，其是例如由野生型跨膜结构域的诱变或适宜氨基酸序列的从头合成产生的。具体地，跨膜结构域(tm)与源自哺乳动物ev表面蛋白(例如本发明进一步所述ev表面蛋白中的任意一个蛋白)的各个野生型跨膜结构域序列有70％、80％、85％、90％、95％、96％、977％、98％、99％中至少任意一个的序列同一性或者有100％的序列同一性。具体地，野生型tm是诸如包含人或非人动物氨基酸序列或由其组成的哺乳动物ev表面蛋白。具体地，tm是囊泡膜蛋白，该囊泡膜蛋白是外泌体、微囊泡或凋亡体来源的，特别是野生型外泌体、微囊泡、凋亡体蛋白，或者包括修饰例如囊泡外区的野生型蛋白。具体地，野生型tm与tm氨基酸序列中的任意一种有90％、95％、98％、99％的序列同一性或者具有100％的序列同一性，该tm氨基酸序列包含在ev表面蛋白的野生型序列中或由其组成，在将ev表面蛋白与各个细胞或囊泡结合时ev表面蛋白能够整合在细胞或囊泡膜内。具体地，跨膜结构域是以下中的任意一种：a)cd81，其中跨膜结构域包含鉴定为seqidno：147、seqidno：148、seqidno：149或seqidno：150的氨基酸序列中的任意一个序列或者由其组成；b)cd9，其中跨膜结构域包含鉴定为seqidno：151、seqidno：152、seqidno：153或seqidno：154的氨基酸序列中的任意一个序列或者由其组成；c)cd53，其中跨膜结构域包含鉴定为seqidno：155、seqidno：156、seqidno：157或seqidno：158的氨基酸序列中的任意一个序列或者由其组成；d)tspan32，其中跨膜结构域包含鉴定为seqidno：159、seqidno：160、seqidno：161或seqidno：162的氨基酸序列中的任意一个序列或者由其组成；e)cd82，其中跨膜结构域包含鉴定为seqidno：163、seqidno：164、seqidno：165或seqidno：166的氨基酸序列中的任意一个序列或者由其组成；f)cd63，其中跨膜结构域包含鉴定为seqidno：167、seqidno：168、seqidno：169或seqidno：170的氨基酸序列中的任意一个序列或者由其组成；g)cd151，其中跨膜结构域包含鉴定为seqidno：171、seqidno：172、seqidno：173或seqidno：174的氨基酸序列中的任意一个序列或者由其组成；h)cd37，其中跨膜结构域包含鉴定为seqidno：175、seqidno：176、seqidno：177或seqidno：178的氨基酸序列中的任意一个序列或者由其组成；或者i)lamp2，其中跨膜结构域包含鉴定为seqidno：179的氨基酸序列或者由其组成。具体地，根据展示ev表面蛋白的ev或确定跨膜结构域的区域的方法，tm的序列可在一个或两端发生变化，以使得tm延长或缩短一定数目的氨基酸，例如，1、2、3、4或5个氨基酸。根据一个具体的实施方案，野生型ed和所述至少一个跨膜结构域都源自相同的哺乳动物ev表面蛋白，该哺乳动物ev表面蛋白优选地选自由以下物质组成的组：a)cd81，其包含鉴定为seqidno：87的氨基酸序列或由其组成；b)cd9，其包含鉴定为seqidno：89的氨基酸序列或由其组成；c)cd53，其包含鉴定为seqidno：90的氨基酸序列或由其组成；d)tspan32，其包含鉴定为seqidno：91的氨基酸序列或由其组成；e)cd82，其包含鉴定为seqidno：92的氨基酸序列或由其组成；f)cd63，其包含鉴定为seqidno：93的氨基酸序列或由其组成；g)cd151，其包含鉴定为seqidno：94的氨基酸序列或由其组成；h)cd37，其包含鉴定为seqidno：95的氨基酸序列或由其组成；以及i)lamp2，其包含鉴定为seqidno：96的氨基酸序列或由其组成。具体地，ev表面蛋白是外泌体、微囊泡或凋亡体来源的囊泡膜蛋白，具体的是野生型外泌体、微囊泡、凋亡体蛋白或者包括例如在囊泡外区中的修饰的这种类野生型蛋白。具体地，ev表面蛋白是源自细胞外泌体即外泌体蛋白的蛋白质。具体地，ev表面蛋白是源自细胞微囊泡即微囊泡蛋白的蛋白质。具体地，ev表面蛋白是源自凋亡小体的蛋白，即凋亡小体蛋白。很好理解的是，本发明用于修饰目的所使用的外泌体蛋白、微囊泡蛋白或凋亡体蛋白是细胞来源的，即它们是由各个细胞产生的，或者是人工的并通过从头合成产生的。具体地，所述ev表面蛋白是多肽、蛋白结构域或具有包含人工靶结合位点的结构的蛋白质。这种多肽、蛋白结构域或蛋白质可以是天然存在的，或者在部分上或全部是合成的。具体地，一个或两个跨膜结构域融合至表面蛋白的ed中，并能够使ed附接至ev的膜上。根据一个具体的方面，本发明提供了一种包含脂质双层膜和本发明所述ted或本发明所述tsp的靶特异性胞外囊泡(tev)，在脂质双层膜的外表面上展示了靶结合位点。具体地，本发明所述的ted可通过本发明所述的tsp或任意其他适宜手段例如通过配合、融合或亲和结合与ev结合。具体地，本发明所述的tsp可通过所述至少一个包含在tsp中的跨膜结构域与ev结合，特别地，其中，所述跨膜结构域在囊泡膜内，以使得tsp是将ted和任选地至少一个其它ed(其是否可以是靶结合)呈递至ev的外表面。具体地，所述至少一个跨膜结构域作用锚，该锚可融合至任意一种包含本发明所述ted如本发明所述tsp的靶结合分子中。具体地，tsp包含至少两个、三个或四个跨膜结构域，优选相同野生型ev表面蛋白的所有跨膜。具体地，可以使用一种或多种(例如，相同类型或不同类型)蛋白或人工跨膜结构域的一系列多于一个的跨膜结构域，从而产生囊泡外环区，即ev外侧的环结构。具体地，用于锚定至少一个环结构的跨膜结构域的数目是2个、3个或4个。然而，在某些情况下，表面蛋白包含不带环的三级结构。具体地，两个跨膜结构域用于在包含本发明所述tsp的ev的表面呈现一个囊泡外环结构。根据一个具体的实施方案，三个或四个跨膜结构域用于呈现两个囊泡外环结构，四个或五个跨膜结构域用于呈现三个囊泡外结构域。具体地，在本发明所述的一个tsp内，在一个跨膜结构域之后是环结构，如跨越所述跨膜结构域到另一跨膜结构域的氨基酸序列，或者将包含一种或多种诸如稳定环或干结构的那些的分子内键的环结构连接至囊泡表面。应理解的是，环结构可与至少一个跨膜结构域侧连，以例如通过肽肽环序列的n末端或c末端融合与囊泡外膜结合。如果仅与一个跨膜结构域侧连，则相对端(与跨膜结构域的融合相反的环序列的n或c末端)通常不锚定到膜上，例如松散端。如果例如通过肽环序列的n末端和c末端都与跨膜结构域融合来与两个跨膜结构域侧连，则环结构锚定到两侧的ev膜上。具体地，tsp是四跨膜蛋白样蛋白，包含跨越一种或多种环序列的多个跨膜结构域，具体地，能够呈现ev表面上四跨膜蛋白的野生型环结构的四个跨膜结构域，具体地，由四个跨膜结构域锚定的两个囊泡外环。具体地，tev源自身体组织、体液或细胞培养物的真核或原核源细胞。根据一个具体的实施方案，tev携带囊泡外负荷，例如，其中，该负荷包含以下中的任意一种或多种：肽、多肽、蛋白结构域、蛋白质、脂类、基因、核酸(例如mrna、mirna)、rnai介导分子(尤其是锁定的核酸或硫代磷酸酯)、dna、dna片段、质粒(如微环dna)、药物(如小分子，尤其是化疗剂或解衰老剂)。ev可以是膜囊泡，其是亚显微囊泡，包含脂质双层膜，如外泌体、微囊泡或凋亡体的膜。具体地，ev是由细胞产生或合成的。当由细胞产生时，ev可以通过生物过程由细胞释放到细胞外空间，并且在细胞释放之前或之后对表面蛋白进行工程化。ev可以例如用碳水化合物结构和/或通过与氨基酸或氨基酸序列融合和/或通过与化合物(如药物、标记或标签)偶联来进行表面修饰。具体地，脂质双层膜通过膜表面蛋白的所述至少一个跨膜结构域，各自编码序列的融合或通过化学和/或亲和性结合来锚定ted或ev表面蛋白(tsp)。在某些情况下，通过作为跨膜结构域的其它手段将表面蛋白锚定到胞外囊泡的脂质双层膜上。这种锚定可包括基于亲和力的相互作用，如链霉亲和素-生物素或蛋白质a-fc相互作用，或基于共价的相互作用，如马来酰亚胺-游离半胱氨酸。例如，可通过过度点击化学偶联来实现锚定。用于将表面蛋白与膜结合的示例性技术包括连接氨基侧链的原子如s-s连接(二硫化物桥联)、通过生物结合进行的结合例如通过点击化学，或另外的共价结合。替代技术采用生物素和亲和素等亲和性结合物将表面蛋白与膜连接。在某些情况下，一种或多种(人工)靶结合位点包含在本发明所述的tev的一种或两种表面蛋白(相同或不同的蛋白质)上。具体地，可以使用两种不同的表面蛋白来产生至少两个不同的结合位点，例如，以识别相同或不同抗原的不同表位。具体地，本发明所述的tev可以是单特异性的或双特异性的，甚至是寡特异性的。在某些情况下，本发明所述tev的另外的靶结合位点可源自任意结合结构，如衍生自蛋白质，多肽或肽，包括抗体和抗体片段或具有结合部分的复合物分子。具体地，结合位点可以是抗体的抗原结合部分，或酶、贴壁蛋白、配体中任意一种的结合位点，或受体的配体结合结合位点，所述结合位点能够结合伴侣的同源对。特别地，ev表面蛋白可包含抗体或抗体片段的蛋白结构域的一种或多种结合位点，或各个抗体结构域或片段如包括一个、两个或更多个可变抗体结构域(例如，fab、fv、vh/vl二聚体、scfv、dab、f(ab)2)的那些，或其他生物结合物如可溶性t细胞受体、darpins等。本发明具体所述的是经修饰的四跨膜蛋白，该经修饰的四跨膜蛋白包含新的靶结合位点，其特征在于与野生型人四跨膜蛋白lel的氨基酸序列有75％、80％、85％或90％中任意一个的序列同一性，优选80％至90％的序列同一性，如在cd81的情况下，lel鉴定为seqidno：7，或在cd9的情况下，lel鉴定为seqidno：118。包含新的靶结合位点的经修饰的四跨膜蛋白的具体示例的特征在于与全长野生型人四跨膜蛋白的氨基酸序列有75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％或98％中任意一个的序列同一性，优选90％至98％的序列同一性，如在cd81的情况下，氨基酸序列鉴定为seqidno：87，或在cd9的情况下，氨基酸序列鉴定为seqidno：89。根据具体的示例，新的靶结合位点包含在鉴定为seqidno：7的cd81的lel内的修饰区(结合区)，特别是鉴定为seqidno：87的全长蛋白的区域aa113-201内的修饰区。具体的实施方案是指在aa130-201内的新的靶结合位点。具体的示例是指在dc81的氨基酸序列(seqidno：87)中的修饰以取代第160-162位和第181-189位处的至少一个氨基酸。根据另一个具体的实施方案，ev表面蛋白是cd9，结合残基位于至少一个或两个不同的区域内，该至少一个或两个不同的区选自以下区域：155-166；128-142；130-140；169-180。具体地，cd9是由seqidno：89识别的人cd9。用于二硫化物桥联的优选的cys残基是132和140，其中编号根据seqidno：89。根据另一个具体的实施方案，ev表面蛋白是cd53，结合残基位于至少一个或两个不同的区域内，该至少一个或两个不同的区选自以下区域：147-160；121-134；123-129；164-169。具体地，cd53是由seqidno：90识别的人cd53。根据另一个具体的实施方案，ev表面蛋白是tspan32，结合残基位于至少一个或两个不同的区域内，该至少一个或两个不同的区选自以下区域：158-171；130-144；132-139；174-183.。具体地，tspan32是由seqidno：91识别的人tspan32。根据另一个具体的实施方案，ev表面蛋白是cd82，结合残基位于至少一个或两个不同的区域内，该至少一个或两个不同的区选自以下区域：153-172；178-188；128-137；194-215。具体地，cd82是由seqidno：92识别的人cd82。根据另一个具体的实施方案，ev表面蛋白是cd63，结合残基位于至少一个或两个不同的区域内，该至少一个或两个不同的区选自以下区域：149-165；171-176；127-135；179-189。具体地，cd63是由seqidno：93识别的人cd63。根据另一个具体的实施方案，ev表面蛋白是cd151，结合残基位于至少一个或两个不同的区域内，该至少一个或两个不同的区选自以下区域：159-177；186-191；135-145；194-206。具体地，cd151是由seqidno：94识别的人cd151。根据另一个具体的实施方案，ev表面蛋白是cd37，结合残基位于至少一个或两个不同的区域内，该至少一个或两个不同的区选自以下区域：156-177；183-206；131-141；218-229。具体地，cd37是由seqidno：95识别的人cd37。ev表面蛋白或相应ed(或任意结构域，除了包含在ev表面蛋白中的跨膜结构域)可用于在预定区域内进行诱变以引入本发明所述的一种或多种新的靶结合位点。包含新的靶结合位点的另一ev表面蛋白可通过诱变相应区域来产生。为了鉴定适宜的区域，已使用swissmodelmodelingserver和cd81等模板分析ⅰ类四跨膜蛋白(例如，cd9、cd53和tspan32)的大胞细外环序列。利用蛋白质结构与功能预测程序(i-tassermodelingserver)对具有代表性的ⅱ类四跨膜蛋白的cd82的大胞细外环序列进行了建模。已使用cd82模型坐标对ⅱ类四跨膜蛋白(cd63、cd151和cd37)的序列进行了建模。根据一个具体的实施方案，通过在形成能稳定蛋白质的囊泡外环结构的一种或多种另外的二硫键的位置引入一种或多种半胱氨酸来稳定或热稳定ev表面蛋白(例如，cd81或任何其他四跨膜蛋白)。具体地，在表面蛋白的囊泡外结构域的至少一个区域中引入至少一个另外的半胱氨酸。具体地，在表面蛋白的至少两个不同区域中引入半胱氨酸。引入新的半胱氨酸可通过新的(人工)二硫键来连接区域，二硫键通常由半胱氨酸的巯基(-sh)氧化形成。特别地，表面蛋白的三级结构可以由一种或多种另外的小环修饰，该小环来自一种或多种另外的分子内键。这种另外的小环可用于创建人工结合位点的进一步接触点。一种或多种另外的分子内二硫键成功地增加了表面蛋白的稳定性，如用标准方法测定蛋白质热稳定性的方法所测量的。稳定的ev表面蛋白可以方便地用作支架以通过诱变ev表面蛋白内的预定区域来产生ev表面蛋白库，每个区域具有不同的靶结合或不同的靶结合特性。这样的库适合作为一个库来选择感兴趣的靶的结合物。具体地，由于认可残基的数量在理论上决定了未突变蛋白质的自由能变化，因此可以通过目视检查晶体结构在第一步中预先选择诱变为半胱氨酸对和随后形成半胱氨酸键的候选位置。具体地，在预选候选物中引入至少一个新的半胱氨酸键，优选地，通过诱变引入至少一个或一对半胱氨酸来创建新的半胱氨酸键。具体优选的示例是指经修饰的四跨膜蛋白，该经修饰的四跨膜蛋白包含新的二硫键，新的二硫键在还原时连接cys残基，cys残基是藉由在两个远端位点(例如，环的n-末端及c-末端)处诱变四跨膜蛋白序列(例如，其中一个ecs，尤其是tatraspanin的lel)而引入的，从而稳定了环结构。由至少一个二硫键稳定的任何此类环结构优选地用于诱变四跨膜蛋白以在此类环结构内工程化新的靶结合位点。具体地，通过插入或取代中的任意一种来引入至少两个半胱氨酸。根据具体的示例，在cd81中引入另外的半胱氨酸以稳定和/或修饰lel的三级结构。根据一个具体的实施方案，ev表面蛋白是cd81，修饰氨基酸序列以引入半胱氨酸，从而优选地在第134至144位置之间和/或在第130和146位置之间和/或在第135和168位置之间形成天然存在于野生型ed序列中的一种或多种二硫键。具体地，cd81是人cd81，在氨基酸120和200内的一位置处引入第一半胱氨酸，在氨基酸143和201内的一位置处引入第二半胱氨酸，其中人cd81的编号鉴定为seqidno：87。具体地，在氨基酸130和140内的一位置处引入第一半胱氨酸，在氨基酸144和170内的一位置处引入第二半胱氨酸。具体地，在位置134和144处将半胱氨酸引入至人cd81序列中，分别取代了a134c和l144c，从而通过另外的分子内二硫键连接cd81的lel的螺旋a和螺旋b。可选择地，分别在位置135和168处引入另外的半胱氨酸，分别取代了v134c和v144c，从而通过另外的分子内二硫键连接cd81的大胞细外环的螺旋a和螺旋c。根据一个具体的实施方案，例如通过ala134cys和lys144cys的诱变，在鉴定为seqidno：87序列的cd81(特别地，cd81的ed，如lel)中引入cys残基，从而在位置134和144处引入新的跨半胱氨酸的二硫键。根据另一个实施方案(另外的或替换的)，例如通过val135cys和ser168cys的诱变，在鉴定为seqidno：87的cd81序列中引入cys残基，从而在位置135和168处引入新的跨半胱氨酸的二硫键。根据另一个实施方案(另外的或替换的)，例如通过ala130cys和ala146cys的诱变，在鉴定为seqidno：87的cd81序列中引入cys残基，从而在位置130和146处引新的跨半胱氨酸的二硫键。根据另一个实施方案(另外的或替换的)，例如通过val135cys和ser168cys的诱变，在鉴定为seqidno：87的cd81序列中引入cys残基，从而在位置135和168处引入新的跨半胱氨酸的二硫键。具体地，修饰人cd81的ed中的至少一个ed，特别是lel，以在位置134和144以及位置135和168处引入另一半胱氨酸，从而将螺旋a与螺旋b连接以及将螺旋a与螺旋c连接。这种cd81突变体在其lel中具有潜在稳定的新二硫键ala134cys/lys144cys和val135cys/ser168cys的组合，这显示出在至少20℃的熔化温度中的正位移增加。具体地，修饰人cd9的ed中的至少一个，特别是lel，以引入另一半胱氨酸，从而获得一种或多种新的(另外)二硫化物桥。优选地，二硫化物桥是连接位置20和28，如可通过诱变lys20cys和arg28cys获得，其中位置的编号是cd9lel(seqidno：118)。所得的稳定变体的序列具体地包括seqidno：125或由其组成。具体地，与野生型蛋白质相比，发生热解折叠的温度升高5、10、15、20、25、30、35、40、45、50或55℃表示诱变的预选候选物的热稳定性提高。具体地，本发明所述的ted、tsp或tev中的任意一种具有亲和力以结合所述kd小于10-5m、优选小于10-6m、10-7m或10-8甚至小于10-9m的靶。通常，结合物被认为是kd<10nm的高亲和力结合物，在一些情况下，例如，出于治疗目的，提供了具有较高亲和力的的ev，其中例如，kd<1nm或kd<0.1nm或kd<0.01nm或kd<pm(皮摩尔＝10-12m)。一旦已证明所选的ted、tsp或tev可结合感兴趣的目标，则选定的结合ed或ev表面蛋白可通过亲和力成熟的标准方法(例如，通常用于产生亲和力成熟抗体的那些方法)进行亲和力成熟。为此，在分子的一个区域内或在整个分子内，仅可引入少量点突变，例如1、2、3、4或5个点突变，最多可引入10个点突变，以产生新的靶结合物库，所述靶结合物库可被选择以分离具有增强的结合亲和力的结合物。这种亲和力成熟的结合物可表现出结合亲和力增加，其kd差至少为1或2log。特异性结合可以适当的结合测定法测定，例如常规免疫测定。本领域已知有许多方法用于检测免疫分析中的结合。可以使用本领域已知的各种免疫分析，包括使用诸如放射免疫分析、elisa(酶联免疫吸附分析)、免疫放射分析、凝胶扩散沉淀反应、免疫扩散分析、westernblot、biacore等技术的竞争性和非竞争性分析系统。根据优选的实施方案，本发明所述的tev源自真核或原核源细胞。本发明中，将源细胞理解为能够产生本发明所述ev的供体细胞。然而，源细胞也可仅作为模板以例如使用一种或多种由源细胞产生的成分(如跨膜结构域和/或表面蛋白)来在体外产生相应的合成ev，并构建具有本发明所述特征的tev，但不依赖于细胞运输机制。示例性真核生物是哺乳动物、植物、昆虫、真菌或酵母。具体的示例是人或非人动物来源的细胞，特别是包括cho细胞等中国仓鼠源性细胞的哺乳动物、植物，特别是拟南芥或玉米或真菌，特别是酿酒酵母或毕赤酵母。示例性原核生物是细菌。已知来自格兰阴性菌的ev是外膜囊泡(omv)。具体的示例是乳酸杆菌或分枝杆菌病原体或沙门氏菌、结核分枝杆菌、卡他莫拉菌或流感嗜血杆菌的ev。具体地，源细胞是身体组织、体液或细胞培养物，优选的是动物或植物细胞；或哺乳动物体液或组织，优选的是血液、尿液、羊水、腹水、脑脊液、唾液、滑液或骨髓。具体地，本发明所述的ev由源细胞的细胞培养物产生。具体地，组织是器官，如肾、大脑或胎盘。具体地，组织是肿瘤或转移瘤组织，或良性组织。具体地，源细胞是干细胞，如间充质干细胞(msc)、羊膜干细胞或诱导多能性干(ips)细胞、内膜细胞、造血细胞、上皮细胞、内皮细胞、神经细胞、血细胞或免疫细胞。具体地，ev的源细胞是羊膜来源的多能干细胞、绒毛膜来源的间充质干细胞、诱导多能干细胞、角质形成细胞、成纤维细胞、胚胎干细胞、外胚层基质细胞、内胚层基质细胞、嗅鞘细胞、牙髓干细胞或永生化间充质干细胞。具体地，源细胞选自正常或永生的人类细胞，如诱导多能干细胞或成体干细胞、上皮细胞和癌细胞。具体地，源细胞是哺乳动物宿主细胞等重组宿主细胞的细胞系，例如，用作细胞工厂的细胞系，如人类原代细胞、端粒酶永生化细胞系或由包括腺病毒e1a、hpv衍生的e6、ebv衍生的癌基因、sv40或转录因子组合的病毒癌基因永生化的细胞系。具体地，细胞系包括端粒酶永生化内皮细胞或间充质干细胞、hek293、cho、vero、hek或cap。在大规模ev生产中适当使用的细胞包括间充质干细胞、树突状细胞和hek细胞或293t细胞。具体地，源细细胞是优选人类来源的哺乳动物干细胞或树枝状细胞。根据一个具体的实施方案，ev表面蛋白对源细胞来说具有内源性。然而，内源性ev表面蛋白通常通过本发明所述的tev呈现为修饰的表面蛋白。根据另一个具体的实施方案，ev表面蛋白与源细胞异源。异源性ev表面蛋白可源自不同类型的源细胞，或者可以是非天然存在的合成表面蛋白。当使用合成源蛋白时，可以在无任何进一步修饰的情况下在分子内合成新的靶结合位点。与修饰的天然表面蛋白不同，合成表面蛋白通常与天然(野生型)表面蛋白不具有序列同一性(例如，少于50％的序列同一性)。具体地，本发明所述的tev的尺寸为10至1000nm，优选30至150nm。具体地，本发明所述的tev的浮力密度为1.0至1.4，优选1.1至1.2(g/cm3)，如由密度-梯度超速离心法所测量。根据一个具体的实施方案中，本发明所述的tev携带囊泡内负荷。具体地，该负荷在10-14至10-10μl的体积范围内(每一个ev的体积)。具体地，负荷包括活性物质或活性物质的混合物，例如，负荷效率在5％到90％之间。根据一个具体的实施方案，提供本发明所述的结合物(特别是本发明所述的ted、tsp或tev)以用于治疗所需受试者的医疗用途。医疗用途包括通过施用本发明所述tev或通过例如作为试剂或亲和基质(例如用于从体液中清除不想要的物质)的离体使用来治疗疾病状况的治疗。其他的医学用途是例如触发免疫应答以将抗原呈递给受试者的免疫系统，例如用于主动免疫治疗。ev本身可作为治疗剂或者作为递送系统来递送特定的负荷。根据具体的示例，囊泡外负荷是活性物质或封装在囊泡膜内的药物。具体地，使用活性物质以与在ev中天然存在的元素协同作用。根据另一具体示例，ev仅作为运载工具来达到特定目标，有时会受到常规给药途径的高度保护。具体地，提供本发明所述的结合物以用于任意化妆品、食品或工业目的。具体的实施方案是指以脂质或油脂组合物提供或例如用于化妆品、食品目的而封装的此类tev。工业目的包括分析或制备目的，如以分别分析或制备特定的结合物(在工业规模上)。具体地，tev携带包含自体或异种活性物质的负荷，特别是包含异种化合物的负荷，以作为靶向载体用于医学用途来治疗有用所述化合物进行靶向治疗需要的受试者。根据一个具体的方面，本发明提供了一种通过施用本发明所述的治疗有效量的结合物来治疗有需要的受试者的方法，特别是出于治疗或诊断目的而向所述受试者施用本发明所述的tev或tev制剂以改善或检测某一病症，特别是疾病病症。具体地，使用有效量的tev，其中根据施用的囊泡外负荷来测定剂量。具体地，负荷包括至少一种自体或异种化合物。具体地，该负荷包含以下中的任意一种或多种：肽、多肽、蛋白结构域、蛋白质、脂类、基因、核酸(如mrna、mirna、rnai介导分子，尤其是锁定的核酸或硫代磷酸酯、dna、dna片段)、质粒(如微环dna)、药物(如小分子，尤其是化疗剂或解衰老剂)。小分子药物在本发明中被理解为可调节生物过程的低分子量(<900d)有机化合物。小分子可以具有多种生物功能或应用，如细胞信号分子、医药药物、农业杀虫剂等。这些化合物可以是天然的(如次生代谢物)或人工的(如抗病毒或化疗药物)；它们可能对疾病有有益的作用(如药物)或有害的(如致畸剂和致癌物)。根据一个具体的方面，tev源自对所述受试者自体的源细胞。具体地，根据受试者的需要，使用自体来源的tev，其在体外(受试者身体外)被修饰和/或装载以用于体内给药。根据一个具体的方面，本发明提供了包含分离的tev的tev制剂。tev制剂的具体特征在于同质ev群，其包括具有相同靶特异性的至少50％ev，优选30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％ev中的至少一种。根据一个具体的方面，tev制剂系均一制剂，其中值尺寸在100nm与150nm之间或在120nm与140nm之间。比产率优选地为至少1000个ev/源细胞、更优选的，至少1500个ev或至少1600个ev/源细胞。具体地，tev制剂以储存稳定的水溶液或冻干制剂的形式提供。本发明还提供了一种药物制剂，包含本发明所述的ted、或tsp或tev中的任意一种和药学上可接受的载体，优选用于皮内、皮下、静脉、局部或口服使用的制剂。根据一个具体的方面，本发明提供一种生产包含胞外囊泡(ev)表面蛋白的靶特异性囊泡外结构域(ted)的蛋白质的方法，该方法包含在ed氨基酸序列内的至少一个长度为3～20个连续氨基酸的修饰区内，通过诱变法修饰包含编码ev表面蛋白的囊泡外结构域(ed)的核苷酸序列的多核苷酸，该修饰区在其n末端和c末端的野生型ed序列的区域两侧，以使靶结合位点包含在ed内，从而产生编码多种ted的多核苷酸库，每个多核苷酸库包含不同的靶向结合位点，并且筛选特异性鉴定预定靶的ted，生成包含所筛选的ted的蛋白质。具体地，多核苷酸库包含在基因包中，该基因包在外表面展示有多种ted，优选地使用展示系统，该展示系统选自由以下物质组成的组：酵母、噬菌体、细菌、核糖体、mrna或哺乳动物细胞展示的。具体地，包含所选ted的蛋白质是本发明所述的tsp。具体地，所选ted的特征如本发明进一步描述的。本发明还提供了一种产生本发明所述tev制剂的方法，包括：a)将编码本发明所述tsp的多核苷酸引入源细胞或源细胞混合物中；b)在产生细胞外小泡的条件下培养所述细胞；c)分离包含tsp的靶结合位点的tev的部分；和d)生产包含在所述部分中的tev的制剂。具体地，源细胞或源细胞混合物从受试者的生物样品中获得。具体地，所述受试者的生物样品选自由以下物质组成的组：血液、尿液、羊水、腹水、脑脊液、唾液、滑液或骨髓。具体地，在细胞培养物中培养或在生物样品内培养之前分离源细胞。具体地，受试者是动物，如哺乳动物，包括人或非人动物。根据一个具体的实施方案，提供了一种制备本发明所述tev的制剂的方法，其来源于受试者的干细胞，包括：a)将编码tev表面蛋白的多核苷酸或基因引入干细胞中；b)在产生细胞外囊泡的条件下培养所述干细胞；c)例如根据靶结合特异性分离包含tev的部分；和d)生产tev制剂。具体地，在细胞培养物中培养或在生物样品中培养之前分离干细胞。根据一个具体的实施方案，ev从间充质干细胞(msc)中获得。msc可以通过细胞培养的体外增殖来制备，例如通过分散胚胎干细胞集落。从间充质干细胞中分离ev，特别是外泌体，可以在间充质干细胞条件培养基中进行。可通过在细胞培养基中培养msc、其后代或其衍生的细胞系并分离细胞培养基来获得培养基。具体地，源细胞或源细胞混合物从受试者中获得，并且tev制剂配制成供自体使用。本发明具体提供通过本发明所述方法制备的自体tev制剂，其中源细胞或源细胞混合物从受试者中获得并且向同一受试者施用tev制剂。根据一个具体的实施方案，tev可靶向于肿瘤，并且负载的tev可在用直接从所述肿瘤中获得的抗原进行负载时产生。具体地，引入源细胞或源细胞混合物中的多核苷酸或基因编码tsp，并且tsp的ed通过tsp的至少一个跨膜结构域与ev的表面结合。根据一个具体的实施方案，可通过转染将编码tsp的多核苷酸或基因引入源细胞中。具体地，在进行培养之前用所述基因转染细胞。具体地，通过任何常用的转染方法(例如电穿孔)或通过用sirna等凋亡诱导剂转染(尤其是基于脂质体的转染)将编码基因引入细胞中。根据一个具体的实施方案，在产生膜囊泡并释放tev的条件下在细胞培养物中培养源细胞或源细胞混合物，从而在培养上清液中获得tev。具体地，细胞培养条件适应于不同的源细胞或包括源细胞的不同生物样品。根据一个具体的方面，生物样品由来自受试者的生物液体(骨髓、外周血等)、培养上清液、细胞溶菌产物、预纯化溶液或包括膜囊泡的任何其他组合物组成。用于产生tev的具体细胞培养方法还包括诱导氧化应激。氧化应激可由外部添加的细胞因子或由过氧化氢等氧化剂诱导。外泌体也可人工合成或制造，即，不从人类或非人类细胞中分离。通过各种脂质形成技术合成外泌体，而不是将其分离出来。具体地，在优选地通过囊泡内负载所述囊泡来产生携带所述化合物的胞外囊泡的条件下，在包含活性物质(例如异源化合物)的细胞培养物中源细胞或源细胞混合物。具体地，所述囊泡内负载是通过孵育、任选地破坏膜或通过将负载与膜的组件结合来实现的。具体地，通过包括基于试剂的方法(磷酸钙、聚乙烯亚胺、阳离子聚合物、deae-葡聚糖、活化树状大分子、磁珠)或基于仪器的方法(电穿孔、超声、玻化技术、微注射、激光干涉、光注射)的任何适宜的转染技术来负载tev。或者，可通过将化合物与膜(例如，通过与膜脂蛋白结合或融合)结合或融合来负载tev。可以在体外、体内或离体负载tev。可以在产生胞外囊泡之前或之后负载tev。具体地，源细胞可通过采用生物、酶和/或化学反应的任何合适方法进一步进行表面修饰，以例如产生包含修饰(例如，修饰表面蛋白质糖基化(例如，通过唾液酸化、岩藻糖基化或糖基化)、翻译后修饰和/或偶联的tev化合物、药物、标记、标签或酶(如酶底物)或化学反应基团。为了分离tev，特别是微泡或外泌体，收集源细胞的细胞培养基，预先清除细胞和碎片，并进行一系列(超)离心步骤。随后，通常对所得的tev颗粒进行蔗糖密度梯度离心，以分离均匀的ev群。具体地，处理培养上清液以使其富含膜囊泡。特别地，从产生膜泡的细胞群的培养上清或从生物样品中获得的预纯化溶液进行离心、澄清、超滤、纳滤和/或亲和层析等处理。对细胞培养基或上清液可以通过具有特定多孔径或特定截留分子量的膜进行过滤，特别是采用切向力过滤或超滤。具体地，通过任何一种或多种结合亲和配体、离心、色谱、澄清、超滤或纳滤来分离和选择性浓缩包含tev的部分。根据一个具体的方面，制备tev的方法，特别是从生物样品中进行纯化的方法，包括至少一个阴离子交换色谱步骤。可以使用不同类型的阴离子交换材料进行阴离子交换色谱，如纤维素、聚二乙烯基苯、琼脂糖、右旋糖酐、丙烯酰胺、二氧化硅、甲基丙烯酸乙二醇共聚合物或其混合物，例如琼脂糖-葡聚糖混合物。可以不同的方式洗脱，特别是通过浓度升高的盐水溶液梯度，洗脱保留在柱上的ev。通常，通过使用连续分光光度读数测量柱出口处的光学密度来检测以这种方式纯化的不同部分。作为替代品，或除了阴离子交换色谱步骤外，还可以使用凝胶渗透色谱。通常，使用选择自二氧化硅、丙烯酰胺、琼脂糖、右旋糖酐、甲基丙烯酸乙二醇共聚合物或其混合物(例如琼脂糖-葡聚糖混合物)的材料来执行凝胶渗透色谱步骤。本发明还提供了一种ted库，包括本发明所述的102、103、104、105或106个ted中的至少任意一个，每个ted具有不同的修饰区，该修饰区在其n端和c端处与同一野生型囊泡外结构域(ed)的同一区域侧连。优选地，ted文库包括至少102、103、104、105或106个ted中的任何一个，每个ted具有不同的修饰区和/或靶特异性。具体地，ted文库包括至少2x106、107、2x107、108或2x108个具有不同靶特异性的ted。本发明还提供了一种tsp文库，包括本发明所述的多个102、103、104、105或106个tsd中的至少任意一个，每个tsd在其n端和c端与同一野生型囊泡外结构域(ed)的同一区域侧连。优选地，tsd文库至少包括102、103、104、105或106个tsd中的任何一个，每个tsd具有不同的修饰区和/或靶特异性。具体地，tsd文库包括至少2x106、107、2x107、108或2x108个具有不同靶特异性的tsd。本发明还提供了一种tev文库，包括本发明所述的多个102、103、104、105或106个tev中的至少任一个，每个tev具有不同的修饰区，该修饰区在其n端和c端与同一野生型囊泡外域(ed)的同一区域侧连。优选地，tev库至少包括102、103、104、105或106个tev中的任意一个，每个tev具有不同的修饰区和/或目标特异性。具体地，tev文库包括至少2x106、107、2x107、108或2x108个具有不同的靶特异性的tev。根据一个具体的方面，本发明还提供了由本发明进一步所述的方法产生的一种结合物文库，如本发明所述的ted、tsp或tev。明确地，产生任何此类文库的方法包括通过诱变方法诱变包含编码ev表面蛋白ed的多核苷核酸的核酸序列以在长度为3-20个连续氨基酸序列的至少一个预定修饰区内获得所述ed的突变，所述3-20个连续氨基酸序列在其n端和c端与野生型ed序列的区域侧连，以将新型靶结合位点包含在ed或ev表面蛋白内。本发明还提供了一种生成靶特异性胞外囊泡(tev)文库的方法，包括：a)提供编码多种靶特异性ev表面蛋白(tsp)的多核苷酸库，每个tsp包含不同的靶结合位点；b)将所述库引入源细胞中；以及b)分离具有不同的靶结合特异性的包含靶特异性细胞外囊泡(tev)的一部分，以产生tev文库，其中，多核苷酸库是通过用诱变法诱变编码ev表面蛋白的多核苷酸以在长度为3～20个连续氨基酸的至少一个修饰区内获得所述ev表面蛋白的囊泡外结构域(ed)的突变而产生的，以将靶结合位点包含在ed内，该修饰区在其n末端和c末端的野生型ed序列的区域两侧。具体地，该库可以通过诱变方法产生，以在ed的至少一个预定区域内修饰所述多核苷酸或基因以产生本发明所述的修饰区。具体地，应用所述诱变方法以在修饰区内获得随机的氨基酸序列。具体地，所述诱变方法采用对本发明所述的ed或ev表面蛋白的至少一个或两个远端区的诱变，从而产生编码多种ed或ev表面蛋白的多核苷酸库，每个ed或ev表面蛋白具有不同的结合特异性，并选择编码ted或tev的多核苷酸，该ted或tev特异性识别靶。具体地，多核苷酸库包含在展示细胞外囊泡外表面蛋白种类的基因包中。具体地，使用本发明进一步描述的展示包，例如，编码本发明描述的表面蛋白的可复制基因包，其中展示包展示在自然或人工来源的胞外囊上，优选地选自外体、微囊泡、纳米颗粒和脂质体。任选地，选择编码ted或tsp的多核苷酸用于在细胞培养物中产生相应的ted或tsp和/或用于产生包含所述ted或tsp的相应tev。可在使用或不使用ev的情况下诱变表面蛋白或相应编码序列，例如以在ev表面蛋白的预定区域内，特别是在可呈现在ev或细胞的外表面上的那些区域内(即表面蛋白的囊泡外或胞外部分)，引入一种或多种点突变。具体地，产生多核苷酸库，该多核苷酸库包含在展示外表面上的多种表面蛋白的基因包中。具体地，展示包是编码本发明所述表面蛋白的可复制基因包，如选自噬菌体、噬菌体酰胺和细胞展示包，优选细菌、哺乳动物或昆虫细胞或酵母，或体外展示系统，例如核糖体展示系统。这种体外显示系统将核酸信息特异性地翻译成相应的蛋白序列，该蛋白序列表现出相关的结合特异性和亲和力。具体优选地使用展示系统，该展示系统选自由以下物质组成的组：酵母、噬菌体、细菌、核糖体、mrna或哺乳动物细胞展示的。根据一个具体的示例，本发明所述的ed或ev表面蛋白通过选自基因iii、基因vi、基因vii、基因viii或基因ix的蛋白产物的锚定蛋白由由噬菌体或噬菌体粒展示，其中基因iii通常是有利的，因为它位于噬菌粒或噬菌体的n-末端的。根据一个具体的实施方案，本发明所述的ed或ev表面蛋白可由常规展示蛋白质的酵母展示，例如，通过与aga2酵母表面蛋白融合。这通常用于酵母展示文库。锚定到酵母细胞也可以通过锚定蛋白(如蛋白a)的共表达来实现。或者，可溶性表面蛋白可从酵母细胞分泌并在酵母细胞表面衍生化后通过蛋白a或特异性识别所需靶序列的抗体的外部添加而捕获。可以提供一系列展示施例如具有不同结合特性的不同表面蛋白的显示包。特别地，可以提供展示相同表面蛋白的不同修饰(例如，表面蛋白质的人工结合位点内的不同修饰)的一系列展示包来展示具有不同结合特性的那些蛋白质。在如本发明所述的方法中，展示库特异性地与靶接触，使得根据展示库的一系列成员的靶结合特性来选择它们。在识别靶的展示库的成员中，一种或多种库成员可被鉴定为具有高靶特异性和/或亲和力。这种鉴定可具体理解为选择任何种类的结合物的步骤，即根据结合特异性进行的选择。具体的方法允许根据结合和功能这两者同时进行选择，使用以下任何方法和手段中任意一种：荧光活化细胞分选(facs)通常用于这些研究，使用任何合适的靶细胞，与任何检测抗体、结合蛋白或诸如膜联蛋白v之类的染料耦合，该染料可触发结合或表型变化，如细胞凋亡。任何类似的灵敏系统都可以通过先进的成像或具有微观灵敏度的光探测系统来跟踪和表征与靶细胞的结合事件。facs也是分离结合物和在细胞中表征其相应表型变化的主要技术。此外，还有一系列用于高通量蛋白质组学和细胞生物学的技术，其中高度自动化的显微分析是目前最有用的技术之一。自动化的高信息含量数字显微镜可以自动分析样本中的单个细胞，从而实现改进。一旦选择了合适的结合物，其编码序列可用于产生表面蛋白或工程化包含所述tsp的融合蛋白，例如，跨膜结构域和所述ted的融合，并产生在囊泡和/或细胞膜表面表达此类蛋白的重组细胞，或以其他方式产生tev本发明所述的包含tsp和/或在其外表面上呈现ted。本发明进一步提供了一种从本所述的文库中选择特异性识别预定靶的候选结合物的方法，该方法为：在允特异性靶结合的条件下将库与靶接触，选组并分离具有经证实的靶结合特异性的候选结合物。在如本发明所述的方法中，将文库与靶(例如，靶抗原或靶细胞)特异性接触，使得靶被文库的成员结合。在识别靶的库成员中，一种或多种文库成员可被鉴定为具有高靶特异性和/或亲和力。这种加你的那个可具体理解为选择任何种类的结合物的步骤，即根据结合特异性进行选择。附图说明图1：本发明使用的序列seqidno：7，野生型人cd81lel的氨基酸序列seqidno：8，野生型人cd81lel的核苷酸序列seqidno：87，人cd81的氨基酸序列seqidno：88，人cd81的核苷酸序列seqidno：89，人cd9的氨基酸序列seqidno：90，人cd53的氨基酸序列seqidno：91，人tspan32的氨基酸序列seqidno：92，人cd82的氨基酸序列seqidno：93，人cd63的氨基酸序列seqidno：94，人cd51的氨基酸序列seqidno：95，人cd37的氨基酸序列seqidno：96，人lamp2的氨基酸序列cd81、cd9、cd53、tspan32、cd82、cd63、cd151、cd37、lamp2的囊泡外结构域：seqidno：130，人cd81的ec1seqidno：131，人cd82的ec2seqidno：132，人cd9的ec1seqidno：182，人cd9的ec1seqidno：133，人cd9的ec2seqidno：134，人cd53的ec1seqidno：135，人cd53的ec2seqidno：136，人tspan32的ec1seqidno：137，人tspan32的ec2seqidno：138，人cd82的ec1seqidno：139，人cd82的ec2seqidno：140，人cd63的ec1seqidno：141，人cd63的ec2seqidno：142，人cd151的ec1seqidno：143，人cd151的ec2seqidno：144，人cd37的ec1seqidno：145，人cd37的ec2seqidno：146，人lamp2的ed(ec)cd81、cd9、cd53、tspan32、cd82、cd63、cd151和cd37的4个跨膜结构域(tm1-4)；；lamp2的一个tm：seqidno：147，人cd81的tm1seqidno：148，人cd81的tm2seqidno：149，人cd81的tm3seqidno：150，人cd81的tm4seqidno：151，人cd9的tm1seqidno：152，人cd9的tm2seqidno：153，人cd9的tm3seqidno：154，人cd9的tm4seqidno：155，人cd53的tm1seqidno：156，人cd53的tm2seqidno：157，人cd53的tm3seqidno：158，人cd53的tm4seqidno：159，人tspan32的tm1seqidno：160，人tspan32的tm2seqidno：161，人tspan32的tm3seqidno：162，人tspan32的tm4seqidno：163，人cd82的tm1seqidno：164，人cd82的tm2seqidno：165，人cd82的tm3seqidno：166，人cd82的tm4seqidno：167，人cd63的tm1seqidno：168，人cd63的tm2seqidno：169，人cd63的tm3seqidno：170，人cd63的tm4seqidno：171，人cd151的tm1seqidno：172，人cd151的tm2seqidno：173，人cd151的tm3seqidno：174，人cd151的tm4seqidno：175，人cd37的tm1seqidno：176，人cd37的tm2seqidno：177，人cd37的tm3seqidno：178，人cd37的tm4seqidno：179，人lamp2的tm其他示例性四跨膜蛋白：tspan8，np_001356689，seqidno：184tspan14，np_001121781，seqidno：185cd231(tspan7)，np_004606，seqidno：186蛋白质的整合素家族cd49d，np_000876，seqidno：187itgb5，np_001341694.1，seqidno：188itgb6，np_000879.2，seqidno：189itgb7，np_000880.1，seqidno：190cd71，np_003225，seqidno：191蛋白聚糖cd138(syndecan-1)，np_001006947，seqidno：192syndecan-2，np_002989，seqidno：193syndecan-3，np_055469，seqidno：194syndecan-4，np_002990，seqidno：195hspg2，np_001278789.1，seqidno：1965跨膜结构域蛋白质家族cd133，xp_011512195，seqidno：195i型跨膜蛋白cd50，np_001307534，seqidno：196cd102，np_001093259，seqidno：197notch家族notch1，np_060087，seqidno：198notch2，np_001186930，seqidno：199notch3，np_000426，seqidno：200notch4，np_004548，seqidno：201dll1，np_005609，seqidno：202dll4，np_061947.1，seqidno：203jag1，np_000205.1，seqidno：204jag2，np_002217.3，seqidno：205cd11a，xp_011544151.1，seqidno：206cd11b，np_001139280.1，seqidno：207cd11c，np_001139280.1，seqidno：208cd18/itgb2，np_001120963.2，seqidno：209cd41，np_000410.2，seqidno：210cd51，np_001138472.1，seqidno：211cd61，np_000203.2，seqidno：212cd104，np_001308052.1，seqidno：213具有酶活性的膜蛋白(酶tm蛋白)cd13，np_001141.2，seqidno：214免疫调节性表面蛋白，包括fc受体、t-细胞受体、补体受体、白细胞介素受体、免疫球蛋白、mhci或mhc-ii成分cd2，np_001758.2，seqidno：215cd3ε，np_000724.1，seqidno：216cd3ζ，np_932170.1，seqidno：217cd18，np_001120963.2，seqidno：218cd19，np_001761.3，seqidno：219cd30，np_001268359.2，seqidno：220cd34，np_001764.1，seqidno：221cd36，np_001120915.1，seqidno：222cd40，np_001289682.1，seqidno：223cd40l，np_000065.1，seqidno：224cd44，np_001001391.1，seqidno：225cd45，np_001254727.1，seqidno：226cd47，np_001768.1，seqidno：227cd86，np_787058，seqidno：228cd110，np_005364.1，seqidno：229cd111，np_976031.1，seqidno：230cd115，np_001336665.1，seqidno：231cd117，xp_016863667.1，seqidno：232cd125，xp_011531979.1，seqidno：233cd135，xp_011533319.1，seqidno：234cd184，np_001334985.1，seqidno：235cd200，np_001352780.1，seqidno：236cd279，np_005009.2，seqidno：237cd273，np_079515.2，seqidno：238cd274，np_054862.1，seqidno：239cd362＝syndecan-2(参见seqidno：193)egfr，np_958441.1，seqidno：240l1cam，np_001137435.1，seqidno：241lfa-1，np_001120963.2，seqidno：242lgals3bp，np_005558.1，seqidno：243mfge8，np_001297248.1，seqidno：244sllt2，np_001276064.1，seqidno：245stx3，np_004168.1，seqidno：246间充质干细胞的表面标记物cd44(seqidno：225，如上)cd45(seqidno：226，如上)cd71(seqidno：191，如上)cd73(也包括在酶tm蛋白质组内)，np_001191742.1，seqidno：247cd90，np_001298091.1，seqidno：248cd29(也包括在整合素家族组内)，np_596867.1，seqidno：249cd105，np_001265067.1，seqidno：250cd106(也包括在唾液酸糖蛋白组内)，np_001069.1，seqidno：251cd146，np_006491.2，seqidno：252cd164，np_001135874.1，seqidno：253cd166，np_001618.2，seqidno：254stro-1，np_004958.2，seqidno：255糖蛋白cd54，np_000192.2，seqidno：256唾液酸糖蛋白cd235a，np_001295116，seqidno：257通道蛋白：包括ca-通道蛋白glur2，np_000817.3，seqidno：258glur3，np_000819.3，seqidno：259hla-dm，np_006111.2，seqidno：260其他：flot2，np_004466，seqidno：261本发明提供了ev表面蛋白序列作为氨基酸序列，其可以包括或不包括信号序列。在本发明应理解的是，用于本发明所描述的诸如ted、tsp或tev的工程化结合物的目的的ev蛋白质序列是没有相应序列信息的信号序列(如果有的话)的那些。本领域技术人员可以容易地鉴定哪一个是包括作为本发明所鉴定的序列的n末端部分的信号序列。本发明提及的蛋白参考号是相应ncbi参考号(美国国家医学文库国家生物技术信息中心，8600rockvillepike，bethesdamd，20894usa)图2：人cd81二维模型的示意图(seqidno：87)。胞外结构域包含两个环，从氨基酸trp34到tyr63的小囊泡外环(sel)和从phe113到lys201的大囊泡外环(lel)。它包含四个跨膜结构域(tm)，tm1跨越val12到leu33，tm2跨越tyr64到gln85，tm3跨越leu90到gly112，tm4跨越leu202到met228。图3：野生型跨四膜蛋白cd81的两种不同结构示意图。示出了跨膜区域tm1-tm4、小泡外环(箭头所示)、大囊泡外环的结构性保守结构域(螺旋a、b和e)以及该结构域的可变区(螺旋c和d)。示出了lel的二硫键(db)，用星号标记囊泡内半胱氨酸残基，该囊泡内半胱氨酸残基是棕榈酸酯附着的可能部位。lel的可变区包含两个(如图所示的野生型cd81)、三个或四个由半胱氨酸残基分隔的片段。图4：重组cd81在hela细胞膜上的定位。图5：膜上的重组snorkel标签。(a)：snorkel标记的cd81(b)：snorkel标记的cd63，如在瞬时转染的hela细胞中使用抗ha抗体所显示。(c)电镜免疫金标记证实重组ev的cd81和ha阳性。图6：用prescission蛋白酶洗脱携带snorkel标签的重组ev。图7：通过携带重组cd81-gfp融合蛋白的ev的大小、数量和比率来表征重组ev。图8：caco-2中的ev摄取。(a)荧光显微镜观察到的摄取；(b)流式细胞术对摄取阳性细胞的定量。图9：用含有毒性sirna的重组ev处理caco-2细胞。具体实施方式除非另有指示或定义，否则本发明中使用的所有术语在本领域中具有其通常的含义，这将是本领域技术人员所清楚的。例如，参考标准手册，如sambrook等人的《分子克隆：实验室手册》(第2版)，第1-3卷，冷泉港实验室出版社(1989年)；lewin，“基因iv”，牛津大学出版社，纽约，(1990年)，和janeway等人，“免疫生物学”(第5版，或更新版本)，garlandscience，纽约，2001年。权利要求的主题具体是指人工产品或使用或生产此类人工产品的方法，其可以是天然(野生型)产物的变体。尽管可以对天然结构具有一定程度的序列同一性，但是众所周知，本发明的材料、方法和用途，例如，特别是指分离的核酸序列、氨基酸序列、表达构建体、转化的宿主细胞和重组蛋白，是“人工的”或合成的，因此不被认为是“自然法则”的结果。关于ed或跨膜结构域等蛋白结构域的术语“结构域”在本发明中被理解为连续氨基酸序列的多肽或蛋白质，其至少是多肽或蛋白质的某一部分(或全长)。结构域可以包含在较大的蛋白质中。然而，当蛋白结构域在从比结构域大的蛋白质中分离时，其也称为结构域。术语“表达”以以下方式理解。含有本发明所述抗体等表达产物的期望编码序列的核酸分子和控制序列和可操作连接的启动子可用于表达目的。用这些序列转化或转染的宿主能够产生编码的蛋白质。为了实现转化，表达系统可以包含在载体中；然而，也可将有关的dna整合到宿主染色体中。具体地，该术语指在适当条件下的宿主细胞和相容性载体，例如，用于表达编码由载体携带外源dna并引入宿主细胞中的蛋白质。编码dna是一种dna序列，它编码特定多核苷酸或抗体等蛋白质的特定氨基酸序列。启动子dna是一种dna序列，它启动、调节或以其他方式介导或控制编码dna的表达。启动子dna和编码dna可来自同一基因或不同的基因，也可来自相同或不同的生物体。重组克隆载体通常包括一种或多种用于克隆或表达的复制系统、一种或多种用于在宿主中选择的标记物(例如抗生素抗性)和一种或多种表达盒。本发明所用的“表达载体”或“载体”定义为克隆的重组核苷酸序列(即重组基因)的转录和其mrna在适当宿主生物体中的翻译所需的dna序列。“表达盒”是指dna编码序列或dna片段，该dna编码序列或dna片段编码能插入到限定的限制性位点处的载体中的表达产物。盒式限制性位点设计为确保适当的阅读框中插入盒。通常，将外源dna插入载体dna的一种或多种限制性位点，然后与传播载体dna一起由载体携带到宿主细胞中。插入或添加了dna的dna片段或序列，如表达载体，也可称为“dna构建体”。表达载体包括表达盒，并且另外通常包括用于在宿主细胞中自主复制的起源或基因组整合位点、一种或多种可选标记物(例如，氨基酸合成基因或对诸如玉米黄霉素、卡那霉素、g418或潮霉素等的抗生素具有抗性的基因)、许多限制性内切酶切割位点、合适的启动子序列和转录终止子，这些成分可操作地连接在一起。本发明使用的术语“载体”包括自主复制的核苷酸序列以及基因组整合核苷酸序列。常见的载体类型是“质粒”，它通常是双链dna的自包含分子，可以容易地接受额外的(外源的)dna，并且可以容易地引入到合适的宿主细胞中。质粒载体通常包含编码dna和启动子dna，并且具有一种或多种适合插入外源dna的限制性位点。具体地，术语“载体”或“质粒”是指通过其可将dna或rna序列(例如，外源基因)引入至宿主细胞中以转化宿主并促进所引入序列的表达(例如，转录和翻译)的载体。术语“胞外囊泡”，缩写为“ev”，包括具有靶结合特异性的ev，如本发明所述的tev，其在本发明中理解为细胞囊泡，或源于细胞的囊泡，其提供在细胞外部。ev不仅可以由各自的源细胞或供体细胞在体内或离体产生，还可以在不使用细胞的情况下人工产生，例如，通过体外工程化脂质体或纳米粒子的方法来产生包含本发明所述ev特征的合成ev。ev通常是由多种细胞类型分泌的膜包囊，包括t细胞、b细胞、树突状细胞、血小板、肥大细胞、上皮细胞、内皮细胞、神经元细胞、癌细胞、少突胶质细胞、雪旺细胞、胚胎细胞和msc。ev也天然存在于正常尿液、血液、支气管灌洗液、母乳、唾液、脑脊液、羊水、滑膜液和恶性腹水等生理液中。实验证明，ev在细胞间通信中起着重要作用。它们介导细胞间的通讯，使功能核酸从来源细胞转移到受体细胞。它们与免疫反应、维持体内稳态、凝血、炎症、癌症进展、血管生成和抗原表达等过程有关。因此，ev参与了许多生理和病理条件。ev可包含生物分子或合成货物，这里称为“载荷”。因此，由于其循环稳定性、生物相容性、低免疫原性和毒性等特点，它们成为靶向治疗或诊断的有吸引力的运载工具。ev特别能够在细胞之间传输化合物，包括神经元。有利的是，它们能够越过血脑屏障。这种天然的贩运能力使胞外囊泡有可能被用作各种自体或异源化合物的运载工具。本发明所述的示例性ev是外泌体或微囊泡。外泌体是一种胞外膜封闭的囊泡，它包含细胞从中分泌的分子成分。外泌体是ev的主要亚类之一，具有内体核内体起源。外泌体ev是由多泡内胚体限制膜内生而形成的纳米大小的内切酶源囊泡。因此，它们的大小与mve内的腔内囊泡的大小相等，mve内囊泡的大小通常在30nm至120nm之间，优选为50nm至100nm。细胞在特定膜区吸收少量胞内液体形成早期内胚体时，通过胞吞-胞吐途径发生了外泌体ev的生物发生。早期胚乳开始成熟，扩展为晚期内胚层，然后腔内囊泡或多泡体(mvb)是由内胚层内萌发形成的。mvb随后融合到细胞膜上，释放到细胞外环境中。此时，囊泡称为外泌体，其通过p53调控的胞吞作用释放，并在细胞骨架激活途径的控制下，但不受钙的影响。外泌体ev的直径可为30–100nm，蔗糖梯度下的密度为1.13至1.19g/ml；它们可以例如100,000g通过离心收集。分离后，它们可以作为冻干剂或水溶液(例如室温或冰箱温度(2℃-8℃)或冷冻(例如，冷冻)收集，在保持功能的同时，不使用任何有毒的冷冻保护剂(在-80℃或更高达-18℃)下超过6个月。外泌体ev可含有大量的表面蛋白，如膜联蛋白、四跨膜蛋白，例如cd63、cd81和cd9，和热休克蛋白，包括hsp60、hsp70和hsp90。它们还表达alix、肿瘤易感基因101(tsg101)和网格蛋白。外泌体ev特别包含脂质双层膜，该膜保护其内容物并使其能够在组织中移动很长距离。膜通常含有少量的磷脂酰丝氨酸和大量的胆固醇、神经酰胺和鞘脂。微囊泡是一种由质膜碎片形成的膜囊泡。微囊泡ev通常从细胞表面萌发，其大小可在50nm到1000nm之间变化。人工微泡囊泡，例如半合成ev和全合成ev，其大小可以为10到1000nm，优选10到500nm，甚至更优选10到100nm。微囊泡ev通常通过超速离心分离，蔗糖梯度下密度为1.04至1.07g/ml。微囊泡ev通常含有大量与脂筏相关的含磷脂酰丝氨酸的蛋白质，并且富含表面标记物cd40以及胆固醇、鞘磷脂和神经酰胺。特别地，它们也被包裹在脂质双层膜中并且包含跨膜蛋白，例如四跨膜蛋白。通常，凋亡体ev通过凋亡细胞的细胞膜向外起泡和碎裂释放，直径范围为50-2,000nm。ev通常通过表面配体和粘附分子与靶细胞相互作用。在一些情况下，它们可通过内吞摄取或通过囊泡与细胞膜的直接融合进入细胞。它们也可以通过脂质配体受体的相互作用介导的粘附到细胞表面来传递其内容物。这些相互作用表明，在不同的生理和病理条件下，ev可在细胞间通讯和免疫调节中发挥关键作用。纳米ev表示一种优异的药物载体的替代品。由于ev膜的成分通常来自来源细胞或供体细胞(例如干细胞)，因此这些粒子本质上是非免疫原性的，允许它们抵抗从循环中的快速清除，从而提高药物输送到靶组织的效率。已知它们通过细胞类型特异性蛋白质(及其表面配体和粘附分子)天然地具有特定的细胞取向性或归巢能力，这是靶向药物递送的关键要求之一。然而，天然靶点是有限的，亲和力和特异性的问题很常见。通过工程化包含如本发明所述的表面蛋白的ev，提供了靶特异性ev，其可以以高度特异性和亲和力靶向任何期望的靶点或细胞类型。本发明所述的ev对于医疗目的特别有用，例如，诊断或治疗疾病或疾病状况，特别是那些经证明靶向治疗可改善疾病状况的疾病。间充质干细胞衍生的ev，尤其是外泌体ev，在用作再生疗法方面可能特别有用。来源于间充质干细胞(msc)的ev可以携带生物活性分子，这些分子可以转移到靶细胞，发挥其治疗作用，如再生组织损伤、抑制炎症反应、调节免疫系统等。因此，ev在无细胞再生医学中是一种有效、安全、廉价的治疗手段。ev可以是一种合适的药物递送系统，特别是用于跨越生物屏障(例如血脑屏障)并将其负载递送到其他不可到达的部位。ev可以通过生物、化学和物理手段等多种途径来体现预期的载药活性。将活性物质或药物(如化学品、rna、dna、蛋白质或脂质)封装到ev中，可以通过保持其完整性和体内生物活性，大大提高其生物利用度。来自供体细胞的脂膜适合于避免宿主循环中的吞噬、降解和修饰。特别是，自体和异种ev通常避免网状内皮系统(也称为单核吞噬系统)中的包埋，并且在大多数(如果不是全部)参数中是非免疫原性的。各种方法可用于将活性物质制剂装载到ev中。这些包括(1)离体加载到纯化的ev中，或(2)在ev产生之前预加载到供体(源)细胞中，每个细胞随后进行分离和选择性纯化。离体装载策略主要利用治疗分子的被动包装，从简单的孵化到更复杂的化学和/或物理方法。疏水性(即亲油性)分子，如抗氧化剂、抗癌药物、亲油性染料，在环境条件下可以自发地包装成ev。事实上，已证明了姜黄素，阿霉素和紫杉醇的成功负载到ev。与磷脂酰胆碱和胆固醇组成的标准脂质体相比，ev具有更高的载药效率和载药能力。许多活性物质不能自由穿透ev的膜，因此ev的负载通常受到影响，例如，通过电穿孔、超声、渗透、融合脂质体、聚合物载体和/或其他物理损伤。超声和挤压，或与皂甙渗透，已被证明在高负载效率稳定的ev改造。电穿孔专门应用电场以在ev的膜上暂时形成孔隙，从而允许活性物质进入ev的内腔。电穿孔也可以诱导囊泡聚集，从而影响囊泡的完整性。本领域技术人员可以选择包括ev源和浓度、货物分子(负载)和随时间的施加电压在内的多个参数以实现货物的最佳负载。电穿孔后可方便得负载ev。研究表明，与无ev药物或载药脂质体相比，化疗药物的疗效增强，不良反应减少。ev是各种核酸分子(如mrna、mirna和各种非编码rna或dna分子)的天然载体，因此是核酸转移的合适载体。尽管核酸分子是调控感兴趣基因的有效手段，但其在循环中的低稳定性和可转导性决定了需要载体来保护这些治疗分子并将其传递给靶细胞和组织。同样，可以进行电穿孔以将材料加载到ev中。超声处理可以作为一种合适的替代方法，以最小的聚集和降解活性负载分子。本领域存在在ev释放之前给供体(来源)细胞预载药物的不同方法。例如，活性物质可从宿主细胞，特别是过度表达所需蛋白质或细胞代谢物的重组宿主细胞并入到ev中。如本发明所述，除了编码结合靶结合位点的表面蛋白的基因之外，还可以从转染有异源基因的供体细胞中分离ev。由于负载可包含蛋白质，因此由宿主细胞表达的重组蛋白质的负载可为负载ev的有吸引力的蛋白质递送模式。许多模型蛋白，包括卵清蛋白、过氧化氢酶、胶质细胞源性神经营养因子(gdnf)已经成功地从基因修饰的宿主细胞中负载到ev中。如本发明所述的靶特异性ev的使用代表了下一代药物递送系统，其能够横穿复杂的生物屏障，例如血脑屏障，同时避免或克服与药物或载体相关的许多安全问题，例如细胞毒性，生物分布短，靶向给药效率低。循环稳定性差和/或对靶细胞转化率低的化学药物和生物分子可以有效地转移到靶细胞的细胞质中，而不发生核内体和溶酶体的降解。如本发明所述，可通过人工靶结合位点产生ev以靶向特定组织、细胞、人工表面或可溶性化合物。ev可以被设计成表达合适的表面蛋白和结合位点的结构。例如，表面蛋白可在源细胞中过度表达以在ev表面上使用源细胞中的合适重组表达系统来表达。人工靶结合位点在囊泡形成之前或之后工程化。例如，结合位点可如本发明所述在预定区域并入表面蛋白质内以包含例如环、螺旋和/或线性(肽)结构。在所述表面蛋白的所述至少两个遥端区内的特定靶接触表面或结合残基可原位产生，即当产生ev时，例如通过重组核酸分子的方法，例如采用诱变产生相应表面蛋白质中的点突变的源细胞的方法，和/或通过涉及生物、酶和/或化学反应的ev的进一步修饰。本发明所述的ev适宜地提供在包含隔离ev的ev制剂中。ev可具有某些特征，其可通过适当的质量控制措施来确定，如确定负载物的大小、密度、量和组成、靶结合亲和力和/或选择性、纯度等。在实施例部分中进一步描述质量控制的示例性方法。如本发明所使用的术语“囊泡外结构域”(缩写ed)被理解为包括当与ev附着或结合时位于ev的外表面(囊泡外表面)的蛋白结构域。然而，当从ev分离或从ev表面蛋白分离时，蛋白结构域也被称为ed。本发明中关于氨基酸序列或核苷酸序列的元件所使用的术语“侧连”或“侧连的”在本发明中理解为：当第一序列元件位于紧邻第二序列元件的位置时，第一序列元件被第二序列元件称为“侧连”，从而提供所述第一和第二序列的连续序列。线性第一序列元素可以仅在其一个末端或在两个末端(即在一侧或两侧)由另一个元素侧连。在本发明所描述的ted中，修饰区与两个侧连序列特异性侧连，一个在其n-末端，一个在其c-末端。因此，这种修饰区位于侧连序列之间，也被称为“嵌入”本发明所用术语“宿主细胞”应指经转化以产生特定重组蛋白(例如本发明所述表面蛋白)或产生本发明所述ev的原代受试细胞及其任何后代。应该理解的是，并非所有的子代都与亲本细胞完全相同(由于环境中有意或无意的突变或差异)，但是，只要子代保留与最初转化细胞相同的功能，这些术语中就包括这些改变的子代。术语“宿主细胞系”是指用于表达重组基因以产生重组多肽或蛋白质的宿主细胞的细胞系。本发明所使用的术语“细胞系”指已建立的特定细胞类型的克隆，其已获得在较长时间内增殖的能力。这种宿主细胞或宿主细胞系可维持在细胞培养中和/或培养以产生重组多肽。本发明中关于ed修饰区使用的术语“分离的”或“分离”应指由修饰区的氨基酸序列组成的肽，该修饰区的氨基酸序列已与ed的侧连序列充分分离，以便以“基本纯的”形式存在。“分离”并不一定意味着排除人工或合成肽，或此类肽与其他化合物或材料的混合物，或不干扰基本结合活性的杂质的存在，例如，由于不完全纯化而可能存在的杂质。术语“分离的”也意味着包括那些化学合成的。特别地，与分别包含在(未从)ted和tsp中的相同修饰区相比，修饰区可从如本发明所述的ted中分离，或从如本发明所述的tsp中分离，或作为各自的分离肽提供以用于比较其结合特性，如靶结合亲和力和/或特异性。本发明中关于本发明所述ev所使用的术语“分离的”或“分离”应指已经与自然与其相关联的环境充分分离的囊泡，以便以“基本纯的”形式存在。“分离的”并不一定意味着排除与其他化合物或材料的人工或合成混合物，或不干扰基本活性的杂质的存在，例如，由于不完全纯化而可能存在的杂质。特别地，如本发明所述的分离的ev还意味着包括那些化学合成的ev。关于多肽或蛋白质，如本发明所述的ev表面蛋白，术语“分离的”应具体地指不含或基本上不含与其天然相关的物质的化合物，例如在其自然环境中发现的其他化合物，或在其自然环境中发现的环境当通过在体外或体内实践的重组dna技术来制备它们时(例如细胞培养物)。如本发明所述的关于本发明所述的结合物的“文库”，特别是本发明所述的ted、tsp或tev，被理解为包含结合物库，所述结合物库包括涵盖特定种类的结合物的多个不同目标结合物种(文库成员)。文库通常包括通过其功能结合来区分的文库成员，因此可以根据所需的结合特性来选择。本发明所述的ted文库具体地包括一组或一集合ted，特别是本发明所述的tev，每个tev具有嵌入在相同野生型ed的相同野生型序列中的不同修饰区。本发明所述的tsp文库具体地包括一组或一集合tsp，特别是本发明所述的tsp，每个tsp具有嵌入在相同野生型ev表面蛋白的相同野生型序列中的不同ted。tsp文库可以包括ed文库，例如ted文库。通过诱变ed或ev表面蛋白，从而分别产生ed和ev表面蛋白突变体库(作为可溶性蛋白或在ev表面上)，适当地产生ed文库。本发明所述的tev文库具体地包括一组或一集合tev，尤其是本发明所述的tev，每一个tev都具有不同的ted，其嵌入与囊泡膜结合的相同野生型ev表面蛋白的相同野生型序列中。tev文库可包含表面蛋白文库，如tsp文库。文库可以通过众所周知的技术构建，包括适当的诱变方法，例如，表面蛋白囊泡外结构域的定点诱变。如本发明所述的文库优选地包括至少102个文库成员，更优选至少103个文库成员，更优选至少104个文库成员，更优选至少105个文库成员，更优选至少106个文库成员，更优选至少107个文库成员，更优选至少108个文库成员，更优选至少109个文库成员，更优选至少1010个文库成员，更优选至少1011个文库成员，最多1012个成员的库。具体地，文库包括至少102、103、104、105或106个文库成员，其中每个文库成员在所述修饰表面蛋白的序列中的至少一个核苷酸上不同。具体地，文库包括至少106个库成员，其中每个库成员具有不同的靶结合位点或特异性。任何蛋白质或基因多样性文库可用于本发明所述的目的，其例如包括大量单个文库成员，以创建序列的多样性，或使用预选文库，其例如富含稳定或功能活性文库成员。例如，展示系统可将给定蛋白质(本发明所述的表面蛋白)与其编码核酸(例如其编码mrna、cdna或基因)耦合。因此，文库的每个成员包含编码在其上展示的修饰表面蛋白的核酸。展示系统包括但不限于细胞、病毒(如噬菌体)、核糖体、真核细胞(如酵母)、dna(包括质粒)和mrna展示。如本领域公知的，存在可用于鉴定和分离具有特定结合特性和亲和力的蛋白质的各种展示和选择技术，包括例如诸如细胞和非细胞方法的展示技术，特别是移动的展示系统。在细胞系统中，可使用噬菌体展示、病毒展示、酵母或其它真核细胞展示，例如哺乳动物或昆虫细胞展示。移动系统涉及可溶性展示系统，如体外展示系统，其中包括核糖体展示、mrna展示或核酸展示。本发明提供特定文库以展示表面蛋白的多样性和/或锚定到ev或细胞的表面蛋白的多样性。优选地，所述文库是噬菌体展示或酵母文库。具体地，酵母宿主细胞在酵母细胞表面展示本发明所述的表面蛋白。噬菌体和噬菌体展示系统是众所周知的多功能性和潜在的能力，以简化选择过程。酵母展示提供了许多吸引人的特性：真核生物的转录和翻译机制非常适合蛋白质的表达，流式细胞仪的使用允许使用支架配体对单个克隆进行实时高通量定量分析。酵母宿主细胞优选选自由以下物质组成的组：酵母菌属、毕赤酵母属、汉森努拉属、席齐酵母属、克鲁维酵母属、雅罗菌属和念珠菌属。最优选的宿主细胞是酿酒酵母。在某些情况下，展示本发明描述的表面蛋白的库，使得包括编码本发明所述表面蛋白的dna、rna或cdna的实体可以直接连接到其编码的表面蛋白，如rna或dna显示库中所述。在这种情况下，表面蛋白变体是通过对无细胞蛋白质合成方法的修改而产生的。根据本领域已知的方法，例如从噬菌体展示技术中筛选文库中的结合活性(或任何其他所需活性)。例如，固定在固相上的靶可用于鉴定和分离库的结合成员。筛选允许根据所需的特性选择库的成员。在选择靶的合适结合物的方法中，有利于在文库成员的库中提供大量的每种结合物的多样性，例如至少10个拷贝，以增加选择一种或多种候选结合序列的机会，该序列可进一步表征工程化靶特异性胞外囊泡构建体。可以通过任何适当的选择方法来筛选包含靶结合结构的文库成员的库。筛选步骤可包括一轮或多轮选择(也称为平移)。一轮或几轮选择包括例如1、2或优选3，并且可以包括4、5、6、7、8、9或10轮选择。特别地，这几轮的选择可包括在所述靶存在下文库，以便选择结合所述靶蛋白或其表位。本发明所用的“诱变”一词是指用于改变多核或多肽序列的任何经技术认可的技术。首选的诱变类型包括易出错的pcr诱变、饱和诱变或其他定点诱变。可以使用任何已知的诱变方法，例如通过随机化技术，在所需位置引入点突变。在某些情况下，随机选择位置，例如，任意可能的氨基酸或选择优选氨基酸来随机地随机选择抗体序列。本发明所用的“重组”一词应指“由基因工程制备或结果”。或者，使用“工程化的”一词。例如，表面蛋白可以通过工程化相应父序列来产生父序列的变体来变异。重组宿主具体包括重组表达载体或克隆载体，或已被基因工程化为包含重组核酸序列，特别是利用宿主外的核苷酸序列。重组蛋白是通过在宿主中表达相应的重组核酸而产生的。此处，特别理解“点突变”是工程化多核苷酸，其导致在某一位置(在一个位置)替换、删除或插入一种或多种氨基酸，而该氨基酸序列与非工程氨基酸序列不同氨基酸序列的位置。具体地，一种或多种氨基酸残基的单(非连续)或双倍可能受到点突变。具体优选的诱变方法提供在选定位置的点突变，优选地，在一个(预定)氨基酸位置或仅在预定氨基酸位置上由另一个氨基酸替代一个氨基酸。一种或多种点突变可以在一个修改区内，特别是在该区域内非连续或连续位置的点突变。本发明所用的术语“库”指的是一组变体，例如具有多种特异性的修饰表面蛋白的变体，以与高亲和力的靶结合。通常，表面蛋白的结构，包括具有螺旋和环区的胞外区域，在这种库中是相同的。该品种将具体反映包括在一种或多种预定位置或待修改区内的结合残基的结合位点的多样性，例如，至少两个远端区域是同一靶结合位点的一部分，以具体识别和结合靶。如本发明所述的库在文库中具体提供，文库是异质表面蛋白、靶特异性细胞外囊泡构建物或靶的混合物。所述文库可以采取蛋白质或ev的简单混合物的形式，或者可以采取相应结合区域的形式，例如修饰的表面蛋白质，或者作为分离的多肽或蛋白质，或者作为编码所述多肽或蛋白质的核酸，或者甚至是表达所述核酸的生物体或细胞，例如细菌，病毒、动物或植物细胞等，用核酸文库转化，反映所述库的多种靶特异性结合物。本发明所使用的术语“受试者”应指温血哺乳动物，尤其是人或非人动物。因此，术语“受试者”还可以特别指动物，包括狗、猫、兔子、马、牛、猪和家禽。特别地，如本发明所述的抗体被提供用于医疗用途以治疗需要预防或治疗疾病状况的个体或患者。术语“患者”包括接受预防性或治疗性治疗的人类和其他哺乳动物受试者。因此，“治疗”一词意味着包括预防性治疗和治疗性治疗。包括本发明所使用的“表面蛋白”的术语“ev表面蛋白”是指位于ev表面上或处的蛋白质，其锚定在ev的脂质双层膜内。为此，“锚定”在此理解为通过融合到位于膜内的蛋白结构域而结合到细胞表面。本发明理解的表面蛋白包含至少一个ed和至少一个跨膜结构域。通过将所述至少一个跨膜蛋白结构域整合到ev的膜上，可将所述表面蛋白结合到ev。跨膜结构域可以是表面蛋白的一部分，或者例如为了将表面蛋白质锚定到ev而融合到表面蛋白质。术语“ev表面蛋白”具体包括“外泌体蛋白”和ev的那些可用于将多肽或蛋白质构建体运输到合适的囊泡结构或ev的蛋白质。具体地，该术语包括能够将多肽或蛋白质构建体输送、运输或穿梭到囊泡结构(如ev)的任何蛋白醇。此类ev表面蛋白的示例为例如分离、合成和/或重组氨基酸序列，其全部或部分(作为片段)包含本发明所述的一种或多种类型的ev表面蛋白，例如由本发明所提供的序列(尤其是图1中所提供的序列)所识别(不包括信号序列，如果有的话)，或其异构体，包括克隆的异构体。示例性ev表面蛋白为：a)四跨模样蛋白，包括i)四跨膜蛋白，例如，由cd81(如人cd81，seqidno87)、cd9(如人cd9，seqidno89)、cd53(如人cd53，seqidno90)、tspan32(如人tspan32，seqidno91)、cd82(如人cd82，seqidno92)、cd63(如人cd63，seqidno93)、cd151(如人cd151，seqidno94)、cd37(如人cd37，seqidno：95)、tspan8(如人tspan8，seqidno：184)、tspan14(如人tspan14，seqidno：185)或cd231(seqidno：tspan7)(如人cd231(seqidno：186)中的任意一个；或ii)溶酶体相关膜蛋白，例如lamp2(如人lamp2，seqidno：96)；b)整合素家族的蛋白质，例如cd49d(如人cd49d，seqidno：187)、itgb5(如人itgb5，seqidno：188)、itgb6(如人itgb6，seqidno：189)、itgb7(如人itgb7，seqidno：190)、cd71(如人cd71，seqidno：191)、cd29(如人cd29，seqidno：249)；c)蛋白聚糖，例如cd138(syndecan-1)(如人cd138(syndecan-1)，seqidno192)，syndecan-2(如人syndecan-2，seqidno193)，syndecan-3(如人syndecan-3，seqidno194)，syndecan-4(如人syndecan-4，seqidno195)，hspg2(如人hspg2，seqidno196)；d)五跨膜结构域蛋白家族，例如cd133(如人cd133，seqidno：195)；e)i型跨膜蛋白，例如(如人cd50，seqidno：196)、cd102(如人cd102，seqidno：197)；f)notch家族(如人notch1，seqidno：198)、notch2(如人notch2，seqidno：199)、notch3(如人notch3，seqidno：200)、notch4(如人notch4，seqidno：201)、dll1(如人dll1，seqidno：202)、dll4(如人dll4，seqidno：203)、jag1(如人jag1，seqidno：204)，jag2(如人jag2，seqidno205)、cd11a(如人cd11a，seqidno206)、cd11b(如人cd11b，seqidno207)、cd11c(如人cd11c，seqidno208)、cd18/itgb2(如人cd18/itgb2，seqidno209)、cd41(如人cd41，seqidno210)、cd51(如人cd51，seqidno211)、cd61(如人cd61，seqidno：212)，cd104(如人cd104，seqidno：213)；g)具有酶活性的膜蛋白(酶tm蛋白)，例如cd13(如人cd13、seqidno：214)、cd73(如人cd73、seqidno：：247)；h)免疫调节性表面蛋白，包括例如fc受体、t细胞受体、补体受体、白细胞介素受体、免疫球蛋白、mhci或mhc-ii组分；示例性蛋白质为cd2(如人cd2，seqidno：215)、cd3ε(如人cd3ε，seqidno：216)、cd3ζ(如人cd3ζ，seqidno：217)、cd18(如人cd18，seqidno218)、cd19(如人cd19，seqidno219)、cd30(如人cd30，seqidno220)、cd34(如人cd34，seqidno221)、cd36(如人cd36，seqidno222)、cd40(如人cd40，seqidno223)、cd40l(如人cd40l，seqidno224)、cd44(如人cd44，seqidno225)，cd45(如人cd45，seqidno226)，cd47(如人cd47，seqidno227)，cd86(如人cd86，seqidno228)，cd110(如人cd110，seqidno229)，cd111(如人cd111，seqidno230)，cd115(如人cd115，seqidno231)，cd117(如人cd117，seqidno232)，cd125(如人cd125，seqidno233)，cd135(如人cd135，seqidno234)，cd184(如人cd184，seqidno235)，cd200(如人cd200，seqidno236)，cd279(如人cd279，seqidno237)，cd273(如人cd273，seqidno238)，cd274(如人cd274，seqidno239)，cd362＝syndecan-2(如人，seqidno：193)，egfr(如人egfr，seqidno：240)、l1cam(如人l1cam，seqidno：241)、lfa-1(如人lfa-1，seqidno：242)、lgals3bp(如人lgals3bp，seqidno：243)、mfge8(如人mfge8，seqidno：244)、sllt2(如人sllt2，seqidno：245)、stx3(如人stx3，seqidno：246)；i)间充质干细胞的表面标记物，例如cd44(如人cd44，seqidno：225)、cd45(如人cd45，seqidno：226)、cd71(如人cd71，seqidno：191)、cd73(如人cd73，seqidno：247)、cd90(如人cd90，seqidno：248)、cd29(如人cd29，seqidno：249)、cd105(如人cd105，seqidno：250)，cd106(如人cd106，seqidno：251)、cd146(如人cd146，seqidno：252)、cd164(如人cd164，seqidno：253)、cd166(如人cd166，seqidno：254)、stro-1(如人stro-1，seqidno：255)；j)糖蛋白，例如cd54(如人cd54，seqidno：256)、cd235a(如人cd235a，seqidno：257)、cd106(如人cd106，seqidno：251)；k)通道蛋白，包括钙通道蛋白，例如glur2(如人glur2，seqidno：258)、glur3(如人glur3，seqidno：259)、hla-dm(如人hla-dm，seqidno：260)；或l)其他外泌体(囊泡)表面蛋白，例如flot2(如人flot2，seqidno：261)。进一步其他ev表面蛋白选自具有可变氨基酸序列的tcra、tcrb、tcrd、tcrg和t细胞受体(t细胞受体位点)，本领域技术人员可基于本发明提供的信息或从相应的数据库(例如)容易地鉴定合适的ev表面蛋白，提供了人ev表面蛋白(包括包含至少一个ed或tm的片段，或此类ev表面蛋白的亚型)或非人动物的同源物或类似物的基因组位点和氨基酸序列的数据库。具体地，ev表面蛋白包含三级结构，其包含具有环、螺旋和/或线性(肽)结构的区域，尤其是如针对cd81所述的四跨样三级结构，其包括至少一个大环和一种或多种螺旋区域。这种三级结构可以被适当地设计成包含在三级结构的远端区中的接触点的人工结合位点。在某些情况下，表面蛋白通过连接体锚定在细胞外囊泡的脂质双层膜上。这种连接体可以例如是氨基酸连接体、基于亲水性和非带电聚合物(例如聚乙二醇(peg)和多糖)的连接体，或者由两性离子聚合物组成，同时包含阳离子和阴离子基团。特定的表面蛋白起源于哺乳动物，特别是那些天然存在于包括人类或非人类哺乳动物的物种中的蛋白质，例如温血动物，特别是狗、猫、兔子、马、牛、猪和家禽。本发明所使用的术语“跨膜结构域”是指跨越脂膜的蛋白结构域，其通常是疏水的。具体地，表面蛋白包含至少两个跨膜结构域，跨膜结构域将囊泡外环锚定到ev。四跨膜蛋白通常包含四个跨膜结构域。跨膜结构域在与ev附着或结合时通常位于ev的膜内。然而，当从ev分离或从ev表面蛋白分离时，蛋白结构域也称为跨膜结构域。“四跨膜蛋白”也称为“四跨”或“四跨蛋白质”，在此理解为跨膜4超家族的蛋白质，一种蛋白质超家族，通过形成簇并与多种跨膜和胞浆信号蛋白相互作用来组织膜微区，称为四跨膜蛋白富集微区(也称为“四跨膜蛋白超家族”)。四跨膜蛋白是典型的细胞表面蛋白，其特征是存在四个疏水性跨膜结构域。天然存在的四跨膜蛋白蛋白介导的信号转导事件，发挥了调节细胞发育、活化、生长和运动的作用。本发明所理解的四跨膜蛋白通常由囊泡外结构域(也称为囊泡外结构域，ed)、跨膜结构域和血管内结构域组成。例如，四跨膜蛋白的n端和c端通常位于ev内，而跨膜结构域位于脂质双层膜内，囊泡外结构域位于ev的外表面。四跨膜蛋白的具体示例被糖基化。胞外(囊泡外)结构域，也被称为囊泡外结构域，ed，是四跨膜蛋白中最可变的区域，可以参与结合靶点。ec1(第一细胞外环)也称为小细胞外环(sel)。用cd81lel作为所有四跨膜蛋白的模型蛋白，研究了四跨膜蛋白的ec2(“大细胞外环”，lel)。lel结构域分为一个恒定区域，具有保守的a、b和e螺旋，建议通过疏水表面介导同源二聚，以及一个可变区域，螺旋c和d位于负责蛋白质-蛋白质相互作用的序列的两侧。具体地，ec2包含至少两个形成二硫键的保守半胱氨酸残基，用于ec2折叠(ccg基序)，一个靠近存在于所有四跨膜蛋白中的跨膜4的半胱氨酸残基，以及大多数四跨膜蛋白中的pro–xaa–xaa–cys(pxxc，seqidno：183，其中x可以是任何氨基酸)基序。在这些四跨膜蛋白中，cd9、cd63、cd81、cd82和cd151具有广泛的组织分布，而其他的仅限于特定组织，例如造血细胞中的tssc6、cd37和cd53。免疫电镜研究表明，四跨膜蛋白在各种类型的内吞膜上都有丰富的表达，已被广泛用作外泌体标记物。四跨膜蛋白cd81是多囊泡外泌体部分富集的主要蛋白。人cd81包含鉴定为seqidno：87的氨基酸序列(鉴定为seqidno：88的编码序列)或由其组成。cd81的大细胞外环位于跨膜结构域3和4之间，由五个螺旋元件组成，形成蘑菇状结构，由两对半胱氨酸稳定。该基序在四跨膜蛋白家族的蛋白质成员中是保守的，并且半胱氨酸键的氧化例如涉及到丙型肝炎病毒(hcv)的e2包膜蛋白的高亲和力结合，hcv是cd81的天然配体。四跨膜蛋白可表达为可溶性蛋白，或展示在表达细胞或相应ev的四跨膜蛋白的表面。在处解析的hcd81lel的晶体结构揭示了一种新的蛋白质折叠类型，随后对160个四跨膜蛋白家族成员的序列分析表明其折叠和关键结构特征是保守的。除了半胱氨酸桥之外，hcd81lel还可以通过固定残基gly157和pro176来稳定，这两个残基位于半胱氨酸连接处，以及tyr127，tyr127被完全掩埋并与his151和cys190一起构成氢键网络。可溶性hcd81-lel可以围绕一个2倍轴组装成二聚体，并且原聚体之间的接触是每个相互作用伙伴的螺旋之间以及相反原聚体的螺旋b和c末端残基之间的低极性区域。原生质体的n-和c-末端位于组装的二聚体的相对面上的中心区域，类似于细胞表面的二聚体组装，其中也存在跨膜片段。第二个低极性区域包括螺旋c和d的溶剂暴露表面。根据溶液研究，螺旋d是相当无结构的，只有在与某些抗原结合时才能获得螺旋构象。四跨膜蛋白家族成员的序列比对确实显示该区域的变异性增加，包括插入和删除。有人认为，这一表面积可能参与了一个物种或四聚体在特定的识别过程，这可能暗示了异二聚体四聚体在物种组装中的可能性。特别地，cd81的d段可以指导特定的同源聚类。根据一个具体的实施方案，通过引入从头对半胱氨酸残基以形成稳定蛋白质的新颖二硫键来改善像cd81的四跨膜蛋白的生物物理性质。具体地，新的二硫键的形成增加了像cd81这样的四跨膜蛋白的稳定性，这允许产生具有更高稳定性的突变体，例如，包含一种或多种修饰区域的突变体或包含所述一种或多种修饰区域内的结合残基的新的靶特异性结合位点。具体地，可以通过靶向或随机诱变来修饰氨基酸序列，以在构成结合位点的预定位置或区域并入(尤其是通过取代)结合残基，或者生成包含多种结合位点的文库，所述结合位点包括结合残基。与cd81类似，四跨膜蛋白cd9是一种细胞表面蛋白，包含四个疏水跨膜结构域和两个胞外结构域eds(如包含ec1和ec2或由其组成)。天然存在的cd9由228个氨基酸组成，重24-27kda。四个小的且高度保守的疏水跨膜结构域各自包含24-27个氨基酸。它有一个小的n端(11个氨基酸)和一个c端细胞质(7个氨基酸)尾以及一个非常小的胞内结构域(4个氨基酸)。蛋白质的其余部分由两个胞外结构域组成(一个小的，由20个氨基酸组成的ec1和一个大的，由83个氨基酸组成的ec2)。由四个高度保守的半胱氨酸残基(c)产生的两个二硫键稳定了大的胞外结构域(ec2)。cd9还包含一个四跨膜蛋白特征(氨基酸65-89)和一个ccg基序(氨基酸152-154)。cd9是外泌体表面表达最广泛的蛋白质之一，因此被认为是外泌体的标记。尽管细胞外环中的氨基酸序列存在差异，但cd9蛋白序列在物种之间非常保守(人、小鼠和大鼠之间为90％)。cd9与其他四跨膜蛋白蛋白也有一些同源性，特别是在跨膜结构域中。野生型cd9可与许多其他蛋白质相互作用或形成复合物，包括其他四磷酸蛋白、整合素、ewi分子、tgf-a、白喉毒素受体或酪氨酸激酶、妊娠特异性糖蛋白、免疫系统蛋白(如mhcii类分子和ig超家族成员)。cd9参与血小板活化和聚集，参与细胞粘附、扩散、细胞运动和肿瘤转移。cd9还调节了副侧连接的形成，并且需要配子融合。此外，cd9促进肌肉细胞融合，支持肌管的维持。如本发明所述，四跨膜蛋白cd63是一种高糖基化的蛋白细胞表面蛋白，包含四个跨膜结构域和三个推测的n-糖基化位点。野生型cd63通常存在于晚期内胚乳体、溶酶体、分泌囊泡和质膜中，并在这些腔室之间移动。cd63广泛且可变糖基化，其ec2区域包含三个潜在的n-连锁糖基化位点(n130、n150和n172)。它通常被用作多泡体的标记物，这些体富含cd63。它有许多天然的相互作用伙伴，包括其他四磷酸蛋白，如cd82；mhcii类分子hla-dr、hla-dm和hla-do；若干整合素；磷脂酰肌醇4-激酶。cd63还包含一个基于酪氨酸的基序，其极端c端。酪氨酸基基基基模体在膜蛋白胞质结构域中被克拉三酯接头复合体识别，在细胞内吞、溶酶体靶向和基底外侧靶向等方面起着重要作用。cd63中酪氨酸基基基介导了其与适配器蛋白复合体2和3(ap-2和ap-3)μ亚基的相互作用。如本发明所述，四跨膜蛋白cd151具有四跨膜蛋白的特征结构。它是一种253个氨基酸的蛋白质，在其lel中有一个n-糖基化位点，并在几个半胱氨酸残基上进行棕榈酰化。免疫印迹显示一对明显的kda28和32条带，代表cd151的非糖基化和糖基化形式。人cd151包含鉴定为seqidno：94的氨基酸序列或由其组成。野生型cd151具有广泛的细胞和组织分布，包括上皮、内皮、肌肉、肾小球、近端和远端小管、雪旺细胞和树突状细胞，在大多数成人组织中观察到单个rna物种。cd151在血小板和巨核细胞上高水平表达。与其他四跨膜蛋白一样，cd151在细胞膜中与几个整合素相关。虽然所有的免疫细胞都表达四跨膜蛋白，但这些四跨膜蛋白大多存在于多种其他类型的细胞中。在造血谱系中发现的有cd37、cd53、tspan32(tssc6)和tspan33等。如本发明所述，四跨膜蛋白cd37是具有已知与整合素和其他跨膜4超家族蛋白复合的四跨膜蛋白的典型结构的细胞表面糖蛋白。交替剪接导致编码不同异构体的多个转录变体。人cd37包含鉴定为seqidno：95的氨基酸序列或由其组成。已知cd37在免疫系统细胞中表达，在成熟的b细胞中含量最高，在t细胞和髓细胞中表达较低。野生型cd37控制体液和细胞免疫反应。小鼠cd37缺乏导致b细胞淋巴瘤的自发发展，cd37阴性淋巴瘤患者的临床预后较差。如本发明所述，四跨膜蛋白cd53是跨越质膜四倍的泛白细胞表面糖蛋白，是跨膜4超家族的成员。通过分离小鼠cd53(cd53)的基因组克隆和cdna克隆，确定了cd53的蛋白质序列和基因结构。cd53在进化中高度保守，因为小鼠cd53与大鼠cd53的同源性为91％，与人cd53的同源性为82％。cd53四跨膜蛋白有四个跨膜结构域，在第二个细胞外环中被糖基化两次。它的长度为219个氨基酸，位于细胞膜、内体和外体的脂质双层膜中。人cd53包含鉴定为seqidno：90的氨基酸序列或由其组成。野生型cd53在几乎所有的免疫细胞、造血干细胞的一个亚群以及多种血液恶性肿瘤中都有表达。血小板中存在几种四跨膜蛋白，包括cd9、cd151、tssc6和cd63。最近在基因敲除小鼠模型中的研究表明，cd151和tssc6在生理和功能上参与调节主要血小板整合素、整合素α(iib)β(3)的“外-内”信号特性和体内血栓稳定性。如本发明所用，四跨膜蛋白tssc6，也称为tspan32，是四跨膜蛋白超家族的成员。这种蛋白质的大小为320个氨基酸，在低水平上普遍表达。tspan32的高水平表达通常局限于造血组织，包括外周血白细胞、胸腺和脾脏。人tspan32包含鉴定为seqidno：91的氨基酸序列或由其组成。如本发明所用，溶酶体相关膜蛋白2(lamp2)是溶酶体相关膜糖蛋白。lamp2是一种完整的膜蛋白，具有两个保守的管腔结构域(占整个蛋白质的90％)，一个跨膜结构域(约20个氨基酸)和一个短的(10-12个氨基酸)c末端胞质尾。糖基化存在于其管腔结构域。人类lamp2包含或由鉴定为seqidno：96的氨基酸序列组成。如本发明所用，lamp2优选地包括囊泡外环区域中的修饰以并入人工结合位点。野生型lamp2在伴侣介导的自噬中起着重要作用，自噬是一个介导蛋白质溶酶体降解的过程，以应对各种应激，并作为蛋白质正常转换的一部分，具有很长的生物半衰期。本发明中使用的术语“类四跨蛋白”(有时称为类四跨蛋白)应指包含至少两个跨膜结构域和位于所述至少两个跨膜结构域之间的至少一个ed的ev表面蛋白，优选地，其中所述至少两个跨膜结构域之间的区域包括一个ed或由其组成。四跨模样蛋白质的具体示例为天然存在或修饰的四跨膜蛋白和其它蛋白质，例如溶酶体相关膜糖蛋白(lamp)，或重组或合成蛋白，例如包含一种蛋白质的一种或多种跨膜域和另一种蛋白质的一种或多种ed的嵌合蛋白，从而获得重组四跨膜样蛋白。关于蛋白质序列及其突变体的“序列同一性”或“氨基酸序列同一性百分比(％)”定义为候选序列中与待比较的特定多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比(“父序列”)，在对齐序列并引入间隙后，如有必要，达到最大百分比序列同一性，并且不考虑任何保守替换作为序列同一性的一部分。本领域技术人员可确定用于测量对准的适当参数，包括在所比较序列的全长上实现最大对准所需的任何算法。如本发明所用，术语“特异性”、“靶向特异性”或“特异性结合”是指在异质分子群中确定相关同源配体的结合反应。因此，在指定的条件下(例如，免疫分析条件)，修饰的表面蛋白结合到其特定的靶点，并且不与样品中存在的其他分子大量结合。特异性结合意味着结合在目标身份、高、中或低结合亲和力或亲和力方面是选择性的。如果结合常数或结合动力学至少相差10倍，优选相差至少100倍，更优选相差至少1000倍，则通常实现选择性结合。特异性结合并不排除与相似抗原或不同物种(类似物)相同抗原的某些交叉反应。例如，结合实体也可优选地与类似于人类靶点的啮齿动物靶点交叉反应，以促进临床前动物研究。本发明所使用的术语“靶”尤其应包括能够被抗体结合位点识别的所有抗原和靶分子。本发明所述的表面蛋白工程化为包含人工靶结合位点，其特异性地识别与抗体相似的抗原结构或表位。特异性靶是细胞靶或可溶性靶。在许多情况下，靶是自身抗原，例如位于肿瘤细胞表面的受体，或可能存在于受试者或患者循环中的细胞因子或生长因子。其他靶可来自病原体，例如微生物或病毒病原体。所述靶抗原被识别为整个靶分子或所述分子的片段，尤其是亚结构，例如靶分子的多肽或碳水化合物结构，通常被称为“表位”，例如b细胞表位、t细胞表位)，其具有免疫相关性，即也可被天然或单克隆抗体识别。具体地，从细胞表面抗原中选择目标抗原，包括受体，特别是选自erbb受体酪氨酸激酶(例如egfr、her2包括her2neu、her3和her4)，特别是此类受体胞外域的表位，例如4d5表位)。此外，还可以靶向其他抗原，例如，肿瘤坏死因子受体超家族的分子，如apo-1受体、tnfr1、tnfr2、神经生长因子受体ngfr、cd40、cd40配体、ox40、taci、bcma、baff受体、t细胞表面分子、t细胞受体、t细胞抗原、apo-3、dr4、dr5、dr6、诱饵受体，如dcr1、dcr2、car1，hvem、gitr、ztnfr-5、ntr-1、tnfl1、igfr-1、c-met，但不限于这些分子、b细胞表面抗原，如cd10、cd19、cd20、cd21、cd22、dc标记物、实体肿瘤或血液癌细胞抗原或标记物、淋巴瘤或白血病细胞、包括血小板在内的其他血细胞，但不限于这些分子。此处使用的术语“治疗有效量”与化合物的任何术语“有效量”或“足够量”互换使用，例如，本发明所述的结合物，特别是本发明所述的tev，是足以当给受试者的效果带来有益或期望的结果，包括临床结果，以及有效量或同义词取决于应用该结果的上下文。有效量是指足以治疗、预防或抑制疾病或疾病的化合物的量。在疾病的背景下，本发明所述的治疗有效量结合物或tev被专门用于治疗、调制、衰减、逆转或影响因结合物或tev与其靶抗原(例如肿瘤细胞)相互作用而受益的疾病或病症。与该有效量相对应的化合物的数量将根据各种因素而变化，如给定的药物或化合物、药物配方、给药途径、疾病或疾病类型、被治疗对象或宿主的身份等，但是，可以由本领域的技术人员常规确定。本发明所述的结合物可具体用于药物组合物中。因此，提供了一种药物组合物，其包括本发明所述的结合物和药学上可接受的载体或赋形剂。这些药物组合物可适当地通过注射或输液或连续输注。除肠外给药外，可优先选择局部或口服给药。适合促进这种管理手段的药物载体是本领域公知的。药学上可接受的载体通常包括任何和所有合适的溶剂、佐剂、分散介质、涂层、等渗和吸收延迟剂等，以及类似物，这些药物与本发明提供的结合物在生理上兼容。药物上可接受载体的进一步实施例包括无菌水、盐水、磷酸盐缓冲盐、葡萄糖、甘油、乙醇等，以及其中任意一种的组合。适用于药学上可接受的载体或辅料，具体包括一种或多种常规溶剂、分散介质、填料、固体载体、水溶液、涂料、适用于局部用药的车辆、其他抗菌剂、等渗和吸收增强剂或延迟剂，或药物活性物质的活性增强剂或延缓剂。通过例如，在雷明顿中披露了常用的医药可接受添加剂：alfonsogennaro，20ed.，lippenottwilliams&wilkins(2000年)出版的《药学科学与实践》。在一个实施方案中，合适的药学上可接受的载体包括但不限于惰性固体填料或稀释剂和无菌水溶液或有机溶液(例如，聚乙二醇、丙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、乙醇、苯甲醇等)。在某些这样的实施方案中，合适的药学上可接受的赋形剂包括但不限于水、盐溶液、醇、聚乙二醇、明胶、乳糖、淀粉酶、硬脂酸镁、滑石粉、硅酸、粘性石蜡、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、填料，如糖(例如，乳糖、蔗糖、，甘露醇或山梨醇)和纤维素制剂(例如，玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄芩胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮、pvp)。在一个这样的方面中，结合物可与一种或多种适合于所需给药途径的载体组合，例如，与乳糖、蔗糖、淀粉、链烷酸纤维素酯、硬脂酸、滑石粉、硬脂酸镁、氧化镁、磷酸和硫酸的钠盐和钙盐、阿拉伯胶、明胶、，海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷、聚乙烯醇中一种混合，以及任选地进一步压片或封装以供常规施用。其他载体、佐剂和给药方式在制药领域是众所周知的。载体可包括受控释放材料或延时材料，例如单硬脂酸甘油酯或双硬脂酸甘油酯单独或与蜡或本领域公知的其他材料。其他药学上可接受的载体在本领域中是已知的并且在例如remington'spharmaceuticalsciences中描述。液体制剂可以是溶液、乳液或悬浮液，并且可以包括赋形剂，例如悬浮剂、增溶剂、表面活性剂、防腐剂和螯合剂。预期药物组合物，其中调配如本发明所述的结合物和一种或多种治疗活性剂。通过将所述具有所需纯度的结构与可选的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂以冻干制剂或水溶液的形式混合，制备本发明所述结合物的稳定制剂以供储存。用于体内给药的制剂优选无菌的，例如以无菌水溶液的形式。这可以通过无菌滤膜过滤或其他合适的灭菌方法来实现。可以多种方式施用包含本发明所述结合物的药物组合物，包括经腹腔内经口、皮下、静脉、鼻内、经皮、粘膜、局部(例如片剂、凝胶、软膏、药膏、栓剂、贴剂、洗剂、乳膏等)，肌肉内、肺内、阴道、肠外、直肠或眼内。在一个实施方案中，经口、静脉或吸入投与药物组合物。在具体实施方案中，以选自固体剂型、乳膏、水混合物、冻干水混合物和气溶胶的剂型施用结合物。用于肠外给药的示例性制剂包括适于皮下、肌肉内或静脉注射用制剂，例如无菌溶液、乳剂或悬浮液。本发明所述结合物可具体用于诊断组合物中，例如用于体外或体内用途。因此，提供一种诊断组合物，其包含如本发明所述的结合物，并且任选地包括组合物或零件套件中的诊断试剂。诊断试剂盒优选地包括用于定性或定量测定生物样品中目标的所有必需组分，任选地不含普通或非特异性物质或组分，例如水、缓冲液或赋形剂。可提供保质期优选为至少6个月、更优选为至少1年或2年的贮存稳定套件。它可以由干燥(例如冻干)成分组成，和/或包括防腐剂。提供优选的诊断试剂盒作为包装或预包装单元，例如，其中所述组件仅包含在一个包装中，这有助于常规实验。该包装可包括一种或多种试验所需的试剂，例如，适合于进行一系列生物样品的试验。试剂盒可进一步适当地包含标准或参考对照品。所述诊断组合物可以是在与所述生物样品的反应混合物中随时可用的试剂，或所述试剂的保存形式，例如冻干、速冻(例如在液氮中)、超低温储存(-70℃和-80℃)等储存稳定形式，冷藏(-20℃和5℃)和受控室温(15℃-27℃)；标准样品储存，例如甘油储备、组织石蜡块、(口腔)拭子和其他标准生物样品储存方法，可以重组或制备保存形式的试剂，以获得即用试剂。这种即用试剂通常是水溶液的形式，特别是(生理)缓冲条件(例如，edta缓冲液、磷酸盐缓冲液、hbss、柠檬酸盐缓冲液等)。具体地，其他诊断试剂是与结合物特异性反应的试剂和/或结合物与其靶结合的反应产物。适当的诊断试剂可以是溶剂、缓冲液、染料、抗凝剂、特异性结合到本发明所述结合物和/或结合物靶复合物的配体。具体地，本发明提供本发明所述结合物的诊断制剂，任选地包含具有标签的结合物和/或具有标签的另一种诊断试剂，例如专门识别结合物或结合物与相应靶的复合物的试剂，和/或固定至少一种的结合物的固相和诊断试剂。具体地，其他诊断试剂是诊断标签或与结合物和/或结合物与靶结合的反应产物特异反应的试剂。ev或诊断试剂可直接标记或间接标记。所述间接标记物可包括与所述结合物或诊断试剂形成络合物的标记结合物。标记通常是可以在分析中检测到的分子或分子的一部分。示例性标记是发色团、荧光染料或放射性分子。在一些实施例中，ev或诊断试剂与可检测标记结合，该可检测标记可包括自身可检测的分子(例如，荧光部分、电化学标记、金属螯合物等)以及可通过产生可检测反应产物间接检测的分子(例如。，酶，如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等)或通过自身可检测的特定结合分子(例如，生物素、地高辛、麦芽糖、寡组氨酸、2,4-二硝基苯、苯砷酸盐、ssdna、dsdna等)。优选的诊断制剂或分析方法包括本发明所述的固定在固相(例如乳胶珠、金颗粒等)上的ev。以下项目被认为是本发明的具体实施方案：1.一种靶向特异性胞外囊泡(ev)，包含锚定表面蛋白的脂质双层膜，所述表面蛋白包含特异识别靶的人工结合位点，其中所述结合位点包含所述表面蛋白的至少两个远端区域内的结合残基。2.根据项目1所述的ev，其中所述表面蛋白包含囊泡膜蛋白的跨膜结构域，所述跨膜结构域将所述表面蛋白锚定到ev。3.根据项目2所述的ev，其中所述膜蛋白为四跨膜蛋白，优选地选自cd81、cd9、cd37、cd53、cd63和cd82或lamp2。4.根据项目1至3中任一项所述的ev，其中所述表面蛋白为cd81且所述结合残基位于位置160和172之间的第一区域内、位于位置132和139之间或位置180和189之间的至少一个进一步区域内，其中所述cd81的编号被鉴定为seqidno：87。5.根据项目4所述的ev，其中所述表面蛋白是通过在允许形成一种或多种另外的二硫键的位置处引入一种或多种半胱氨酸来稳定的cd81，所述二硫键稳定蛋白质的囊泡外环结构。6.根据第1项至第5项中任何一项的所述ev，其来源于人体组织、体液或细胞培养物中的真核或原核源细胞。7.根据第1项至第6项中任一项所述的ev，其携带囊泡内负载，其中所述负载包含肽、多肽、蛋白结构域、蛋白质、脂质、基因、核酸(例如mrnas、mirnas)、rnai介导分子(尤其是锁定的核酸或硫代磷酸酯)、dna、dna片段、质粒如微环dna，药物如小分子中的任意一种或多种，质粒如微环dna，药物如小分子，特别是化疗药物或老年药。8.根据第1项至第7项中任一项所述的ev，其中所述靶选自细胞靶，所述细胞靶选自由以下物质组成的组：例如有丝分裂受体、细胞因子受体、唾液糖蛋白受体、膜转运蛋白、脂蛋白、脂糖、糖蛋白、蛋白聚糖或无细胞靶点例如细胞因子、人工蛋白或人工蛋白表面结构。9.一种药物制剂，其包含根据第1项至第8项中任一项所述的ev和药学上可接受的载体，优选用于皮内、皮下、静脉、局部或口服使用的制剂。10.一种生产根据第1项至第8项中任一项的所述ev的制剂的方法，包括：a)将编码表面蛋白的基因引入源细胞或源细胞混合物中；b)在产生胞外囊泡的条件下培养所述细胞；c)分离包含具有靶结合特异性的ev的部分；以及d)生产ev制剂。11.根据第10项所述的方法，其中，通过诱变方法修饰基因，以包含特异性识别靶的人工结合位点，其中所述诱变方法采用至少两个所述表面蛋白的至少两个远端区的诱变，由此产生编码多种表面蛋白的多核化合物，每个表面蛋白具有不同的结合特异性，并选择编码特异性识别靶的表面蛋白的多核苷酸。12.根据项目11所述的方法，其中多核苷酸库包含在基因包中，所述基因包在外表面展示有多种ted，优选地使用展示系统，所述展示系统选自由以下物质组成的组：酵母、噬菌体、细菌、核糖体、mrna或哺乳动物细胞展示的。13.根据项目10至12中的任一项生产的ev制剂，用于自体使用，其中源细胞或源细胞混合物从受试者处获得，并且ev制剂被施用于同一受试者。14.根据第10至12项中任何一项所述的方法，用于生产ev文库，其中a)将编码多种表面蛋白的基因库引入至所述源细胞中；以及b)分离ev库，每个ev具有不同的靶结合特异性，以产生包含具有多种靶结合特异性的靶结合ev文库，其中，该库是通过在所述基因的至少两个预定远端区域内诱变所述基因而产生的。15.一种由项目14所述的方法产生的ev文库，优选地，其中，该库包括至少102个具有不同目标特异性的ev。本发明描述的实施例是本发明的说明性实施例，并不打算对其进行限制。根据本发明描述了本发明的不同实施例。可以对本发明描述和图示的技术进行许多修改和变更，而不脱离本发明的精神和范围。因此，应当理解，这些实施例仅具有说明性，不限于本发明的范围。实施例实施例1：cd81lel的酵母展示将野生型人cd81-lel序列克隆为具有aga2的c末端融合蛋白，前接xpress标签，c端附加his标签和v5标签。cd81lel的氨基酸序列为(seqidno：7)：fvnkdqiakdvkqfydqalqqavvdddannakavvktfhetldccgsstltalttsvlknnlcpsgsniisnlfkedchqkiddlfsgk.编码核苷酸序列为(seqidno：8)：tttgtcaacaaggaccagatcgccaaggatgtgaagcagttctatgaccaggccctacagcaggccgtggtggatgatgacgccaacaacgccaaggctgtggtgaagaccttccacgagacgcttgactgctgtggctccagcacactgactgctttgaccacctcagtgctcaagaacaatttgtgtccctcgggcagcaacatcatcagcaacctcttcaaggaggactgccaccagaagatcgatgacctcttctccgggaag用于扩增人cd81lel的引物：(seqidno：9)：acgtggatcctttgtcaacaaggaccagatc(seqidno：10)：acgtgcggccgcgccttcccggagaagaggtc.pcr产物用bamhi和noti进行切割，并与相应的切割载体pyd1(thermofisherscience)连接。将结扎液转化为电致大肠杆菌top10，并在氨苄西林平板上筛选转化子。用微制剂分离质粒，化学转化为酿酒酵母eby100。将eby100(thermofisherscience)在20mlypd培养基(2％蛋白胨、1％酵母提取物、2％葡萄糖)(merck)中培养，在30℃和180rpm下过夜孵育。然后将培养物稀释至0.4的od600，在30℃和180rpm下孵育约5小时。然后在室温下，将50ml细胞培养液在1000g下造粒5min，然后用25mlad洗涤，然后再次进行造粒。细胞在3ml100mmli醋酸酯中重悬，在30℃下在摇动培养箱中孵育15分钟。然后将0.3ml细胞悬浮液颗粒化，并去除上清液。将转化混合物的成分添加如下：240μl50％peg3350、36μl1.0mli醋酸酯、50μl2mg/mlssdna(鲑鱼精子载体dna，先前加热至95℃5分钟，然后放在冰上)(sigmaaldrich)和1μgpyd1-cd81lel质粒。将细胞颗粒重悬在转化混合物中，在30℃下在摇动培养箱中孵育30min，然后在42℃下热休克45min。酵母细胞在1000g、5minrt下进行颗粒化、ad中重悬，并在30℃的mdl培养基上选择转化剂，持续3天。将转化剂接种到sd-caa(1％cas氨基酸(bectondickinson)、100mmk-磷酸盐缓冲液、ph6.0(merck)、1xynb(bectondickinson)、2％葡萄糖(merck))中，在30℃下过夜培养。用sg/r-caa培养基(1％cas氨基酸(bectondickinson)、100mmk-磷酸缓冲液、ph6.0(merck)、1xynb(bectondickinson)、2％在37℃或20℃下过夜，连续2天，检测半乳糖(默克)、1％棉籽苷(merck))。然后检测酵母培养物的表达。facs分析显示，显示水平与酵母转化类似，未经修饰的表达载体仅编码报告子标签。此外，用结构报告抗体m38和1.3.3.22(thermofisherscience)对野生型cd81lel显示酵母培养进行染色，结果显示与所检测的标记的表达水平相同。facs分析显示，20℃或37℃胁迫条件下诱导的培养物显示水平相似。标记的表达水平与仅编码标签的载体转化酵母的表达水平相似。此外，表达野生型cd81的酵母细胞用抗cd81抗体染色，与20℃诱导的细胞相似。实施例2：cd81lel的噬菌体展示将编码野生型cd81-lel的序列克隆到表达载体fdmyc的多克隆位点，该表达载体允许噬菌体颗粒的表达，重组蛋白n末端位于c-myc标签和g3p蛋白。用于扩增的引物是(seqidno：11)：acgagtgcacagtttgtcaacaaggaccagatc(seqidno：12)：acgtgcggccgccttcccggagaagaggtc.pcr产物用限制性内切酶apali和noti切割并连接到相应的切割载体fdmyc中。将连接混合物转化到大肠杆菌tg1细胞(thermofisherscientific)中，并在含四环素的tye平板(1.5％琼脂、1.6％蛋白胨、1％酵母提取物(merck))上选择。在含四环素的培养基中于30℃过夜培养，可获得高滴度的1011-1012噬菌体颗粒/l培养物，表明表达的蛋白对噬菌体增殖没有不利影响。用sds-page和westernblotting分析噬菌体颗粒，检测融合蛋白的表达水平。用抗g3p抗体(新英格兰生物实验室)检测显示的蛋白质，发现与野生型cd81lel的融合率为50％。cd81特异性抗体m38和1.3.3.22均能检测到噬菌体携带的cd81-lel，表明噬菌体展示分子的正确折叠。实施例3：可溶性cd81lel的表达用引物扩增cd81lel序列(seqidno：13)：acgtgctagctttgtcaacaaggaccagatc(seqidno：14)：acgtggatcctcatcacttcccggagaagaggtc.用限制性内切酶nhei和bamhi切割pcr片段，连接到用相同酶切割的载体ptt22ssp4(cnrc)上。将连接混合物转化为具有电活性的大肠杆菌top10(thermofisherscientific)中，并在氨苄青霉素平板上筛选转化子。按照制造商的说明，用微制剂分离质粒并将其转染到hek-293-6e细胞(cnrc)中。蛋白表达持续5天，添加tn-20至0.5％的终浓度。然后使用标准方案通过ni-nta色谱纯化hcd81-lel。上清液用pbs和20mm咪唑缓冲，ph调节至7.5。excel-ni-nta柱(ge-healthcare)用pbs和20mm咪唑(ph7.5)平衡，并装载缓冲上清液。洗脱采用5柱体积，线性梯度为20-500mm咪唑，ph7.5。将含有蛋白质的部分库集在一起，并在4℃下对100倍体积的pbs进行透析过夜。在自然条件下的sec分析揭示了对应于蛋白质二聚体形式的单分散洗脱曲线，类似于可溶性野生型cd81-lel。或者，完全按照制造商的说明，按照maxtiter方案在expicho表达系统(thermofisherscientific)中表达蛋白质。然后使用标准方案通过ni-nta色谱纯化hcd81-lel。上清液用等体积的ad稀释，用pbs和20mm咪唑缓冲，ph调节至7.5。excel-ni-nta柱(ge-healthcare)用pbs和20mm咪唑(ph7.5)平衡，并装载缓冲上清液。洗脱采用5柱体积，线性梯度为20-500mm咪唑，ph7.5。将含有蛋白质的组分库集在一起，并在4℃下对100倍体积的pbs进行透析过夜。实施例4：cd81文库1的构建构建了cd81lel突变体的酵母展示文库，随机抽取cd81lel的c段和d段共12个氨基酸残基。随机分配氨基酸残基：160-162和181-189(编号为1g8q)。酵母展示文库的大小为7x107个独立成员。用寡核苷酸制备用于重组的pcr片段。(seqidno：15)：cttccacgagacgcttgactgctgtggatccnnknnknnkactgctttgaccacctc，其中n为a、c、g或t中的任意一个。(seqidno：16)：ccgcgccttcccggagaagaggtcatcgatcttctggtggcaakmmnnmnnmnnmnnmnnmnnmnnmnngttgctgcccgagggac，其中n为a、c、g或t中的任意一个；以及m是a或c中的任意一个。采用q5-hifi聚合酶(新英格兰biolans)经凝胶电泳后纯化。为了便于pcr片段的重组，对受体载体进行了修饰。所有诱变步骤均使用quikchangelightning诱变试剂盒(安捷伦)进行，完全按照制造商的说明进行。用寡核苷酸将一个bamhi位点引入pyd1\u-cd81-lel中(seqidno：17)：gcttgactgctgtggatccagcacactgactg(seqidno：18)：cagtcagtgtgctggatccacagcagtcaagc，然后用寡核苷酸去除天然存在的bamhi位点(seqidno：19)：cgataaggtaccaggttcctttgtcaacaag(seqidno：20)：cttgttgacaaaggaacctggtaccttatcg.用bamhi和clai对载体进行线性化，并从琼脂糖凝胶中纯化载体骨架。采用化学转化法将pcr片段和载体骨架导入酿酒酵母eby100。eby100在20mlypd培养基中的发酵剂培养物在30℃和180rpm下培养过夜。然后将培养物稀释至od600＝0.4，并在30℃和180rpm下培养约5小时。然后在室温下将50ml细胞培养物的小份在1000g下造粒5分钟，然后用25mlad洗涤并再次造粒。将细胞重悬在3ml100mm醋酸锂中，并在30℃的摇动培养箱中培养15分钟。细胞被颗粒化并去除上清液。按如下方式添加转化混合物的组分：2400μl50％peg3350、360μl1.0m醋酸锂、500μl2mg/mlssdna(鲑鱼精子载体dna，先前加热至95℃5分钟，然后置于冰上)、10μg线性化受体载体和7μgdna片段。细胞颗粒在转化混合物中重悬，并在振荡培养箱中在30℃下培养30分钟，并在42℃下热休克45分钟。通过在室温下以1000g离心5min收集细胞并去除上清液后，将颗粒重悬在10mlsd-caa培养基(1％氨基酸(becton-dickinson)、100mmk-磷酸盐缓冲液、ph6.0(默克)、1xnb(becton-dickinson)、2％葡萄糖(默克)中。取小份进行稀释平板以确定文库大小：10μl细胞悬浮液在990μlsd-caa培养基中稀释，其中100μl细胞悬浮液在mdl平板(1.5％琼脂(merck)、1xynb(becton-dickinson)、2％葡萄糖(merck)和0.01％亮氨酸(sigma-aldrich))上平板，并在30℃下孵育3天。酵母细胞在50mlsd-caa培养基中稀释，在30℃下以180rpm孵育24小时，以1：20稀释度传至新鲜sd-caa培养基中，在相同条件下再培养24小时。在1000g，5min，4℃条件下收获细胞，在-80℃条件下冷冻前，将颗粒重新悬浮在等体积的30％甘油中。实施例5：用小鼠egfr-fc筛选cd81-lel文库1小鼠egfr-fc购自中国生物。对于生物素化，ez-linktm磺基nhslc生物素试剂以3：1摩尔比使用。完全按照制造商的说明将抗原复溶至0.25μg/μl的浓度。在室温下用生物素化试剂进行1h的摇动培养。使用snakeskin透析管(thermofisherscientific)和10.000damwco，在4℃下搅拌过夜，用100倍体积的pbs透析去除未结合的生物素。为了筛选，将文库接种到sd-caa中并在30℃下过夜培养。在37℃下用sg/r-caa培养基过夜诱导。将诱导的细胞悬浮液稀释至每1ml10％bsa-pbs108个细胞，并在20℃下以1000g离心5分钟。为了阻断细胞，将微丸重新悬浮在1ml10％bsa-pbs中并培养30分钟在20℃的旋转平台上最小。细胞在20℃下以3000rpm离心5分钟，并在250μl10％bsa-pbs(含1μm生物素化egfrfc)中再悬浮。在室温下在旋转平台上培养30分钟后，将细胞在4℃下以3000rpm离心5分钟。为了洗涤细胞，将颗粒重新悬浮在1ml冰冷pbs中，并在4℃下以1000g离心5分钟。然后，将细胞重新悬浮在250μl10％bsa-pbs中，使用链霉亲和素alexafluor647(1：800)和抗肿瘤药物v5fitc抗体(1：100)(thermofisherscientific)并在冰上培养30分钟。细胞在4℃下以3000rpm离心5分钟，然后再悬浮在1ml冰冷pbs中并再次离心。最后，将细胞重新悬浮在250μl冰冷pbs中，并保持在冰上，直到用facsariatm进行分类。第1类收集了2.5倍的文库大小和1％的假阳性酵母细胞，第2类处理了第1类20倍的产量，繁殖了0.1％的假阳性酵母细胞。在接下来的两轮分选中，至少处理了前一次分选的100倍产量，再次收集0.1％的酵母细胞，并在第四次分选后，进行单酵母展示克隆的鉴定。用小鼠egfr-fc染色筛选23个克隆，除9、10和23个克隆用抗原染色明显外，其余克隆均用二级试剂链霉亲和素alexafuro647染色。表1显示酵母克隆的中位荧光，展示了用抗原小鼠egfrfc和二级试剂链霉亲和素alexafluor647或仅用二级试剂链霉亲和素alexafluor647展示选定的cd81lel变体。酵母克隆仅第二抗原+第二115.6933.12212.8122.36312.4923.39412.4216.48516.9634.12611.3924.678.8418.65816.1451.32914.5911.761013.9616.181119.6736.521225.8756.931321.3647.541419.8526.231516.9343.681614.6126.191718.5621.221816.6757.941916.7220.572015.6713.242110.0833.692214.0318.582320.2715.97野生型cd81lel28.279.1测序后，鉴定出6个不同的序列(表2)。表2显示了鉴定的的序列。实施例6：用人egfr-fc筛选cd81文库1人表皮生长因子fc购自sino生物。对于生物素化，ez-linktm磺基nhslc生物素试剂以3：1摩尔比使用。完全按照制造商的说明将抗原重组至0.25μg/μl的浓度。在室温下用生物素化试剂进行1h的摇动培养。使用snakeskin透析管(thermofisherscientific)和10.000damwco，在4℃下搅拌过夜，用100倍体积的pbs透析去除未结合的生物素。为了分类，文库首先在添加青霉素链霉素的sd-caa培养基中培养，30℃振荡过夜，然后用青霉素链霉素在sg/r-caa培养基中复苏酵母细胞，37℃振荡过夜，诱导重组蛋白的表达。对于macs，将109个诱导的酵母细胞在2500g下造粒5min，并通过在50ml洗涤缓冲液(pbs，ph7.2，0.25％bsa，2mmedta)，并在2500g下再次造粒5min。将洗涤后的细胞重新悬浮在含有0.25μm生物素化抗原的25ml洗涤缓冲液中，并在室温下轻轻搅拌培养30min，在冰浴中培养10min。然后，将细胞和抗原溶液在2500g和4℃下造粒5min，用50ml洗涤缓冲液洗涤两次，并在每个洗涤步骤后造粒。将细胞重新悬浮在5ml洗涤缓冲液和25μl链霉亲和素微球(μmacs-streptavidinkit，macs-miltenyi)中，并在冰上培养10min。最后，添加15ml洗涤缓冲液。将ls柱置于分离器中，用3ml洗涤缓冲液对柱进行预处理。然后，将细胞溶液分批装入7毫升。一旦柱停止滴落，它被短暂地从磁铁上取下并放回磁铁中，以重新定位柱中的珠子，使被捕获的细胞流过。在装入下一个7毫升细胞悬浮液之前，向柱上施加1毫升洗涤缓冲液。重复这些步骤，直到所有细胞都被加载。然后，用3毫升洗涤缓冲液洗涤柱，从磁铁上短暂取出，再用3毫升洗涤缓冲液再次洗涤。为了洗脱结合细胞，将柱从磁体上移除，并添加5ml洗涤缓冲液。使用提供的柱塞，细胞被推过色谱柱进入一个新的试管。将结合细胞部分在2500g下造粒5分钟。将颗粒再悬浮在10mlsd-caa培养基中，并在30℃和180rpm下培养过夜。10μl洗脱细胞在990μlsd-caa中稀释，100μl接种在mdl平板上，并在30℃下培养三天，以估计macs程序的产量。在随后的facs选择轮中，将诱导的细胞悬浮液稀释至每1ml10％bsa-pbs108个细胞，并在20℃下以3000rpm离心5分钟。为了阻断细胞，将颗粒重新悬浮在1ml10％bsa-pbs中，并在20℃下在旋转平台上培养30分钟。细胞在20℃下以3000rpm离心5分钟，并在250μl10％bsa-pbs(含1μm生物素化egfrfc)中再悬浮。在旋转平台上于20℃孵育30分钟后，将细胞在4℃下以3000rpm离心5分钟。为了洗涤细胞，将颗粒重新悬浮在1ml冰冷pbs中，并在4℃下以3000rpm离心5分钟。然后，用链霉亲和素alexafluor647(1：800)和抗v5fitc抗体(1：100)(thermofisherscientific)将细胞重新悬浮在250μl10％bsa-pbs中，并在冰上培养30分钟。细胞在4℃下以3000rpm离心5分钟，然后再悬浮在1ml冰冷pbs中并再次离心。最后，将细胞重新悬浮在250μl冰冷pbs中，并保持在冰上，直到用facsariatm进行分类。处理前一轮分选的至少20倍产量，并收集0.1％的顶级抗v5抗体阳性酵母细胞。将第5种菌株进行平板培养，以鉴定单个酵母展示克隆。确定了以下结合物序列(表3)表3描述了鉴定的结合物序列实施例7：cd81lel文库2的构建为了扩增抗原特异性cd81lel结合物的可能谱，设计不同于cd81lel文库1中氨基酸残基的库，以形成潜在的抗原识别位点。本设计涉及11个氨基酸残基的随机化：在螺旋a氨基酸残基132-133、ab环136-139和螺旋c162-165、167和171-172中。该支架是一个cd81lel突变体，它含有两种新的二硫键：一个连接螺旋a和b(c4)，一个连接螺旋a和c(c9)。将新型二硫键ala134cys/lys144cys和val135cys/ser168cys组合，在hek293-6e细胞(cnrc)中产生cd81lel突变体，并对其热稳定性进行了测试。热展开记录高达130℃，在109.40±0.25℃的温度下，在一次事件中进行，高于野生型hcd81lel43℃。这种蛋白被称为c4c9在自然条件下以单一尖峰形式在野生型蛋白的时间特征下以秒的形式迁移。重要的是，稳定突变株能够与结构报告子抗体m38(thermofisherscience)结合到野生型hcd81lel的相同程度。对该突变体的远紫外cd光谱进行了检测，发现其与野生型hcd81lel获得的光谱相同，该基因是典型的α-螺旋含量高的蛋白质，其特征最小值为208和222nm，与先前公布的结果类似。首先，通过删除固有bami和hind3限制位点，对酵母pyd1_cd81lel受体载体进行了一系列诱变步骤的修饰。所有诱变步骤均使用使用寡核苷酸的快速变化闪电诱变试剂盒(agilen)进行：使用寡核苷酸删除bamhi位点。(seqidno：21)：cgataaggtaccaggttcctttgtcaacaag(seqidno：22)：cttgttgacaaaggaacctggtaccttatcg，以及使用寡核苷酸删除hindiii位点(seqidno：23)：gtatgtttttaagctcctgcaggctagtggtg(seqidno：24)：caccactagcctgcaggagcttaaaaacatac.为了便于线性化后的文库片段重组，利用寡核苷酸引入了新的bamhi限制性位点。(seqidno：25)：tttgtgtccctcgggatccaacatcatcagcaa(seqidno：26)：ttgctgatgatgttggatcccgagggacacaaa，并利用寡核苷酸引入新的hindiii限制位点。(seqidno：27)：gcagttctatgaccaagctttacagcaggccgtgg(seqidno：28)：ccacggcctgctgtaaagcttggtcatagaactgc.用核键制备法(macherey-nagel)分离受体载体dna，用bamhi和hindiii限制性内切酶对载体进行线性化。制备凝胶电泳纯化载体骨架。此外，cd81的模板插入物具有突变ala134cys和lys144cys(其形成新的二硫键)和val135cys和ser168cys(其形成另一新的二硫键)，被修饰以引入具有限制性位点的序列以促进文库编码片段的正确重组。修饰模板为ptt22ssp4_cd81lelc4c9突变体。hindiii位点是用寡核苷酸引入的。(seqidno：29)：gcagttctatgaccaagctttacagcagtgctgtg(seqidno：30)：cacagcactgctgtaaagcttggtcatagaactgc以及利用寡核苷酸引入bamhi位点。(seqidno：31)：tttgtgtccctcgggatccaacatcatcagcaa(seqidno：32)：ttgctgatgatgttggatcccgagggacacaaa.用寡核苷酸制备具有随机核苷酸序列的pcr片段。(seqidno：33)：aaggatgtgaagcagttctatgaccaagctttannknnktgctgtnnknnknnknnkgccaacaacgcctgtgctgtg，其中n是a、c、g或t中的任意一种。以及(seqidno：34)：cttgaagaggttgctgatgatgttggatcccgagggacacaaattmnnmnngagcacacamnnggtmnnmnnmnnmnntgtgctggagccacagca，其中n为a、c、g或t中的任意一种；以及m为a或c中的任意一种.(根据iupac核苷酸代码)。采用q5-hifi聚合酶(新英格兰生物实验室)进行pcr反应，经凝胶电泳后纯化文库片段。为了进行转化，将eby100(thermofisherscientific)在20mlypd培养基(2％蛋白胨、1％酵母提取物、2％葡萄糖)(默克)中的发酵剂培养物在30℃和180rpm下培养过夜。然后将培养物稀释至0.4od600，并在30℃和180rpm下培养约5小时。然后在室温下将50ml细胞培养物的小份在1000g下造粒5分钟，然后用25mlad洗涤并再次造粒。将细胞重新悬浮在3ml100mm醋酸锂中，并在30℃的摇动培养箱中培养15分钟。细胞被颗粒化并去除上清液。按如下方式添加转化混合物的组分：2400μl50％peg3350、360μl1.0m醋酸锂、500μl2mg/mlssdna(鲑鱼精子载体dna，先前加热至95℃5分钟，然后放在冰上)(sigma-aldrich)、10μg线性化受体载体和7μgdna片段。细胞颗粒在转化混合物中再悬浮，并在振荡培养箱中在30℃下培养30分钟，并在42℃下热休克45分钟。在室温下以1000g离心5min收集细胞并去除上清液后，将颗粒重新悬浮在10mlsd-caa培养基中。取小份进行稀释平板以确定文库大小：10μl细胞悬浮液在990μlsd-caa培养基中稀释，其中100μl在mdl平板上平板并在30℃下培养3天。酵母细胞在50mlsd-caa培养基中稀释，在30℃下以180rpm孵育24小时，以1：20稀释度传至新鲜sd-caa培养基中，在相同条件下再培养24小时。在1000g，5min，4℃条件下收获细胞，在-80℃进行冷冻前，将颗粒重新悬浮在等体积的30％甘油中。cd81_lel文库2的酵母展示转化导致：文库2_4：9.5x106独立成员，文库2_5：2.1x107独立成员，以及文库2_6：1.7x107独立成员。实施例7：用人egfr-fc选择cd81-lel文库2对于分类，文库首先在添加青霉素链霉素的sd-caa培养基中培养，30℃振荡过夜，然后用青霉素链霉素在sg/r-caa培养基中复苏酵母细胞，37℃振荡过夜，诱导重组蛋白的表达。接下来，将109个细胞在2500g下造粒5分钟，然后将其重新放入50ml洗涤缓冲液(1xd-pbs(thermofisherscientific)、0.25％bsa(sigma-aldrich)中洗涤，2mmedta(sigma-aldrich)，并在2500g下再次造粒5min。将洗涤后的细胞重新悬浮在含有0.25μm生物素化抗原的25ml洗涤缓冲液中，并在室温下温和搅拌培养30min，在冰浴中培养10min。然后，将细胞和抗原溶液在2500g和4℃下造粒5min，用50ml洗涤缓冲液洗涤两次，并在每个洗涤步骤后造粒。将细胞重新悬浮在5ml洗涤缓冲液和25μl链霉亲和素微球中，并在冰上培养10min。最后，添加15ml洗涤缓冲液。将ls柱(miltenybiotec)置于分离器中，并应用3ml洗涤缓冲液对柱进行预处理。然后，将细胞溶液分批装入7毫升。一旦柱停止滴落，它被短暂地从磁铁上取下并放回磁铁中，以重新定位柱中的珠子，使被捕获的细胞流过。在装入下一个7毫升细胞悬浮液之前，向柱上施加1毫升洗涤缓冲液。重复这些步骤，直到所有细胞都被加载。然后，用3毫升洗涤缓冲液洗涤柱，从磁铁上短暂取出，再用3毫升洗涤缓冲液再次洗涤。为了洗脱结合细胞，将柱从磁体上移除，并添加5ml洗涤缓冲液。使用提供的柱塞，细胞被推过色谱柱进入一个新的试管。将结合细胞部分在2500g下造粒5分钟。将颗粒再悬浮在10mlsd-caa培养基中，并在30℃和180rpm下培养过夜。此外，将100μl10-2稀释液接种到mdl平板上，并在30℃下培养。将诱导的细胞悬浮液稀释至每1ml10％bsa-pbs108个细胞，并在20℃下以3000rpm离心5分钟。为了阻断细胞，将颗粒重新悬浮在1ml10％bsa-pbs中，并在20℃下在旋转平台上培养30分钟。细胞在20℃下以3000rpm离心5分钟，并在250μl10％bsa-pbs(含1μm生物素化egfrfc)中再悬浮(sinobiological)。在旋转平台上于20℃孵育30分钟后，将细胞在4℃下以3000rpm离心5分钟。为了洗涤细胞，将颗粒重新悬浮在1ml冰冷pbs中，并在4℃下以3000rpm离心5分钟。然后，用链霉亲和素alexafluor647(1：800)和抗v5fitc抗体(1：100)(thermofisherscientific)将细胞重新悬浮在250μl10％bsa-pbs中，并在冰上培养30分钟。细胞在4℃下以3000rpm离心5分钟，然后再悬浮在1ml冰冷pbs中并再次离心。最后，将细胞重新悬浮在250μl冰冷pbs中，并保持在冰上，直到用facsariatm进行分类。分选后，将细胞重新悬浮在适量的sd-caa中，并在30℃和180rpm下培养，然后如上所述进行诱导。表4实施例8：以可溶性形式表达修饰的cd81lel用寡核苷酸从酵母展示克隆中扩增编码cd81的序列(seqidno：41)：acgtgctagctttgtcaacaaggaccagatc(seqidno：42)：acgtggtgaccggtgctggaacccttcccggagaagaggtc.用限制性内切酶nhei和bsteii切割pcr片段，连接到用相同酶切割的载体ptt28(cnrc)上。将连接混合物转化为大肠杆菌top10(thermofisherscientific)，并在氨苄青霉素平板上筛选转化子。用微制剂分离质粒并将其转染到expicho细胞(thermofisherscientific)。expicho表达系统(thermofisherscientific)中的表达符合maxtiter方案，完全遵循制造商的说明。然后使用标准方案通过ni-nta层析纯化hcd81-lel变体。上清液用等体积的ad稀释，用pbs和20mm咪唑缓冲，ph调节至7.5。excel-ni-nta柱(ge-healthcare)用pbs和20mm咪唑(ph7.5)平衡，并装载缓冲上清液。洗脱采用5柱体积，线性梯度为20-500mm咪唑，ph7.5。将含有蛋白质的组分库集在一起，并在4℃下对100倍体积的pbs进行透析过夜。在自然条件下的sec分析揭示了对应于蛋白质二聚体形式的单分散洗脱曲线，类似于可溶性野生型cd81-lel。或者，完全按照制造商的说明，按照maxtiter方案在expicho表达系统(thermofisherscientific)中表达蛋白质。然后使用标准方案通过ni-nta色谱纯化hcd81-lel。上清液用等体积的ad稀释，用pbs和20mm咪唑缓冲，ph调节至7.5。excel-ni-nta柱(ge-healthcare)用pbs和20mm咪唑(ph7.5)平衡，并装载缓冲上清液。洗脱采用5柱体积，线性梯度为20-500mm咪唑，ph7.5。将含有蛋白质的组分库集在一起，并在4℃下对100倍体积的pbs进行透析过夜。实施例9：cd81lel的热稳定化编码hcd81lel的片段(片段phe113-lys201)(根据seqidno：87编号)从具有全长cd81序列(geneart)的合成结构中扩增。dsdbase(vinayagametal.2004，《核酸研究》，第32卷，第1期，d200–d202页，https：//doi.org/10.1093/nar/gkh026)作为一种预测工具，用于识别可能含有半胱氨酸残基的位置，该残基适合创建域内二硫键。该算法用于分析hcd81lel晶体结构1g8q的相邻氨基酸残基的cα和cβ原子之间的距离以及扭转角和由此产生的s-s键长度。在36个预测的可能的二硫键中，选择了11个通过对晶体结构的目测判断成功的可能性最高的键。其中5个由dsdbase程序在hcd81lel的原聚体a和原聚体b中预测。使用quikchangelightning突变试剂盒(安捷伦)对单选氨基酸残基进行半胱氨酸突变，完全按照表5所列寡核苷酸的制造商说明进行。表5显示了用于诱变的寡核苷酸将hcd81lel变体克隆到ptt22ssp4哺乳动物表达载体(cnrc)中，并在两种不同的表达系统中表达。为了进行预筛选，构建体在hek293-6e细胞(cnrc)中以2毫升的比例表达，在f17培养基中添加4mm谷氨酰胺和50μg/mlg-418(thermofisherscientific)，在180转/分、37℃、5％co2下持续4天，转染后第二天将tn-20添加到0.8％的终浓度。突变株c5不表达，c6表达差，c10形成明显的二聚体，故不作进一步分析。选择用于进一步鉴定的突变体(c1、c2、c3、c4、c7、c8、c9和c11)完全按照制造商的说明转染到expicho细胞(thermofisherscientific)。细胞培养按照maxtiter方案进行(thermofisherscientific)。14天后收集上清液并用ni-nta亲和层析纯化。澄清后，样品用磷酸盐缓冲盐水(pbs)缓冲，其中含有20mm咪唑，ph7.5，并通过excelninta柱(gehealthcare)，用相同的缓冲液进行平衡。his标记的hcd81-lel在5个柱体积内用20-500mm咪唑梯度洗脱。将含有目标蛋白的组分库集在一起，在4℃下隔夜用100倍体积的pbs透析两次。蛋白质在-80℃下储存直至使用。岛津lc-20a日珥系统配备二极管阵列检测器和折射率检测器，使用superdex200increase10/300gl柱(gehealthcare)执行sec-hplc。流动相缓冲液为pbs加200mmnacl。以0.75ml/min的恒定流速进行色谱分析。将大约2mg/ml的200μg蛋白质加载到柱上进行分析。用一套分子量为10-500kda(bio-rad)的标准品进行柱校准。突变体c1和c8没有显示出很好的解析峰，所有其他突变体与野生型蛋白相似。dsc实验是使用自动微胶囊peaq-dsc自动系统(malvern)进行的，该系统使用80μm蛋白质溶液，在ph7.4的pbs中稀释。以1℃/min的速率从20℃加热至110℃。然后原位冷却蛋白质溶液，并进行相同的热扫描以获得第一次扫描的减影基线。所有的测量都是重复的。利用microcal-peaq-dsc软件，采用非2态跃迁机制进行拟合。对野生型cd81-lel的热稳定性的测量显示，在66.15℃时有一个单一的熔点，但是2.4x104kcal/mol的低焓。表6显示了hcd81lel变体的温度差热量热扫描是通过重新扫描变性蛋白溶液作为背景进行的。在这里发现，突变体c2与野生型cd81lel和其他稳定变种相比，令人惊讶地显示可逆展开，可达110℃。本发明制备了一个具有潜在稳定新二硫键ala134cys/lys144cys和val135cys/ser168cys的hcd81lel突变体，并对其热稳定性进行了测试。热展开记录高达130℃，在109.40±0.25℃的温度下，在一次事件中进行，高于野生型cd81lel43℃。这种蛋白被称为c4c9在自然条件下以单一尖峰的形式在野生型蛋白的时间特征下以秒的形式迁移。重要的是，稳定突变株能够与结构报告器抗体m38结合到野生型cd81lel相同的程度。elisa平板(maxisorp，nunc)在pbs中，在室温下，在5μg/ml条件下，用抗hcd81m38抗体(thermofisherscience)进行1h的检测。在rt时用5％牛血清白蛋白(bsa)-pbs阻断1h后，用hcd81lel变异体或纯化的hcd81lel基因转染hek293-6e细胞上清液，在2.5％bsa-pbs中稀释，在rt处结合1h，经广泛洗涤后，可将其与hek293-6e细胞上清液结合1h，用抗his辣根过氧化物酶(hrp)结合抗体(caigan)检测突变蛋白的结合，稀释1：2000，在2.5％bsa-pbs中。用3,3'，5,5'-四甲基联苯胺(tmb)(sigmaaldrich)显示抗体结合，加入30％h2so4等体积停止反应，吸收率在450/620nm处读取。表7显示野生型和突变cd81lel的吸光度值检测了突变株c4c9和野生型cd81的远紫外cd光谱。cd光谱在chirascan分光偏振仪(应用光物理)上测量。使用1mm石英试管将蛋白制剂在pbs中稀释至1mg/ml。发现野生型hcd81lel和c4c9的光谱相同。所观察到的光谱是具有高α-螺旋含量的蛋白质的典型光谱，在208和222nm处具有两个特征最小值，类似于先前发表的结果。表8显示了野生型和突变cd81的远紫外cd光谱实施例10：在细胞培养物中生产靶特异性ev10.1利用hela细胞瞬时转染靶特异性ev供体细胞系用电穿孔法瞬时转染表达c末端gfp融合重组cd81的hela细胞，以分泌靶特异性含cd81-gfp的外泌体(cd81-gfp外泌体)。转染前2-3天，将hela细胞(5x106细胞)置于t175细胞培养瓶(sigma，kremmünster，德国)上。完整的rpmi-1640培养基(默克，达姆施塔特，德国)，含有10％的fcs，4mml-谷氨酰胺，用于供体hela细胞的常规培养。在转染当天(第0天)，使用0.1％胰蛋白酶溶液(5分钟处理，用完整的rpmi-1640中和)收获hela细胞(最佳为70-85％的融合率)。用vicell细胞计数仪对rpmi-1640中分离的hela细胞进行定量。用cd81-gfp质粒(ptt5，nrccanada，ottawa，canada，4μg)转染3x106细胞以填充一个t175烧瓶。根据制造商手册(hela细胞计划i-013)，使用amaxanucleofectori设备(瑞士巴塞尔lonza)进行电穿孔，使用内部制备的电穿孔缓冲液(5mmkcl、15mmmgcl2、120mmna2hpo4/nah2po4ph7.2、50mm甘露醇、0.005％pluronicf-68)。在完整的rpmi-1640中回收电穿孔细胞并培养24小时，使细胞附着在培养瓶表面。事实上，靶向重组cd81的各种形式的人转铁蛋白受体定位于质膜，表明重组四跨膜蛋白的功能整合(图4)。10.2靶特异性ev的分离纯化在第1天(转染后24小时)，移除培养基并用相应体积(45ml用于1xt175)的去ev分泌培养基(rpmi-1640)替换。通过收集超速离心(14-18h，4℃，100000g)完整rpmi-1640(含20％fcs)的上清液部分并用rpmi-1640将培养基稀释至10％fcs并添加l-谷氨酰胺至最终浓度4mm来制备ev缺失的rpmi-1640。hela细胞与去ev培养基孵育72小时(37℃、5％co2气氛)以分泌靶特异性ev。收集72小时后用超速离心法分离ev。收集条件细胞培养基并在4℃下离心(3100×g)30分钟以去除细胞和细胞碎片。上清液通过450nm注射器过滤装置(德国达姆施塔特默克公司)并转移至100ml可密封超离心管。然后使用超速离心机(optimal-60，beckmancoulter，brea，usa)将上清液(100000×g)在4℃下离心90分钟。去除上清液，将颗粒收集在1ml剩余培养基中。进行第二步超速离心(100，000×g，90分钟，4℃)以收集体积较小的ev。再次移除上清液，并将剩余的ev颗粒再悬浮在200至400μl基于hepes的1x活细胞成像溶液中(thermofisherscientific，waltham，usa)。利用该方法，从hela上清液中纯化出约1011evs/ml。实施例11：生产带有可追踪和可净化标签的ev11.1逆转录病毒系统中cd81-snokel标签的序列分析与克隆将野生型人cd81序列(氨基酸序列seqidno：87；核酸序列seqidno：88)克隆到带有c端融合通气标签的pbmn载体中(brown等人，2013，plosone8(9)：e73255)。doi：10.1371/journal.pone.0073255).snorkel标签使标签显示在囊膜表面。用ncoi和agei切割cd81的pcr产物，用agei和noti切割snorkel标签的pcr产物。用ncoi和noti切割pbmn质粒。与ncoi和noti酶切的pbmn质粒连接的酶切pcr产物。将连接混合物转化为有活性的大肠杆菌细胞，并在氨苄青霉素平板上筛选转化子。用无内毒素质粒制备法(qiagen-maxiprep)分离质粒。11.2使用逆转录病毒转染法在ev供体细胞中稳定表达cd81-snokel-tag在转染前1天(第0天)，将phoenix细胞(5x106细胞)置于t75平板(sigma，kremmünster，德国)中。细胞在含dmem4.5g葡萄糖、10％fcs和4mml-谷氨酰胺的完全生长培养基中培养。一旦细胞60-70％库合，移除培养基并用dmem4.5g葡萄糖和4mml-谷氨酰胺(不含fcs)替换。用jetprime转染试剂(polyplus，法国)将10μg的pbmn-cd81-snokel-tag(snokel-tag融合到cd81c-末端)质粒转染细胞。转染后24小时(第1天)，将培养基改为7ml的完整生长培养基。将靶细胞(hela)置于6孔板(sigma，kremmünster，德国)中，1x105细胞/孔置于含有10％fcs和4mml-谷氨酰胺的rpmi-1640培养基中。接种后24小时(第2天)，hela细胞(50-80％融合)可被感染。使用0.45μm过滤器(默克，达姆施塔特，德国)和聚布伦(最终浓度8μg/ml)过滤来自phoenix细胞(含病毒颗粒)的7ml上清液至该滤液并混合。新鲜的生长培养基加入到凤凰细胞中。去除靶细胞的上清液，并添加最多2ml含病毒的上清液。将整个平板包裹在parafilm中，在室温下以800xg离心60min。然后，丢弃病毒上清液并将新鲜的生长培养基添加到hela细胞上。再进行病毒感染3天，直到细胞达到95-100％表达cd81-snokel标记。标记的cd81定位于细胞膜，表明折叠和定位正确(图5a)。随着snorkel标签融合到cd81的c-末端，该方法也在hela细胞中成功地与cd63融合蛋白进行了融合(图5b)。在人骨髓间充质干细胞(ascs)中也观察到类似的结果。在通过与10nm金颗粒偶联的抗ha抗体和与18nm金颗粒偶联的抗cd81抗体进行免疫金标记后，当进行电子显微镜检查时，ev同时对ha标签和cd81呈阳性(图5c)。11.3cd81-snokel标签尺寸、数量和加入ev的表征将稳定表达cd81-snokel标记的hela细胞镀于3个t75板(5x106细胞/瓶中)。播种后24小时(第1天)取下培养基，并用相应体积(1xt75为12ml)的ev耗尽分泌培养基(rpmi-1640)代替。通过收集超速离心(14-18h，4℃，100000g)完整rpmi-1640(含20％fcs)的上清液部分并用rpmi-1640将培养基稀释至10％fcs并添加l-谷氨酰胺至最终浓度4mm来制备ev缺失的rpmi-1640。将hela细胞与ev耗尽培养基孵育48小时(37℃，5％co2大气)，以秘密携带浮潜标签的ev。在ev耗尽培养基中培养48h后，分离携带浮潜标记的evs。收集条件培养基，在700g下离心5min，4℃下去除细胞碎片。上清液在2000g下第2轮离心，4℃下离心10min，去除凋亡体和较大颗粒。接下来，上清液通过0.22μm过滤器(德国达姆施塔特默克)，以去除较大的微粒，如微微粒。采用切向流动过滤柱，用300kda孔径中空纤维将处理后的上清液浓缩至初始体积的1/20倍(荷兰spectumlab)。用于进一步表征evs的浓缩条件介质。10μl浓缩条件介质在过滤dpb(默克，德国达姆施塔特)中稀释至1000次，并用于纳米光ns500散射模式下的纳米颗粒跟踪分析(nta)。所有采集参数与尺寸和浓度测量值一致。所有实验均以实验三倍量表进行测量。不同隔离条件下的evs尺寸约为110-140nm。westernblot分析证实cd81-snokel标记在ev中的加入。1e10ev(纳米光定量)随bca试剂盒(thermofisherscientific)定量的细胞溶血酶50μg，在nupage4-12％双三蛋白凝胶中进行，sds-page进行。利用反式印迹-涡轮转移系统(bio-rad)将凝胶上的蛋白质转移到pvdf膜上。针对ev特异性标记的特异抗体以及浮潜标记进行定量。的确，ev在cd63、cd81和tsg101等western印迹中显示典型ev蛋白标记，以及细胞内钙合蛋白的缺失。11.4使用抗ha基质和预消化蛋白酶分离带浮潜标签的ev用差速离心(700g&2000g)处理表达cd81-snokel标记的hela细胞的条件培养基，用0.22μm过滤器(德国达姆施塔特)过滤，并使用带有300kda孔径中空纤维的切向流动过滤柱浓缩至1ml(荷兰spectumlab)。将350μl浓缩条件培养基与200μl的抗ha抗体结合到琼脂糖珠(sigma)中，并在4℃下在试管旋转器上孵育一夜。在16-18小时的培养后，琼脂糖珠在500g下纺5分钟，4℃下，并收集流动(未结合evs)，并用1ml过滤dpb在500g下旋转琼脂糖珠5min，4℃下旋转5min。然后，将与evs上snokel标记结合的抗ha抗体结合琼脂糖珠进行预消化蛋白酶处理(sigma)4μl，8个单位，50mmtris(sigma)，150mmnacl(sigma)，ph7-7.4，在4℃条件下，在试管旋转器上持续16-18小时。在预处理16-18小时后，将琼脂糖珠在500g下纺制，并收集到超生物。所有样品(输入、流动、清洗和洗脱)均用1-1000倍稀释的nta分析，以定量携带浮潜标签的ev数量。使用预消化蛋白酶纯化，从亲和基质中温和洗脱约80-90％的囊泡，因为使用分离的ha标记进行预消化后洗脱部分中未检测到任何带，而剩余的片段标记在洗脱部分中可见。将洗脱分数与未洗脱和残留在珠子上的分数进行比较，观察到产率约为80-90％(图6)。在snokel标记中的预导蛋白酶位点之前插入抗原特异性配体(如gas6)进行axl特异性靶向，可纯化携带snokel标记的特定evs，并在纯化后以evs为目标。实施例12：靶特异性胞外ev的表征12.1ev大小和重组蛋白掺入率的表征将10μlev分离物用6ml过滤的dpb(德国达姆施塔特默克公司)稀释，并用zview(德国因宁particlemetrix公司)在散射和荧光模式下用于纳米颗粒跟踪分析(nta)，然后使用nta软件(德国因宁particlemetrix公司)进行评估。所有采集参数均与尺寸和浓度测量值相同。所有实验均为实验三份。散射和荧光模式下测得的粒子数之比等于含有靶特异性cd81-lel部分和荧光gfp的重组ev与非重组和非荧光天然ev之间的比率。通过不同批次的重组ev生产，通过nta测量得到的比率表明，大约30-50％的分离ev是重组的。用上述分离方法分离的ev的共同中值大小约为120-140nm，并且在60-400nm的大小范围内，靶向特异性荧光ev的典型产量为每hela细胞1600-5000重组ev，在粒径130nm处达到峰值(图7)。12.2体外特定ev摄取的鉴定和量化(a)荧光显微镜对靶抗原阳性细胞摄取ev的鉴定将受体细胞(例如caco-2细胞)接种在8孔ibidi玻璃底板(每孔2.5x104个细胞)中，并在完整培养基(37℃，5％co2气氛)中附着24小时。孵育时间结束后，每孔加入109个重组ev。细胞再培养24小时，让受体细胞吸收重组颗粒。最终用pbs洗涤细胞，并用酸性甘氨酸缓冲液(100mmnacl，100mm甘氨酸，ph3.5)在冰上处理以去除表面结合的ev。然后用荧光显微镜(dmi3000b；德国wetzlarleicamicrosystems)将细胞放大40倍成像。所有实验的显微成像参数(曝光时间、对比度和增益)相同。事实上，重组ev很容易被受体细胞吸收(图8a)。(b)流式细胞术定量检测靶抗原阳性细胞的ev摄取将受体细胞(例如caco-2细胞)接种在24孔塑料底板(每孔0.25x106个细胞)中，并在完整培养基(37℃，5％co2气氛)中附着24小时。孵育时间结束后，每个孔中加入固定数量的5x109重组ev。细胞再培养24小时，让受体细胞吸收重组颗粒。最终用0.1％胰蛋白酶(5分钟，37℃)洗涤dpbs并用含有10％fbs的完整培养基中和细胞。然后以300g离心分离细胞，并将颗粒再悬浮在冰冷的dpbs中。样品保存在冰上，并用cytoflexs流式细胞仪(beckmancoulter，brea，usa)测量。数据用cytoflex软件分析。对照/未处理细胞样品的平均荧光强度标准化(δmfi)。与过度表达非tfr1靶向cd81(cp4evs)或野生型evs(wtevs)的细胞的evs相比，此处观察到靶向转铁蛋白受体的重组evs的摄取增加约30-60％，这取决于重组cd81构建体(tfr1evsp1、tfr2evsp1、tfr2cp4evsp1)(图8b)。实施例13：使用凋亡诱导sirna产生治疗性负载靶特异性ev13.1用sirna转染重组ev用脂质体转染试剂dharmefect(dharmacon，拉斐特，美国)，将携带非重组或重组cd81靶向人类转铁蛋白受体的纯化evs用凋亡诱导sirna(tox转染对照，dharmacon)或用非靶向对照sirna(on-targetplus非靶向sirna，dharmacon)转染。根据制造商手册，用各自的靶向或非靶向sirna转染ev(最终浓度为25nmsirna)。使用qpcr控制sirna的负载。13.2用于测定靶细胞特异性细胞毒性的基于细胞的分析将靶抗原表达细胞以7.5×103个细胞/孔的密度接种在96孔板的完全培养基中，然后与5x108重组/sirna转染的evs/孔孵育72小时。每个ev剂量或ev对照进行6次重复实验。去除培养基并洗涤pbs后，将细胞与1xwst-1(sigma，st.louis，usa)或1xalamarblue(thermofisherscientific，waltham，usa)在完整培养基中培养1h、2h和4h或过夜。根据各自制造商的手册，在microplatereaderinfinite200pro(瑞士tecan)上进行分析读数。事实上，与对照组相比，靶向转铁蛋白受体的ev的细胞毒性高出约30％，尤其是使用tfr1cp4重组cd81构建体(图10)。实施例14：文库cd81lel_l3的设计cd81-lel_l3文库设计基于可逆复性cd81-lel稳定突变体(seqidno：180)seqidno：180：fvnkdqiakdvkqfydqclqqacvdddannakacvktfhetldccgsstltalttcvlknnlcpsgsniisnlfkedchqkiddlfsgk在该文库中，稳定突变ala130cys/ala146cys和val135cys/ser168cys可使cd81-lel的热转变中点增加到93.4℃，并且当加热到110℃时，该组合突变可可逆地复性。在该文库中，132-133、136-141、162-165、167和171-172位的氨基酸残基随机分组形成可用于抗原结合的复合表面(seqidno：1中的x)(seqidno：97)。seqidno：97：fvnkdqiakdvkqfydqclxxacxxxxxxnakacvktfhetldccgsstxxxxtxcvlxxnlcpsgsniisnlfkedchqkiddlfsgk其中，x是任意一种氨基酸。实施例15：酵母展示文库cd81-lel_l2和l3的构建对于酵母展示文库cd81lel_l2，使用q5hifi聚合酶mastermix(新英格兰生物实验室)、10ng/μl模板(ptt22ssp4_c4c9)和50pmol寡核苷酸lib2fwd(seqid98)和efrev(seqidno：99)以100μl等分生产编码随机插入物的pcr重组产物。在98℃下进行30秒的初始变性之后，在98℃下进行35个循环，每20秒变性一次，在55℃下退火20秒，在72℃下延长20秒，并在72℃下完成5分钟的培养步骤。用illustragfx纯化试剂盒纯化pcr产物并在ad中洗脱。seqidno：98：aaggatgtgaagcagttctatgaccaagctttannknnktgctgtnnknnknnknnkgccaacaacgcctgtgctgtg其中，n是a、c、g或t中的任意一种。seqidno：99：cttgaagaggttgctgatgatgttggatcccgagggacacaaattmnnmnngagcacacamnnggtmnnmnnmnnmnntgtgctggagccacagca其中，n是a、c、g或t中的任意一个；以及m是a或c中的任意一种。对于酵母展示文库cd81lel_l3，使用q5hifi聚合酶mastermix(新英格兰生物实验室)、10ng/μl模板(ptt22ssp4_c2c9)和50pmol寡核苷酸lib3fwd(序列id100)和lib2rev2(序列id99)以100μl等分生产编码随机插入物的pcr重组产物。在98℃下初始变性30秒，然后在98℃下每20秒变性35个周期，在55℃下退火20秒，在72℃下延长20秒，并在72℃下完成培养步骤5分钟。pcr产物用illustragfx纯化试剂盒(gehealthcare)纯化并在ad中洗脱。seqidno：100：aaggatgtgaagcagttctatgaccagtgtctannknnkgcctgtnnknnknnknnknnknnkaacgccaaggcttgtgtg其中，n是a、c、g或t中的任意一种。用bamhi和hindiii线性化受体载体pyd1delbamhind_bamhind，用制备性琼脂糖凝胶电泳和illustragfx纯化试剂盒(gehealthcare)纯化，并在ad中洗脱。采用peg3350/li醋酸酯/ssdna转化法，以线性化受体载体和pcr重组产物转化酿酒酵母eby100。每个重组片段产生2个文库，l2a和l2b，以及l3a和l3b。对于每个文库，用过夜培养物将250mlypd培养基接种至od600为0.4。在30℃的摇动培养箱中培养5小时后，将酵母细胞分成50ml等份。去除上清液，并在3000rpm下用25mlad(每等份)洗涤酵母细胞，在室温下5min。将细胞颗粒再悬浮在3ml(每等份)100mm醋酸锂中，并在200rpm下摇动，在30℃下15min。在3000rpm下收集细胞，在室温下5min。向每个酵母细胞等份中加入2750μl50％peg3350溶液的混合物，添加360μl1m醋酸锂、500μl热休克单链dna、10μg线性化受体载体和10μg重组pcr片段。在200rpm下进行培养，30℃下30min，然后在42℃下进行45min的热休克。在3000rpm下收集酵母细胞，在rt下5min，并用青霉素和链霉素稀释到250mlsd-caa培养基中。在30℃下以200rpm进行培养24h，并将12.5ml培养物转移到250ml新鲜sd-caa培养基中，加入青霉素和链霉素，在30℃下培养24h，在3000rpm下造粒，在4℃下培养10min，并在与等量30％甘油混合后冷冻。文库的大小通过稀释镀法确定，l2为1.1x108个独立成员，l3为1.2x108个独立成员。为了确定文库的正确性水平，从10μl颗粒酵母细胞中分离质粒dna，并使用电穿孔法将其转化为大肠杆菌top10。用引物pydfwd(seqidno：101)和pydrev(seqidno：102)扩增cd81-lel突变体的表达盒，并用其中一个引物测序。结果表明，l2a文库的正确率为62.5％，l2b文库的正确率为87.5％，l3a文库的正确率为62.5％，l3b文库的正确率为100％。seqidno：101：agtaacgtttgtcagtaattgcseqidno：102：gtcgattttgttacatctacac为了质量控制，酵母细胞在含有青霉素和链霉素的sg/rcaa培养基中诱导48小时(20℃)或24小时(37℃)。为了染色，酵母细胞在od600为1的2％bsa-pbs溶液中阻断30分钟(rt)。然后将它们重新悬浮到100μl小份中，并用与n-末端定位的xpress标签反应的抗xpress抗体(thermo-sientific)(1：1000)和m38抗体(thermo-scientific)(1μg/ml)染色，其检测2％bsa-pbs中正确折叠的cd81lel，在rt下1h。以3000rpm将细胞造粒，在4℃下停留5分钟，然后用山羊抗鼠(fab')2-fitc结合物(sigma-aldrich)在2％bsa-pbs中再悬浮，在2％bsa-pbs中稀释1：200。其他染色方法为：抗-his-tagalexafluor488(qiagen)，在2％bsa-pbs和抗-v5-tag-fitc(thermoscientific)中稀释1：200，在2％bsa-pbs中稀释1：100，用于检测c-末端his-tag和c-末端v-tag以确定克隆的正确读取。与荧光抗体在冰上孵育30分钟。最后，在3000rpm、4℃下5分钟收集细胞，并在200μl冰冷pbs中再悬浮。用流式细胞仪测定染色样品和未染色对照的荧光。阳性细胞百分比已确定，见表9。表9实施例16：基于cd81lel的egfr特异性结合物16.1选择cd81lel文库l2和l3，并使用人egfrfc人表皮生长因子fc购自中国生物。对于生物素化，采用ez-linktm磺基nhslclc生物素试剂(thermoscience)进行了3：1生物素与蛋白质的摩尔比。抗原完全按照制造商的指示重新构建，浓度为0.25μg/μl。用生物素化试剂在室温下摇动培养1h。用snakeskin透析管(thermoscience)与10.000damwco在4℃下搅拌，在100xpbs下透析去除未结合生物素。分选时，首先将文库2a、28、3a和38在补充有青霉素-链霉素的sd-caa培养基中培养，在30℃下摇动过夜，然后在sg/rcaa培养基中用青霉素-链霉素重悬酵母细胞，在37℃下摇动培养过夜，诱导重组蛋白的表达。对于macs，109个诱导酵母细胞在1000g下造粒5min，然后在50ml洗涤缓冲液(pbs，ph7.2，0.25％bsa，2mmedta)中重新进行清洗，并在2500g下再次进行5min的造粒。将洗涤过的细胞重新接种在含有0.5μm生物素化抗原的5ml洗涤缓冲液中，并在室温下温和孵育30min煽动。抗原结合用10ml冰冷洗缓冲液淬火，在1000g和4℃下，细胞和抗原溶液颗粒5min。细胞再加入5ml洗涤缓冲液加25μl链球菌肽微球(μmacsstreptavidinkit，macsmiltenyi)，在冰上孵育10min。最后，添加15ml洗涤缓冲液细胞通过40μl细胞过滤器。将ls柱(macsmiltenyi)置于分离器中，并用3ml洗涤缓冲液对该柱进行预处理。然后，将细胞溶液分批装入7毫升。一旦柱停止滴水，它被从磁铁上短暂地移除，然后放回磁铁中，重新调整柱中的珠，使被困的电池流过。在加载下一个7ml细胞悬浮液之前，将1ml洗涤缓冲液涂抹到柱上。重复这些步骤，直到所有细胞都被加载。然后，用3毫升洗涤缓冲液洗涤柱，从磁铁上短暂取出，再用3毫升洗涤缓冲液再次洗涤。为了洗脱结合细胞，将柱从磁体上移除，并添加5ml洗涤缓冲液。使用提供的柱塞，细胞被推过色谱柱进入一个新的试管。在2500g下将结合细胞部分颗粒颗粒颗粒颗粒重新悬浮在10mlsd-caa培养基中，并在990μlsd-caa中稀释10μl洗脱细胞，并将100μl镀到mdl板上，在30℃下孵育3天，以估计macs程序的输出，其余细胞在30℃和180rpm下孵育一夜之间转速。在随后的facs选择轮中，将诱导的细胞悬浮液稀释至每1ml10％bsa-pbs108个细胞，并在20℃下以3000rpm离心5分钟。为了阻断细胞，将颗粒重新悬浮在1ml10％bsa-pbs中，并在20℃下在旋转平台上培养30分钟。在20℃下，以3000rpm离心5min，并在含有0.5μm生物素化egfrfc的250μl10％bsa-pbs中重新悬浮。在旋转平台上20℃下孵育1h后，在3000rpm下离心5min，4℃下。为了清洗细胞，将颗粒重新放入1ml冰冷pbs中，并在3000rpm下离心5min，然后，用链球菌亲和素alexa荧光647(1：800)和抗v5-fitc抗体(1：100)在250μl10％bsa-pbs中重新培养细胞，并在冰上孵育30min。在4℃下，以3000rpm离心5min，在250μl冰冷pbs中重新悬浮，并保持在冰上，直到与索尼手机分拣机sh8000进行分拣。对前一轮的至少20x产量进行处理，收集0.1％的顶抗v5抗体阳性酵母细胞。经可见富集后，对该品种进行电镀，以表征单个酵母展示克隆。对于某些富集型，采用100nm抗原浓度进行了额外的选择。为了筛选，诱导的酵母细胞用od600为1的2％bsa-pbs阻断30分钟，然后用生物素化的人egfrfc连续稀释2倍，从100nm开始，在2％bsa-pbs中培养30分钟，rt。用链霉亲和素alexafluor647在2％bsa-pbs中以1：1000稀释，在冰上培养30分钟。最后，将细胞重新悬浮在200μl冰冷pbs中，并在番石榴easycyte流式细胞仪上记录样品的荧光。评估抗原结合细胞的百分比(表10)，并用seqidno：103的氨基酸序列鉴定egfr特异性结合物l2b_ueu1_1。与亲本克隆不同的残留物以粗体打印。egfr-fc浓度(nm)抗原结合细胞的百分比％10012.34508.17252.9512.51.6501.13表10seqidno：103：fvnkdqiakdvkqfydqalwwccvlykannacavvktfhetldccgsstgrshtacvlkgnlcpsgsniisnlfkedchqkiddlfsgk16.2确认egfr特异性克隆抗原结合的哺乳动物展示系统在pdisplay载体(thermoscientific)的sfii和sali限制性位点之间克隆了野生型cd81lel和egfr特异性克隆l2beu1_的序列。该显示系统允许在n-末端ha-tag和c-末端c-myc-tag之间表达c-末端锚定蛋白。构建体转染hek293-6e细胞(cnrc)。48或72小时后收获细胞，在冰上4％bsa-pbs中封闭30分钟，并用4％bsa-pbs中10μg/ml的抗cd81(m38，thermoscientific)抗体和4％bsa-pbs中10μg/ml的抗c-myc(a-14，sc789，santacruz)抗体在冰上染色30分钟。二级试剂抗小鼠f(ab)2-alexa-fluor555(thermoscientific)，在4％bsa-pbs中稀释1：1000，抗兔(h+l)抗体与alexa-fluor488(thermoscientific)，在4％bsa-pbs中稀释1：100，在冰上孵育30分钟后检测其结合。然后将细胞重新悬浮在pbs中并保持在冰上，直到用番石榴易细胞流式细胞仪(merckmillipore)进行分析。抗原反应性在生物素化的人egfrfc在300nm处孵育后测定，并在4％bsa-pbs中以1：1000用链霉亲和素alexafluor647检测。从与抗c-myc抗体的反应性来看，野生型cd81-lel和egfr结合突变体在哺乳动物细胞表面显示出良好的水平(表11)。野生型cd81lel与抗cd81抗体反应良好，而突变体未显示任何反应性，可能是由于文库突变导致相关表位的修饰(表11)。抗原结合cd81lel突变体可确认哺乳动物细胞展示格式中的抗原结合(表11)。表1116.3egfr结合物的特异性、物种交叉反应性和表位映射的表征用编码野生型cd81-lel和抗egfr突变体cd81-lel-l2b_eu1_1。的pdisplay构建转染hek293-6e细胞。1×105细胞在2％bsa-pbs中在冰上阻断30min，然后分别用500nm生物素化人egfrfc、生物素化人her2/neufc和生物素化小鼠egfrfc在2％bsa-pbs冰上染色30min。在300克、5分钟4℃离心后，用链球菌亲和素alexaflo647(thermoscience)检测抗原结合情况，在冰上稀释1：100030min。然后在300g、5min、4℃下离心细胞，并在200μl冰冷pbs中重新悬浮。用抗c-myc抗体(a-14，sc789，santacruz)在2％bsa-pbs中10μg/ml和抗兔(h+l)抗体结合alexaflo488(热科学)的抗兔抗体(h+l)在冰上稀释30min，对诱导培养物进行染色。用番石榴红细胞流式细胞仪测定荧光。抗egfr克隆仅与同源抗原结合，而与人fc和her2/neufc蛋白无结合(表12)。egfr反应克隆与小鼠egfr交叉反应(表12)。表12在表位定位实验中，300nm抗原溶液与3倍摩尔过量的经验证的抗egfr抗体西妥昔单抗一起孵育(lietal.，cancercell7(4)，301-311(2005))。doi：10.1016/j.ccr.2005.03.003)和matuzumab(schmiedel等人，《癌细胞》13(4)，365-373(2008)。doi：10.1016/j.ccr.2008.02.019.2005)或市售人igg-kappa同种型抗体(sigma-aldrich)，然后用于突变cd81-lel显示细胞的染色。经验证的抗体在室温下与抗原在2％bsa-pbs中结合30分钟，然后用该溶液对cd81lel突变显示细胞进行染色。用链霉亲和素alexafluor647进行检测，在2％bsa-pbs中以1：1000稀释，冰上30分钟。记录显示细胞的mfi值。数据表明l2b_eu1_1克隆的结合位点与西妥昔单抗抗体的结合位点重叠(表13)。在马珠单抗抗体过量的情况下，l2b泳eu1泳1仍能与抗原结合。表1316.4cd81lel基egfr结合物改性环的再随机化本实验的目的是将egfr结合突变体中突变的残基序列重新随机化，并表明克隆的结合依赖于在亲本克隆中随机化引入抗原结合位点的两段多肽链上的氨基酸残基。使用一次突变引物lib2fwd(seqidno：98)产生用于重组的pcr片段，该引物将螺旋a中的突变残基和文库l2be1_a中的ab环随机化，一旦突变引物lib2rev2(seqidno：99)随机化了库l2be1\ub中螺旋c中的突变残基，用q5高保真聚合酶(新英格兰生物实验室)产生pcr片段。对于文库l2be1泳，引物lib2fwd与引物ap2(seqidno：104)一起使用；对于文库l2be1泳，引物lib2rev2(seqidno99)与引物ap1(seqidno：105)一起使用。seqidno：104：cttgaagaggttgctgatseqidno：105：aaggatgtgaagcagttc将每个重组片段与bamhi/hindiii线性化受体载体pyd1一起转化，利用克隆的cd81-lel\u-dellbamdelhind\u-bamhind序列将其化学转化为酿酒酵母eby100。使用35μg线性化载体和25μgpcr片段构建文库。文库大小分别为8.4x106个独立成员和1.18x107个独立成员，用抗xpress标签抗体检测，然后用山羊抗小鼠(fab’)2-fitc(sigma-aldrich)孵育，并通过用抗v5-fitc抗体检测c末端v5标签来确定所显示蛋白质的正确阅读框(thermoscientific)。在500nm处用人egfr-fc染色并用山羊抗人γ链-pe结合物(sigma-aldrich)检测后，测定每个文库的抗原结合细胞百分比。表14列出了库中阳性细胞的百分比以及亲本克隆的特征值。两个靶区突变残基的重新随机化导致抗原阳性克隆的数量减少，这意味着两个随机化片段中的氨基酸残基都有助于抗原结合。样本l2be1_1l2be1_al2be1_b染色阳性细胞百分比(％)第一步第二步人egfr-fc羊抗人γ-pe61.7715.7715.55未染色羊抗人γ-pe6.166.706.91抗xpress羊抗小鼠(fab’)2-fitc75.1765.8460.67未染色羊抗小鼠(fab’)2-fitc1.530.840.48未染色抗v5-tag-fitc83.6473.3762.73未染色未染色2.301.101.20表14实施例17：基于cd81-lel的人胎盘层粘连蛋白结合物17.1人层粘连蛋白cd81-lel文库l2和l3的筛选人层粘连蛋白购自sigma-aldrich。对于生物素化，在4℃下将抗原与100倍体积的pbs透析过夜后，以3：1的摩尔比使用ez-linktmsulfonhslc生物素试剂(thermoscientific)。在室温下用生物素化试剂进行1小时的摇动培养。使用snakeskin透析管(thermoscientific)和10.000damwco，在4℃下搅拌过夜，用100倍体积的pbs透析去除未结合的生物素。为了进行分类，首先将文库2a、2b、3a和3b在添加青霉素链霉素的sd-caa培养基中摇瓶过夜培养，然后将酵母细胞在含有青霉素链霉素的sg/r-caa培养基中复悬并在37℃摇瓶过夜，诱导重组蛋白的表达。对于macs，将109个诱导的酵母细胞在1000g下造粒5min，并通过在50ml洗涤缓冲液(pbs，ph7.2，0.25％bsa，2mmedta)，并在1000g下再次造粒5min。将洗涤后的细胞重新悬浮在含有1μm生物素化抗原的5ml洗涤缓冲液中，并在室温下温和搅拌培养30min。加入10ml冰冷洗涤缓冲液使抗原结合猝灭，细胞和抗原溶液在1000g和4℃下造粒5min。将细胞重新悬浮在5ml洗涤缓冲液和25μl链霉亲和素微球(μmacs链霉亲和素试剂盒，macsmiltenyi)中，并在冰上培养10min。最后，加入15ml洗涤缓冲液细胞悬浮液通过40μm的过滤器过滤。将ls柱(macs-miltenyi)置于分离器中，用3ml洗涤缓冲液对柱进行预处理。然后，将细胞溶液分批装入7毫升。一旦柱停止滴落，它被短暂地从磁铁上取下并放回磁铁中，以重新定位柱中的珠子，使被捕获的细胞流过。在装入下一个7ml细胞悬液之前，向柱上施加1ml洗涤缓冲液。重复这些步骤，直到所有细胞都被加载。然后，用3毫升洗涤缓冲液洗涤柱，从磁铁上短暂取出，再用3毫升洗涤缓冲液再次洗涤。为了洗脱结合细胞，将柱从磁体上移除，并添加5ml洗涤缓冲液。使用提供的柱塞，细胞被推过色谱柱进入一个新的试管。将结合细胞部分在2500g下造粒10分钟。将颗粒重新悬浮在10mlsd-caa培养基中，将10μl洗脱细胞在990μlsd-caa中稀释，并将100μl接种在mdl平板上，在30℃下培养3天以估计macs程序的产量，剩余细胞在30℃和180℃下培养一夜之间。在随后的facs选择轮中，将诱导的细胞悬浮液稀释至每1ml10％bsa-pbs108个细胞，并在20℃下以3000rpm离心5分钟。为了阻断细胞，将颗粒重新悬浮在1ml10％bsa-pbs中，并在20℃下在旋转平台上培养30分钟。细胞在20℃下以3000rpm离心5分钟，并在250μl10％bsa-pbs(含1μm生物素化层粘连蛋白)中再悬浮。在旋转平台上于20℃孵育1h后，将细胞在4℃以3000rpm离心5min。为了洗涤细胞，将颗粒再悬浮于1ml冰冷pbs中并在4℃以3000rpm离心5min。然后，将细胞再悬浮于250μl10％bsa-pbs中，使用链霉亲和素alexafluor647(1：800)和抗v5fitc抗体(1：100)并在冰上培养30分钟。细胞在4℃下以3000rpm离心5分钟，再悬浮在250μl冰冷pbs中，并保持在冰上，直到使用sonycellsorter进行分类。至少处理前一轮分选的20倍产量，并收集0.1％的顶级抗v5抗体阳性酵母细胞。在可见富集后，将这些种类的酵母进行平板培养，以鉴定单个酵母展示克隆。对于一些富集的种类，使用100nm抗原进行额外的选择。17.2在哺乳动物细胞中的表达利用寡核苷酸序列cd81hnhe1(seqidno：106)和lelp28bste2(seqidno：107)扩增并克隆在哺乳动物表达载体ptt28的nhei和bsteii位点之间的独特结合序列，并且使用sanger测序验证构建体的序列。seqidno：106：acgtgctagctttgtcaacaaggaccagatcseqidno：107：acgtggtgaccggtgctggaacccttcccggagaagaggtc重组蛋白完全按照制造商的指示在hek293-6e中表达。25ml培养物的上清液在4℃下以3500rpm离心15min，用pbs和20mm咪唑缓冲并通过0.45-μm过滤器过滤，然后装入1-ml-hisexcel柱(gehealthcare)，用pbs/20mm咪唑平衡，ph7.5。然后用相同的缓冲液洗涤柱，并用20-500mm咪唑在ph7.5的pbs中以5个柱体积梯度洗脱his标记的蛋白质。用sds-page和考马斯染色分析组分4-6是否存在洗脱蛋白。以下突变体的表达可被证实：l2a_lu1(seqid108)、l2a_lu1_1(seqid109)、l2b_lu1(seqid110)、l3b_lu1_2(seqid111)。与亲本克隆不同的残留物以粗体打印。seqidno：108：l2a_lu1：fvnkdqiakdvkqfydqalreccntfdannacavvktfhetldccgsstthsstgcvlffnlcpsgsniisnlfkedchqkiddlfsgkseqidno：109：l2a_lu1_1：fvnkdqiakdvkqfydqalmicchrhyannacavvktfhetldccgsstpssttpcvlqnnlcpsgsniisnlfkedchqkiddlfsgkseqidno：110：l2b_lu1：fvnkdqiakdvkqfydqalvfccfgghannacavvktfhetldccgssthpyktkcvlqrnlcpsgsniisnlfkedchqkiddlfsgkseqidno：111：l3b_lu1_2：fvnkdqiakdvkqfydqclkyackqgdwenakacvktfhetldccgsstvanmtrcvlpanlcpsgsniisnlfkedchqkiddlfsgk17.3可溶性抗原结合整洁的洗脱蛋白进行了测试，结合其同源抗原和牛血清白蛋白作为对照抗原。链霉亲和素活化板(固定化剂，nunc)用生物素化层粘连蛋白(5μg/ml)在pbs中包被30分钟，并在rt时用4％bsa-pbs封闭1小时。将洗脱的蛋白质加入2％bsa-pbs中，并在rt时使其结合1小时。用pbs洗涤三步后，用1：3000稀释的抗pentahis抗体hrp结合物(qiagen)在2％bsa-pbs中检测结合30分钟，并在添加tmb(sigma-aldrich)后显示。通过添加h2so4停止反应，并在450/620nm处读取吸光度(表15)。3个层粘连蛋白特异性克隆：l2a_lu1、l2b_lu1和l3b_lu1_2与目标蛋白具有特异性反应。表1517.4层粘连蛋白在哺乳动物细胞展示系统中的表达在pdisplay载体(thermoscientific)的sfii和sali限制性位点之间克隆层粘连蛋白结合克隆的序列。该显示系统允许在n-末端ha-tag和c-末端c-myc-tag之间表达c-末端锚定蛋白。构建体转染hek293-6e细胞(cnrc)。48或72小时后收获细胞，在冰上4％bsa-pbs中封闭30分钟，并用4％bsa-pbs中10μg/ml的抗c-myc抗体(a-14，sc789，santacruz)在冰上染色30分钟。二级抗兔(h+l)抗体与alexafluor488(thermoscientifica11034)结合，在4％bsa-pbs中稀释1：1000，在冰上孵育30分钟后检测其结合。用生物素化的人层粘连蛋白在500nm处孵育，并用链霉亲和素alexafluor647在4％bsa-pbs中以1：1000检测抗原反应性。然后将细胞重新悬浮在pbs中并保持在冰上，直到用番石榴易细胞流式细胞仪(merckmillipore)进行分析。对于所有被测克隆，可检测到哺乳动物细胞表面的显示(表16)。对于9个克隆，可以建立与重组抗原的反应性(表16)。表16*对于l3a_lu1克隆，使用neutravidinpe(thermoscientific)作为二级试剂。已发现克隆的序列为：l3a_lu1(seqidno：112)、l2b_lu1_1(seqidno：113)、81l1(seqidno：110，与l2b_lu1相同)、81l_13(seqidno：114)、81l_17(seqidno：115)、81l_21(seqidno：116)。与亲本克隆不同的残留物以粗体打印。seqidno：112：fvnkdqiakdvkqfydqcllwacskrykynakacvktfhetldccgsstmgnltecvlienlcpsgsniisnlfkedchqkiddlfsgkseqidno：113：fvnkdqiakdvkqfydqalwkccnlsqannacavvktfhetldccgsstylcatycvlwpnlcpsgsniisnlfkedchqkiddlfsgk81l_1(seqidno：110)：fvnkdqiakdvkqfydqalvfccfgghannacavvktfhetldccgssthpyktkcvlqrnlcpsgsniisnlfkedchqkiddlfsgkseqidno：114：fvnkdqiakdvkqfydqclswacnrkyepnakacvktfhetldccgsstkanythcvlemnlcpsgsniisnlfkedchqkiddlfsgkseqidno：115：fvnkdqiakdvkqfydqclrhacsglsgrnakacvktfhetldccgsstikhktlcvliknlcpsgsniisnlfkedchqkiddlfsgkseqidno：116：fvnkdqiakdvkqfydqalficcfrryannacavvktfhetldccgsstrnnetacvlaknlcpsgsniisnlfkedchqkiddlfsgk实施例18在ev表面表达的抗层粘连蛋白cd81突变体18.1制备ev用野生型cd81或cd81，用与l2a_ulu1(seqidno：12)或l3b_u1_2；2(seqidno：15)序列相对应的修饰lel，将hela细胞引入pbmn表达载体，并与egfp框架进行克隆。将经导入的hela细胞在rpmi(10％fcs，4mml-谷氨酰胺)中的融合处，制备细胞外小泡(evs)。在光学sfm中，改变培养基，ev采集72-96小时。细胞培养上清液在3000克离心30min，以去除细胞和细胞碎片。通过0.45μm醋酸纤维素过滤器过滤上清液，排除较大颗粒。最终，用120000g超离心法制备ev90分钟，并在活细胞成像溶液中重新悬浮(thermoscience)。利用人cd9捕获珠进行流式细胞术检测(免疫测试)，验证了含有cd81egfp融合的重组evs。18.2竞争试验显示evs表面表达的抗层粘连蛋白cd81突变体的特异性抗原结合5x109重组ev携带野生型cd81egfp和相应的层粘连蛋白靶向变异体l2a_lu1和l3b_lu1_2，与6x103cd9+捕获珠一起培养过夜。将5μg/ml生物素化的人胎盘层粘连蛋白添加到珠子中，并且在一些平行样品中添加15μg/ml未标记的层粘连蛋白用于竞争。用中和蛋白pe(1：800)检测ev结合层粘连蛋白。背景(bg)荧光仅用中性亲和素pe染色测定。egfp在488nm处有荧光，pe在561nm处有荧光。对于两个层粘连蛋白结合的cd81突变体，都显示出与靶抗原的特异性结合，而野生型cd81则没有观察到这种结合。此外，未标记层粘连蛋白标记的蛋白质的竞争导致指示特异性结合的信号减少(表17)。表1718.3以evs为靶向层粘连蛋白的肝癌细胞株huh7的摄取2.4x、1.6x和0.8x1010重组evs，其中含有cd81egfp及其靶向变异体，用0.4x-106huh7细胞孵育3h。细胞在100μlpbs中进行色氨化、中和和再活化。流式细胞术检测egfp阳性evs细胞的摄取水平，测定主要人群(通过fsc/ssc门控)的mfi值。表18中，单个ev的结果的生物三倍，标准化为cd81野生型egfp的mfimax，显示出2-3倍的层粘连蛋白靶向ev的摄取量。表18在另一个实验中，对不同批次的靶向ev的层粘连蛋白在肝癌细胞系huh7中的摄取进行了复制。对3个独立的ev批次进行重复试验，并将其标准化为mfimax。将含有cd81-egfp或各自靶向变异体的2.4x1010重组evs与0.4x106huh7细胞孵育3小时。对细胞进行胰蛋白酶消化、中和并在120μlpbs中再悬浮。采用流式细胞术检测egfp阳性ev细胞的摄取水平，并测定主要人群(通过fsc/ssc门控)的mfi值。将这些值标准化为mfi最大值。表19给出了重复数据的平均值和标准偏差。层粘连蛋白结合cd81过度表达的ev显示出更高的对huh7细胞的摄取。ev批次构建体平均％mfimaxst.dev.％mfimax批次icd81野生型-egfp29.09978170.38828317l2a_lu1-egfp95.08267814.91732192l3b_lu1-2-egfp75.56682851.66717452批次iicd81野生型-egfp40.86144630.03708697l2a_lu1-egfp96.5838033.41619699l3b_lu1-2-egfp71.16555951.82037455批次iiicd81野生型-egfp57.58877190.6223537l2a_lu1-egfp99.39620270.60379729l3b_lu1-2-egfp93.56511612.95038121表19实施例19基于cd81lel的人her2/neu结合物19.1用人her2/neu筛选cd81lel文库l2a和l2b人her2/neu-fc购自中国生物。对于生物素化，使用ez-linktmsulfonhslc生物素试剂(thermoscientific)，生物素与蛋白质的摩尔比为3：1。用生物素化试剂在室温下摇动培养1h。使用snakeskin透析管(thermoscientific)和10.000damwco，在4℃下搅拌过夜，用100倍体积的pbs透析去除未结合的生物素，并将标记抗原的等分样品储存在-80℃下，直到进一步使用。为了进行分类，首先将文库2a和2b在添加青霉素链霉素的sd-caa培养基中于30℃振荡过夜培养，然后将酵母细胞在含有青霉素链霉素的sg/r-caa培养基中复悬并于37℃振荡过夜，诱导重组蛋白的表达。对于macs，将4x109诱导的酵母细胞在1000g下造粒5min，并在10％bsa-pbs中封闭，在室温下在旋转轮上停留30min。细胞被造粒并重新悬浮在含有0.5μm生物素化抗原的10％bsa-pbs中，并在室温下在旋转轮上培养30分钟。加入10倍体积的冰冷pbs使抗原结合猝灭，并在1000g和4℃下将细胞造粒5min。将细胞重新悬浮在5ml洗涤缓冲液中加200μl链霉亲和素微球(macsmiltenyi)并在冰上培养15min。最后，在pbs中加入15mlmacs洗涤缓冲液(0.5％bsa，2mmedta)；ph值7.4)。细胞悬浮液通过40μm细胞过滤器过滤。将ls柱(macs-miltenyi)置于分离器中，用3ml洗涤缓冲液对柱进行预处理。然后，将细胞溶液分批装入7毫升。一旦柱停止滴落，它被短暂地从磁铁上取下并放回磁铁中，以重新定位柱中的珠子，使被捕获的细胞流过。在装入下一个7ml细胞悬液之前，向柱上施加1ml洗涤缓冲液。重复这些步骤，直到所有细胞都被加载。然后，用5ml洗涤缓冲液洗涤柱三次。为了洗脱结合细胞，将柱从磁体上移除，并添加5ml洗涤缓冲液。使用提供的柱塞，细胞被推过色谱柱进入一个新的试管。将结合细胞部分在2500g下造粒10min。将颗粒重新悬浮于10mlsd-caa培养基中，将10μl洗脱细胞在990μlsd-caa中稀释，并将100μl接种于mdl平板上，在30℃下培养三天以估计macs程序的产量，剩余细胞在30℃和180℃下培养一夜。在随后的facs选择轮中，将诱导的细胞悬浮液稀释至每1ml10％bsa-pbs108个细胞，并在20℃下以3000rpm离心5分钟。为了阻断细胞，将颗粒重新悬浮在1ml10％bsa-pbs中，并在20℃下在旋转平台上培养30分钟。将细胞在20℃下以3000rpm离心5分钟，并在含有0.5μm生物素化her2/neufc的150μl10％bsa-pbs中再悬浮。室温下在旋转平台上孵育1h后，加入1ml冷pbs使抗原结合猝灭。将细胞在4℃下以3000rpm离心5分钟，并用链霉亲和素alexafluor647(thermofisherscientific)(1：800)和抗v5fitc抗体(thermoscientific)(1：100)在800μl10％bsa-pbs中重新悬浮，并在冰上培养30分钟。细胞在4℃下以3000rpm离心5分钟，在250μl冰冷pbs中再悬浮，并保持在冰上，直到使用sonysh8000分选仪进行分选。至少处理前一轮分选的20倍产量，并收集0.1％的顶级抗v5抗体阳性酵母细胞。对富集池进行五轮筛选，筛选出单个酵母克隆。将5个序列克隆到pdisplay表达载体上，在hek293-6e细胞中表达，并检测其与人her2/neu的结合。48或72小时后收获细胞，在冰上4％bsa-pbs中封闭30分钟，并用4％bsa-pbs中10μg/ml的抗c-myc抗体(a-14，sc789，santacruz)在冰上染色30分钟。二级抗兔(h+l)抗体与alexafluor488(thermoscientifica11034)结合，在4％bsa-pbs中稀释1：1000，在冰上孵育30分钟后检测其结合。抗原反应性在与生物素化的人her2/neu/fc以2倍稀释系列(从300nm开始)孵育后测定，并在4％bsa-pbs中以1：1000用链霉亲和素alexafluor647检测。然后将细胞重新悬浮在pbs中并保持在冰上，直到用番石榴易细胞流式细胞仪(merckmillipore)进行分析。克隆81_h2_11(seqidno：117)可特异性结合人类her2/neu蛋白(表20)。与亲本克隆不同的残留物以粗体打印。seqidno：117：fvnkdqiakdvkqfydqalvnccytraannacavvktfhetldccgssthyvdthcvlnrnlcpsgsniisnlfkedchqkiddlfsgkev批次构建体平均％mfimaxst.dev.％mfimax批次icd81野生型-egfp29.09978170.38828317l2a_lu1-egfp95.08267814.91732192l3b_lu1-2-egfp75.56682851.66717452批次iicd81野生型-egfp40.86144630.03708697l2a_lu1-egfp96.5838033.41619699l3b_lu1-2-egfp71.16555951.82037455批次iiicd81野生型-egfp57.58877190.6223537l2a_lu1-egfp99.39620270.60379729l3b_lu1-2-egfp93.56511612.95038121表2019.2基于cd81lel的her2/neu结合物的特异性表征用编码野生型cd81-lel和抗her2/neu定向cd81-81h2-11的pdisplay结构转染hek293-6e细胞。1×105细胞在2％bsa-pbs中在冰上阻断30min，然后分别用500nm生物素化人egfrfc、生物素化人her2/neufc和生物素化小鼠egfrfc在2％bsa-pbs冰上染色30min。在300克、5分钟4℃离心后，用链球菌亲和素alexaflo647检测抗原结合情况，在冰上稀释1：100030min。然后在300g、5min、4℃下离心细胞，并重新悬浮在200μl冰冷pbs中。用抗c-myc抗体(a-14，sc789，santacruz)在2％bsa-pbs中10μg/ml和抗兔(h+l)抗体结合alexaflo488(thermosciencea11034)的抗兔(h+l)抗体在2％bsa-pbs中稀释30min，对诱导培养物进行染色，测定显示。用番石榴红细胞流式细胞仪测定荧光。抗her2/neu克隆仅与同源抗原结合(表21)。表21实施例20：人cd9lel的稳定20.1稳定cd9lel突变体的设计与施工对全长人cd9序列的genbank条目进行识别，并进行blast比较，以划定lel区域边界。按照seignuret，2006中的定义，使用swismodel(waterhouse等人，2018)和cd81lel进行cd9lel区域的同源建模pdb：1iv5as提出了最接近的模型。所得结构与cd81-lel晶体结构1g8q相一致，rmsd为0.413炣。利用寡核苷酸cd9hnhe1(序列idno：119)和cd9p28_bst2(序列id编号：120)在ptt28载体(cnrc)的nhei和bsteii克隆位点之间克隆cd9lel(序列idno：118)。seqidno：118：hkdevikevqefykdtynklktkdepqretlkaihyalnccglaggveqfisdicpkkdvletftvkscpdaikevfdnkseqidno：119：acgtgctagccacaaggatgaggtgattaagseqidno：120：acgtggtgaccggtgctggaacctttattgtcgaagacctc根据制造商的说明，采用寡核苷酸cd9_20c(seqidno：121)和cd9ca(seqidno：122)和cd9c(seqidno：123)和cd9ca(seqidno：124)的说明，用quickchangelightning诱变试剂盒(agilent)替换位置20和28处的氨基酸，以生产一种稳定的cd9lel_20_u28，氨基酸序列如中所示(序列idno：125)。seqidno：121：gacacctacaacaagtgcaaaaccaaggatgagseqidno：122：ctcatccttggttttgcacttgttgtaggtgtcseqidno：123：aaggatgagccccagtgtgaaacgctgaaagccseqidno：124：ggctttcagcgtttcacactggggctcatccttseqidno：125：hkdevikevqefykdtynkcktkdepqcetlkaihyalnccglaggveqfisdicpkkdvletftvkscpdaikevfdnkcd9lel和cd9lelu28分别在expico系统中按照制造商的指示，按照maxstitr协议表达，并分别在35mg/l上清液中用一步ni-nta亲和层析纯化。纯化蛋白用sds-page分析，均为单体。用差示扫描量热法(dsc)测定了热稳定性。野生型蛋白的熔点为52.7℃，稳定型20-28在81.9℃下，表明稳定成功。20.2cd9lel酵母展示文库的构建20.2.1野生型cd9lel的酵母展示在pyd1载体的bamhi和noti克隆位点之间，使用寡核苷酸cd9ydbam1(seqidno：126)和cd9ydnot2(seqidno：127)克隆cd9lel的序列，并且使用化学转化将构建物转化到酿酒酵母。seqidno：126：acgtggatcccacaaggatgaggtgattaagseqidno：127：acgtgcggccgcgctttattgtcgaagacctc在mdl平板上选择转化子，在30℃的sd-caa中培养，在20℃下诱导48小时，在37℃下诱导24小时。随后通过n-末端标签通过1：2000稀释的抗xpress标签抗体(thermoscientific)检测酵母表面显示蛋白，随后与山羊抗小鼠(fab')2-alexa-fluor555(thermoscientific)在1：1000下孵育，并通过在1：200下检测具有抗hisalexa-fluor488抗体(qiagen)的c末端his标签和在1：100下检测具有抗v5-fitc抗体的c末端v5标签来确定所显示蛋白质的正确阅读框(thermoscientific)，均为2％bsa-pbs。此外，在酵母细胞首先与10μg/ml抗体在2％bsa-pbs中孵育并检测与山羊抗小鼠(fab')2-alexafluor555(thermoscientific)在2％bsa-pbs中以1：1000稀释后的结合后，测定与抗cd9特异性抗体mem-61(thermoscientific)的反应性。在200μl冰冷pbs中再悬浮后，用番石榴easyflow流式细胞仪测定阳性酵母细胞的百分比(表22)。表2220.2.2cd9lel突变设计结合克隆用寡核苷酸cd9pforec1(seqidno：128)突变cd9lel_20_28序列的残基18-19、21-25和27，该寡核苷酸与寡核苷酸cd9notrec2(seqidno：129)结合以产生pcr重组片段。seqidno：128：cacaaggatgaggtgattaaggaagtccaggagttttacaaggacacctacnnknnktgcnnknnknnknnknnkcccnnktgtgaaacgctgaaagcc其中n为a、c、g或t中的任意一个。seqidno：129：cttcgaagggccctctagactcgagcggccgcgctttattgtcgaagacctc将该片段与载体pyd1cd9(用酶pfoi和noti线性化)一起用于转化酿酒酵母eby100。通过一轮基于macs的选择和多轮基于facs的选择，最终选择大小为1x108个独立成员的文库作为含有人egfr-fc的结合物，直到获得丰富的结合克隆。将所述结合物序列重新连接到哺乳动物pdisplay载体和所得质粒，所述质粒用于转染hek293-6e细胞。48-72小时后，收集细胞并用抗原和二级试剂染色以检测特异性结合克隆。参考文献1.kalra，h.；drummen，g.p.；mathivanan，s.focusonextracellularvesicles：introducingthenextsmallbigthing.intjmolsci2016，17(2)，170，10.3390/ijms17020170.2.iraci，n.；leonardi，t.；gessler，f.；vega，b.；pluchino，s.focusonextracellularvesicles：physiologicalroleandsignallingpropertiesofextracellularmembranevesicles.intjmolsci2016，17(2)，171，10.3390/ijms17020171.3.luan，x.；sansanaphongpricha，k.；myers，i.；chen，h.；yuan，h.；sun，d.engineeringexosomesasrefinedbiologicalnanoplatformsfordrugdelivery.actapharmacolsin2017，38(6)，754-763，10.1038/aps.2017.12.4.tian，t.；zhu，y.l.；zhou，y.y.；liang，g.f.；wang，y.y.：hu，f.h.：xiao，z.d.exosomeuptakethroughclathrin-mediatedendocytosisandmacropinocytosisandmediatingmir-21delivery.jbiolchem2014，289(32)，22258-67，10.1074/jbc.m114.588046.5.elandaloussi，s.；lakhal，s.；mager，i.；wood，m.j.exosomesfortargetedsirnadeliveryacrossbiologicalbarriers.advdrugdelivrev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道蛋白。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述四跨膜样蛋白是四跨膜蛋白，优选地选自由以下物质组成的组：a)cd81，其包含鉴定为seqidno:87的氨基酸序列；b)cd9，其包含鉴定为seqidno:89的氨基酸序列；c)cd53，其包含鉴定为seqidno:90的氨基酸序列；d)tspan32，其包含鉴定为seqidno:91的氨基酸序列；e)cd82，其包含鉴定为seqidno:92的氨基酸序列；f)cd63，其包含鉴定为seqidno:93的氨基酸序列；g)cd151，其包含鉴定为seqidno:94的氨基酸序列；以及h)cd37，其包含鉴定为seqidno:95的氨基酸序列或者其中所述四跨膜样蛋白是溶酶体相关膜蛋白，优选地，lamp2包含鉴定为seqidno:96的氨基酸序列。7.根据权利要求1-6中任意一项所述的方法，其中所述野生型ed是以下中的任意一种：a)cd81，其中所述ed包含鉴定为seqidno:130或seqidno:131的氨基酸序列中的任意一种；b)cd9，其中所述ed包含鉴定为seqidno:132、seqidno:182或seqidno:133的氨基酸序列中的任意一种；c)cd53，其中所述ed包含鉴定为seqidno:134或seqidno:135的氨基酸序列中的任意一种；d)tspan32，其中所述ed包含鉴定为seqidno:136或seqidno:137的氨基酸序列中的任意一种；e)cd82，其中所述ed包含鉴定为seqidno:138或seqidno:139的氨基酸序列中的任意一种；f)cd63，其中所述ed包含鉴定为seqidno:140或seqidno:141的氨基酸序列中的任意一种；g)cd151，其中所述ed包含鉴定为seqidno:142或seqidno:143的氨基酸序列中的任意一种；h)cd37，其中所述ed包含鉴定为seqidno:144或seqidno:145的氨基酸序列中的任意一种；或者i)lamp2，其中所述ed包含鉴定为seqidno:146的氨基酸序列。8.根据权利要求1-7中任意一项所述的方法，其中所述蛋白质在ed氨基酸序列中包含环状结构，所述环状结构在一种或多种半胱氨酸的位置稳定，以允许形成一种或多种二硫键。9.根据权利要求1-8中任意一项所述的方法，其中所述修饰区位于所述ed的环状区内。10.根据权利要求1-9中任意一项所述的方法，其中所述ed是a)cd81，所述氨基酸序列经修饰引入半胱氨酸以允许形成野生型ed序列中非天然存在的一种或多种二硫键，优选地在位置134与144和/或130和146和/或135和168之间，其中人cd81的编号鉴定为seqidno:87，或者b)cd9，所述氨基酸序列经修饰引入半胱氨酸以允许形成野生型ed序列中非天然存在的一种或多种二硫键，优选地在位置20与28之间，其中所述位置的编号是cd9大细胞外环(lel，seqidno:118)。11.根据权利要求1-10中任意一项所述的方法，其中所述ed是cd81，所述修饰区的其中之一位于位置160和172内，其中人cd81的编号鉴定为seqidno:187。12.根据权利要求11所述的方法，其中所述ted包含位于位置132与141之间或位置180与189之间的至少一个另外的结合区，其中人cd81的编号鉴定为seqidno:87。13.根据权利要求1-10中任意一项所述的方法，其中所述ed是cd9，修饰区位于位置155～166、位置128～142、位置130～140或位置169～180中的位置内，其中人cd9的编号鉴定为seqidno:89。14.根据权利要求1-13中任意一项所述的方法，其中所述靶选自由以下物质组成的组：细胞靶，优选有丝分裂受体、细胞因子受体、唾液糖蛋白受体、膜转运蛋白、脂蛋白、脂糖、糖蛋白、蛋白聚糖、或脱细胞靶，优选细胞因子、人工蛋白或人工表面结构。15.根据权利要求1-14中任意一项所述的方法，其中所述包含ted的蛋白质是包含所述ted和至少一个跨膜结构域的靶特异性ev表面蛋白(tsp)。16.根据权利要求15所述的方法，其中所述跨膜结构域与源自哺乳动物ev表面蛋白的跨膜结构域有至少70％的序列同一性。17.根据权利要求15或16所述的方法，其中所述跨膜结构域是以下中的任意一种：a)cd81，其中所述跨膜结构域包含鉴定为seqidno:147、seqidno:148、seqidno:149或seqidno:150的氨基酸序列中的任意一种；b)cd9，其中所述跨膜结构域包含鉴定为seqidno:151、seqidno:152、seqidno:153或seqidno:154的氨基酸序列中的任意一种；c)cd53，其中所述跨膜结构域包含鉴定为seqidno:155、seqidno:156、seqidno:157或seqidno:158的氨基酸序列中的任意一种；d)tspan32，其中所述跨膜结构域包含鉴定为seqidno:159、seqidno:160、seqidno:161或seqidno:162的氨基酸序列中的任意一种；e)cd82，其中所述跨膜结构域包含鉴定为seqidno:163、seqidno:164、seqidno:165或seqidno:166的氨基酸序列中的任意一种；f)cd63，其中所述跨膜结构域包含鉴定为seqidno:167、seqidno:168、seqidno:169或seqidno:170的氨基酸序列中的任意一种；g)cd151，其中所述跨膜结构域包含鉴定为seqidno:171、seqidno:172、seqidno:173或seqidno:174的氨基酸序列中的任意一种；h)cd37，其中所述跨膜结构域包含鉴定为seqidno:175、seqidno:176、seqidno:177或seqidno:178的氨基酸序列中的任意一种；或者i)lamp2，其中所述跨膜结构域包含鉴定为seqidno:179的氨基酸序列。18.根据权利要求15-17中任意一项所述的方法，其中所述ed和所述跨膜结构域都源自相同的ev表面蛋白，优选地，其中所述ev表面蛋白选自由以下物质组成的组：a)cd81，其包含鉴定为seqidno:87的氨基酸序列；b)cd9，其包含鉴定为seqidno:89的氨基酸序列；c)cd53，其包含鉴定为seqidno:90的氨基酸序列；d)tspan32，其包含鉴定为seqidno:91的氨基酸序列；e)cd82，其包含鉴定为seqidno:92的氨基酸序列；f)cd63，其包含鉴定为seqidno:93的氨基酸序列；g)cd151，其包含鉴定为seqidno:94的氨基酸序列；h)cd37，其包含鉴定为seqidno:95的氨基酸序列；以及i)lamp2，其包含鉴定为seqidno:96的氨基酸序列。19.一种生产靶特异性胞外囊泡(tev)制剂的方法，包括：a)提供编码包含由权利要求1-18中任意一项所述的方法获得的ted的蛋白质的多核苷酸；b)将所述多核苷酸引入至源细胞或源细胞混合物中；b)在产生胞外囊泡的条件下培养所述细胞；c)分离包含tev的部分，所述tev包含ted的靶结合位点；以及d)生产包含在所述部分中的tev的制剂。20.根据权利要求19所述的方法，其中在方法步骤a)中，所述多核苷酸编码蛋白质，所述蛋白质是包含所述ted和至少一个跨膜结构域的靶特异性ev表面蛋白(tsp)，在方法步骤c)中，所述部分是分离的，包含所述tev在囊泡膜的外表面展示靶结合位点。21.根据权利要求19或20所述的方法，其进一步包含用囊泡外负荷加载tev，其中所述负荷包含以下中的任意一种或多种：肽、多肽、蛋白结构域、蛋白质、脂类、基因、核酸(如mrna、mirna)、rnai介导分子(尤其是锁定的核酸或硫代磷酸酯)、dna、dna片段、质粒(如微环dna)、药物(如小分子，尤其是化疗剂或解衰老剂)。22.根据权利要求19-21中任意一项所述的方法，其中所述源细胞或源细胞混合物源自真核或原核来源，优选地是身体组织、体液或细胞培养物。23.根据权利要求19-22中任意一项所述的方法，其中所述源细胞或源细胞混合物从受试者中获得，所述tev制剂是为自体使用而配制的。24.一种由权利要求23所述的方法生产的自体tev制剂的方法，其中所述源细胞或源细胞混合物从受试者中获得并且所述tev制剂是为同一受试者自体使用而配制的。25.一种由权利要求20-24中任意一项所述的方法获得的tev制剂。26.一种蛋白质，所述蛋白质包含由权利要求1-18中任意一项所述的方法获得的胞外囊泡(ev)表面蛋白的靶特异性囊泡外结构域(ted)。27.一种胞外囊泡(ev)表面蛋白的靶特异性囊泡外结构域(ted)，所述靶特异性囊泡外结构域与哺乳动物ev表面蛋白序列的野生型囊泡外结构域(ed)有至少70％的序列同一性，所述胞外囊泡(ev)表面蛋白的靶特异性囊泡外结构域包含人工靶结合位点，所述人工靶结合位点包含至少两个长度为3～20个连续氨基酸的修饰区，所述修饰区在其n末端和c末端的野生型ed序列的区域两侧；其中所述ed来自四跨膜蛋白，所述四跨膜蛋白选自由以下物质组成的组：a)cd81，其包含鉴定为seqidno:87的氨基酸序列；b)cd9，其包含鉴定为seqidno:89的氨基酸序列；c)cd53，其包含鉴定为seqidno:90的氨基酸序列；d)tspan32，其包含鉴定为seqidno:91的氨基酸序列；e)cd82，其包含鉴定为seqidno:92的氨基酸序列；f)cd63，其包含鉴定为seqidno:93的氨基酸序列；g)cd151，其包含鉴定为seqidno:94的氨基酸序列；以及h)cd37，其包含鉴定为seqidno:95的氨基酸序列或者其中ed来自lamp2，其包含鉴定为seqidno:96的氨基酸序列。28.一种靶特异性ev表面蛋白(tsp)，包含至少一个跨膜结构域和囊泡外结构域(ed)，所述囊泡外结构域(ed)与哺乳动物ev表面蛋白序列的野生型ed有至少70％的序列同一性，所述囊泡外结构域(ed)包含人工靶结合位点，所述人工靶结合位点包含至少两个长度为3～20个连续氨基酸的修饰区，所述修饰区在其n末端和c末端的野生型ed序列的区域两侧；其中所述ed来自四跨膜蛋白，所述四跨膜蛋白选自由以下物质组成的组：a)cd81，其包含鉴定为seqidno:87的氨基酸序列；b)cd9，其包含鉴定为seqidno:89的氨基酸序列；c)cd53，其包含鉴定为seqidno:90的氨基酸序列；d)tspan32，其包含鉴定为seqidno:91的氨基酸序列；e)cd82，其包含鉴定为seqidno:92的氨基酸序列；f)cd63，其包含鉴定为seqidno:93的氨基酸序列；g)cd151，其包含鉴定为seqidno:94的氨基酸序列；以及h)cd37，其包含鉴定为seqidno:95的氨基酸序列或者其中ed来自lamp2，其包含鉴定为seqidno:96的氨基酸序列。29.一种编码权利要求26所述的蛋白质、权利要求27所述的ted或权利要求28所述的tsp中任意一种的多核苷酸。30.一种靶特异性胞外囊泡(tev)，包含膜并且在所述膜的外表面展示靶特异性分子，其中所述靶特异性分子是权利要求26所述的蛋白质、权利要求27所述的ted或权利要求28所述的tsp中的任意一种。31.一种药物制剂，包含权利要求26所述的蛋白质、权利要求27所述的ted、权利要求28所述的tsp或权利要求25或30所述的tev中的任意一种和药学上可接受的载体，优选地在用于皮内、皮下、静脉、局部或口服使用的制剂。32.一种靶特异性胞外囊泡(tev)文库，包括多种权利要求30所述的至少102个tev，所述tev具有不同的靶特异性。33.一种产生靶特异性胞外囊泡(tev)文库的方法，包括：a)提供编码多种靶特异性ev表面蛋白(tsp)的多核苷酸库，每个tsp包含不同的靶结合位点；b)将所述库引入至所述源细胞中；以及b)分离包含每个具有不同靶结合特异性的靶特异性胞外囊泡(tev)的部分，产生tev文库，其中，多核苷酸的重现是通过诱变法修饰编码ev表面蛋白的多核苷酸而产生的，以工程化ev表面蛋白的在囊泡外结构域(ed)内的人工靶结合位点，所述人工靶结合位点包含至少两个经诱变处理修饰的区，每个区的长度为3～20个连续氨基酸，所述区在其n末端和c末端的野生型ed序列的区域两侧；其中所述ed来自四跨膜蛋白，所述四跨膜蛋白选自由以下物质组成的组：a)cd81，其包含鉴定为seqidno:87的氨基酸序列；b)cd9，其包含鉴定为seqidno:89的氨基酸序列；c)cd53，其包含鉴定为seqidno:90的氨基酸序列；d)tspan32，其包含鉴定为seqidno:91的氨基酸序列；e)cd82，其包含鉴定为seqidno:92的氨基酸序列；f)cd63，其包含鉴定为seqidno:93的氨基酸序列；g)cd151，其包含鉴定为seqidno:94的氨基酸序列；以及h)cd37，其包含鉴定为seqidno:95的氨基酸序列或者其中ed来自lamp2，其包含鉴定为seqidno:96的氨基酸序列。34.一种由权利要求33所述的方法获得的tev文库，优选地包含至少102个具有不同靶特异性的tev。说明或声明(按照条约第19条的修改)申请人对权利要求书进行了修改，以进一步规范主题。权利要求与国际检索报告中引用的现有技术不同,至少在特征上，靶结合位点包括至少两个修饰区，以提供新颖且优异的的靶结合物。当前第1页12