本发明描述了含有磷脂和ω-3脂肪酸盐的组合物，以脂质体形式制备这样的组合物的配制剂和方法，以及它们的应用。
已知ω-3脂肪酸(尤其是二十二碳六烯酸(dha)和二十碳五烯酸(epa))对人体健康具有各种有益作用，是各种细胞成分的重要构建单元，并起到信号传导分子前体的作用。
这些化合物的主要来源是鱼油和海藻油以及一些植物来源的油，其中它们以甘油三酯的形式存在。各种油以及油衍生的乙酯是可商购获得的。
由于随着食物或营养补充剂每日摄入这些ω-3源的量是有限的，因此重要的是要确保这些脂肪酸的最大生物利用度。在消化系统中疏水性营养物质的生物利用度经常是低的，并且这代表了一个挑战，尤其是对于补充剂而言，因为它们通常以胶囊或丸剂的形式独立于餐食被摄入。在禁食状态下几乎或完全不诱导消化液(胆汁酸、磷脂、脂肪酶)的分泌，这导致脂肪和油的酶促水解不完全，增溶作用和生物利用度低。
当使用先进的配制技术跳过消化系统的部分以便在消化系统的较下部分(例如在小肠或大肠中)释放ω-3脂肪酸时，会产生额外的生物质利用度挑战。涂覆有各自的释放聚合物的胶囊或片剂可用于此目的。在这些系统中，上文提及的自然增溶机理不太有效，这降低了生物利用度，并且必须通过适当的措施来补偿。
对于向体外培养的分离的细胞和组织供应ω-3脂肪酸，例如作为无血清细胞培养基组合物的部分，也是如此。在这些应用中，消化道中的增溶作用优选被接近于自然系统的配制剂所模拟，以最大化生物相容性和生物利用度。为了添加到细胞培养基中，还必须将所述脂肪酸以允许最佳穿过无菌过滤器的方式分散在所述培养基中。
已经开发了各种方法来解决生物利用度问题，要么通过配制剂，要么通过ω-3脂肪酸的化学修饰，要么通过二者一起来解决。
一种有前途的方法是ω-3脂肪酸酯的水解和随后皂化，这模拟了自然消化过程的部分，从而增加了溶解度。wo2016102323a1描述了包含多不饱和ω-3脂肪酸盐的组合物，其可被稳定化以抗氧化。
配制剂也可以改进生物利用度。例如，wo2010103402公开了含有表面活性剂的自乳化油配制剂已经显示出增加了在胃中的分散性和增加了生物利用度。这样的系统的缺点在于，它们通常需要非离子的、合成的表面活性剂，这些表面活性剂没有可持续来源，并且越来越不被消费者所接受。另一个缺点是为了在水中分散后产生精细油滴所需的相对于油或乙酯的表面活性剂和辅助表面活性剂的量是大的。最后，这些系统仍处于液态，这使得它们易于氧化，并且通常需要添加抗氧化剂和与加工和包装有关的特殊预防措施。
磷脂(例如磷脂酰胆碱(卵磷脂))是天然的两亲物和食物成分，它们具有高度的生物相容性并且易于消化。数十年来，它们已被用作食物工业中的乳化剂和用作营养补充剂。因此，已经使用磷脂来配制ω-3脂肪酸形式是不足为奇的。例如，alaarg等人(internationaljournalofnanomedicine2016:115027–5040)和hadian等人(iranianjournalofpharmaceuticalresearch(2014),13(2):393-404)已从ω-3游离脂肪酸和酯制备了基于磷脂的脂质体配制剂。
然而，ω-3酯和脂肪酸的基于磷脂的脂质体配制剂也有一些缺点。ω-3甘油三酯和乙酯具有如此低的极性，以致于只有少量可以稳定地分散在脂质体双层中。由于油和一些磷脂的粘性特征，在不添加额外辅料的情况下，它们也很难通过干燥转化成更浓缩的粉末形式。使用游离脂肪酸需要中和这些游离脂肪酸，这会使加工复杂化，并可能导致脂质体质量和稳定性降低，并且还引入了诸如钠或钾(经由naoh或koh)的抗衡离子，这在营养和其它应用中是不希望的。
令人惊奇地，本发明发现可以从磷脂与ω-3脂肪酸盐的混合物制备克服上述问题的ω-3制剂。尤其是，本发明发现与作为抗衡离子的碱性氨基酸形成的盐具有有益的性质。
因此，本发明的一个方面是一种制剂，其包含至少一种磷脂和至少一种脂肪酸盐的分散体，所述脂肪酸盐是阳离子与衍生自ω-3或ω-6脂肪酸的阴离子的脂肪酸盐。
根据iupac的定义，根据本发明的分散体是包含多于一个相的材料，其中所述相中的至少一个由分散在整个连续相中的、经常在胶体尺寸范围内的精细分相域组成。所述两个相可以处于相同或不同的物质状态。它们不同于溶液，在溶液中，溶解的分子不形成与溶质分离的相。本发明既涉及液相在液体介质中的分散体，其作为胶体(细乳液或微乳液)或作为悬浮液(粒度大于1μm的乳液)，也涉及固相在液体介质中的分散体，其作为胶体(溶胶)或作为悬浮液(粒度大于1μm)。另外，本发明还涉及固相在固体连续介质中的分散体，其被称为固体溶胶。
胶体是具有1nm至1μm的分散相的分散体，并且被定义为乳液(当液相分散在液体连续介质中时)，被定义为溶胶(当固相分散在液体连续介质中时)，和被定义为固体溶胶(当固相分散在固体连续介质中时)。
这样的分散体的制备方法可以被改进和简化。本发明发现该组合物具有较好的质量和稳定性。可以减少不希望的诸如钠的无机抗衡离子的含量。与其它形式的ω-3脂肪酸相比，本发明的组合物显著有利于液体形式的无菌过滤。发现由本发明的组合物制备的干粉具有有利于加工的较好性质。
本发明还发现这样的配制剂极大改进了微生物和动物(包括人细胞)的ω-3脂肪酸的生物利用度。
本发明的创造性组合物由能够形成双层的磷脂和ω-3脂肪酸的盐组成，所述ω-3脂肪酸的盐优选ω-3脂肪酸的氨基酸盐。磷脂可以是复杂的混合物(例如脱油卵磷脂)，结构确定的具有不同脂肪酸组成的主链(例如磷脂酰胆碱，具有不饱和的或氢化的脂肪酸)，或纯化的和结构确定的化合物(例如二油基磷脂酰胆碱，dopc)。
在本发明的一个优选配置中，所述脂肪酸选自二十碳五烯酸(epa)、二十二碳六烯酸(dha)、花生四烯酸(ara)、α亚麻酸、亚麻油酸(stearidonicacid)、二十碳四烯酸、二十二碳五烯酸、亚油酸、γ-亚麻酸和/或它们的衍生物，优选选自ω-3脂肪酸epa和dha。
在一个进一步优选的配置中，所述脂肪酸盐中的阳离子是衍生自以下物质中的一种的有机阳离子：赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、胆碱及其混合物。
在本发明的一个备选配置中，所述磷脂是脱油磷脂，其包含大于40重量％、优选70重量％、优选大于90重量％的磷脂酰胆碱含量和低于5重量％、优选低于1重量％的磷脂酰乙醇胺含量。
在一个备选实施方案中，所述磷脂是非氢化磷脂，其具有大于总脂肪酸的70重量％的油酸和/或亚油酸含量。
在本发明的一个进一步优选的配置中，磷脂与脂肪酸盐的质量比例大于0.005，优选大于0.01，更优选大于0.09，最优选大于0.39。
在一个备选的实施方案中，所述制剂是粉末或液体的形式，其当在ph6.5至7.5的ph值与水混合时得到具有的平均粒度小于1μm、优选小于500nm、最优选小于250nm的胶体分散体。
在另一个实施方案中，所述组分彼此精细分散，使得磷脂和脂肪酸盐二者都存在并且能够以100μg和更小的量检测到。
本发明的一个另外的目的是一种培养基，例如细胞培养基，其包含根据前述权利要求中任一项的制剂。
在一个优选的实施方案中，所述培养基是液体形式，是凝胶、粉末、颗粒、小丸的形式，或者是片剂的形式。
在其它优选的实施方案中，所述培养基是相对于所述使用中的培养基的浓度为2倍、3倍、3.33倍、4倍、5倍或10倍浓缩形式(体积/体积)的液体培养基。这允许通过用相应体积的无菌水简单稀释所述浓缩培养基来制备“即用型”培养基。本发明的这种浓缩形式的培养基也可以通过将其添加到培养中、例如在补料分批培养过程中来使用。
本发明的另一方面涉及一种制备根据本发明的制剂的方法，该方法至少包括以下步骤：
a.将磷脂和脂肪酸盐一起溶解在能与水混溶的溶剂中，并添加少量的水以充分溶解所述盐；
b.将该溶液添加到水性体系中以制备脂质分散体；
c.经由超声或均质化处理将所述脂质分散体的粒度减小到小于500nm、优选小于250nm的平均粒度；
d.任选干燥制剂，优选经由喷雾或冷冻干燥。
在根据本发明方法的备选实施方案中，方法至少包括以下步骤：
a.将所述磷脂溶解在能与水混溶的溶剂中；
b.将所述脂肪酸盐溶解在水性体系中，并添加磷脂溶液以制备脂质分散体；
c.经由超声或均质化处理将所述脂质分散体的粒度减小到小于500nm、优选小于250nm的平均粒度；
d.任选干燥制剂，优选经由喷雾或冷冻干燥。
在根据本发明的方法的一个优选实施方案中，所述能与水混溶的溶剂选自以下物质中的一种或多种：乙醇、甘油和丙二醇。
本发明的另一方面涉及根据本发明的制剂用于向细胞、组织、器官或生物体提供多不饱和脂肪酸的用途，优选在细胞和组织培养、器官保存、人或动物营养、药物或化妆品领域中的用途。
在一个具体的实施方案中，涉及根据本发明的制剂用于培养和刺激间充质干细胞的扩增的用途。
一个备选的实施方案涉及根据本发明的制剂用作饲料或食物补充剂的用途或用作药物产品的用途。
本发明的另一个主题是一种饲料或食物组合物，其含有根据本发明的制剂和至少一种另外的饲料或食物成分，其优选选自蛋白质、碳水化合物、脂肪、其他益生菌、益生元、酶、维生素、免疫调节剂、代乳品、矿物质、氨基酸、抗球虫药、基于酸的产品、药物和它们的组合。
根据本发明的饲料或食物组合物还包括膳食补充剂，其是丸剂、胶囊、片剂或液体的形式。
本发明的另一个主题是药物组合物，其含有根据本发明的制剂和药学上可接受的载体。
当将根据本发明的制剂施用于动物或人类时，根据本发明的制剂优选改进了动物或人类的健康状况，特别是肠道健康、心血管健康、心脏代谢健康、肺健康、关节健康、眼睛健康、精神健康、口腔健康或免疫健康。
因此，本发明的另一个主题是根据本发明的组合物，其用于改进动物或人类的健康状况，特别是肠道健康、心血管健康、心血管代谢健康、肺健康、关节健康、眼睛健康、精神健康、口腔健康或免疫健康，这是本发明的一部分。
工作实施例
用以下方法表征ω-3脂肪酸的制剂：
1.1粒度测定
经由动态光散射(dls)测量法(zetasizernanozs，malvern)测定粒度。
1.2浊度测量
在具有1cm光路的比色皿中，在600nm，在光度计中，在用水稀释100倍后，测量制剂的浊度。
1.3无菌过滤性质
通过0.2μm无菌注射器过滤器过滤5ml液体制剂。经由增加反压或完全堵塞来评价过滤的难易性。在过滤之前和之后，经由光度法在600nm评价浊度测量。较高的浊度与较大的粒度相关。浊度的降低是通过过滤产生材料损失的信号，这是不希望的，因为样品的组成应尽可能少地改变。
1.4干燥和评价粉末性质
将制剂冷冻干燥，并定性评价干燥制剂的稠度和流动行为。
实施例1：在磷酸盐缓冲液中用二油基磷脂酰胆碱(dopc)制备ω-3脂肪酸分散体及表征
为了制备ω-3脂肪酸分散体的配制剂，将0.8g二油基磷脂酰胆碱(dopc，lipoidgmbh)溶解在1ml乙醇中。添加并溶解0.2g鱼油(ω-31400，
形式为ω-3赖氨酸盐的游离ω-3脂肪酸的赖氨酸盐(
在45℃的温度下和在剧烈搅拌下，将1ml各自溶液滴加到20mlph＝8的0.1m磷酸盐缓冲液中。如果需要，用naoh将ph调节至ph＝8。之后，将分散体置于冰上并进行超声处理(bransonsonifier，100％振幅，50％脉冲)15分钟以产生纳米级分散体，推测为脂质体。将分散体通过0.2μm注射器过滤器进行无菌过滤。如1.2中所述的，在无菌过滤之前和之后测量浊度和粒度。制剂含有40g/l的磷脂和10g/l的ω-3脂肪酸或酯。在最后的步骤中，将分散体冷冻干燥并目视分析所获得制剂的外观。
令人惊奇地，本发明发现，用ω-3脂肪酸赖氨酸、精氨酸或鸟氨酸盐获得的制剂具有较小的粒度，显示出最佳的过滤性质，并且在冷冻干燥后产生基本上较小粘性的粉末。表1中总结了作为对比例的甘油三酯和乙酯(对比的)以及脂肪酸赖氨酸、精氨酸和鸟氨酸盐(根据本发明的)的结果。
表1：各种具有dopc的ω-3脂肪酸分散体的性质
实施例2：在水中用dopc制备ω-3脂肪酸和ω-3脂肪酸赖氨酸盐分散体
如实施例1中描述那样制备配制剂，不同之处在于使用水代替磷酸盐缓冲液。除ω-3脂肪酸赖氨酸盐(
表2：在用ω-3游离脂肪酸和ω-3脂肪酸赖氨酸盐制备的组合物之间的差异。
实施例3：用dopc以脂肪酸盐与磷脂的各种比例制备ω-3脂肪酸赖氨酸盐分散体及表征
如实施例1中描述那样制备配制剂，不同之处在于使用水代替磷酸盐缓冲液并且使用不同比例的ω-3脂肪酸盐与磷脂。所获得的水分散体全部含有10g/l的ω-3脂肪酸盐，但dopc的浓度不同。还制备了没有磷脂的ω-3脂肪酸盐的水性胶体溶液以进行比较。将5ml获得的分散体稀释于45ml20mm磷酸盐缓冲液(ph＝7)中，以经由粒度和浊度测量法评价在生理ph下的分散体性质。在微量滴定板中，在96孔微量滴定板中，在600nm，用100μl液体体积测量稀释的分散体的浊度(tecaninfinite200pro)。令人惊奇地，本发明发现，与不添加磷脂的ω-3脂肪酸盐相比，少量的dopc已经足以改进ω-3脂肪酸盐的分散。这可以由降低的浊度和较小的粒度证实。结果总结在表3中。
表3：具有各种dopcω-3脂肪酸赖氨酸盐比例的组合物，在ph＝7下，在稀释组合物后获得的粒度和浊度(n.d.：未测定)
实施例4：在水中用卵磷脂制备ω-3脂肪酸分散体及表征
如在实施例3中描述那样制备配制剂，不同之处在于使用0.8g具有>90重量％的磷脂酰胆碱含量的脱油向日葵卵磷脂/磷脂酰胆碱(lipoidh100)代替dopc。如在实施例3中描述那样制备在ph＝7下磷酸盐缓冲液中的稀释液，并测量浊度。结果显示在表4中，并且其与用dopc获得的那些结果相当。如由较低的浊度所表明的，在此ph值下，有少量的磷脂已经导致脂肪酸盐的精细得多的分散。该差异也很容易目视观察到。尽管4.6看起来有相当的乳白色，而含磷脂的组合物几乎是透明的且只有轻微的浑浊。
表4：具有各种卵磷脂ω-3脂肪酸赖氨酸盐比例的组合物，在ph＝7下，在稀释组合物后获得的粒度和浊度
实施例5：在水中用二油基磷脂酰胆碱制备ω-3脂肪酸盐分散体的备选方法
本发明发现根据本发明的制剂可以以简化过程并且不适合于ω-3脂肪游离脂肪酸形式或相应的酯的混合顺序来制备。不是将所述ω-3脂肪酸赖氨酸盐与磷脂溶解在乙醇中，而是将其以10g/l的浓度直接溶于水中，并然后添加乙醇磷脂溶液。然后，如先前实施例中所述的，将分散体进行超声处理并无菌过滤。
实施例6：在菌株巨大芽孢杆菌(b.megaterium)dsm32963中刺激18-羟基-二十碳五烯酸(18-hepe)的产生
由于它们的极性低，ω-3脂肪酸的生物利用度经常不足，并且实际上只有少量被利用并在生化反应中被细胞转化。可以证明的是，本发明中描述的制剂增强了与营养应用(例如微生物组利用和调节)有关的微生物细胞的ω-3脂肪酸的生物利用度和代谢转化率。
通过筛选天然存在的分离株已鉴定出巨大芽孢杆菌(bacillusmegaterium)dsm32963。它已按照国际认可用于专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约的规定，以evonikdegussagmbh的名义以前文提及的登录号于2018年11月27日保藏于dsmz。
将表1中描述的制剂添加到在摇瓶中在液体培养物中的巨大芽孢杆菌dsm32963的微生物培养物中。为了进行比较，还添加了具有相同ω-3脂肪酸浓度的ω-3脂肪酸赖氨酸盐在水中的溶液。发现巨大芽孢杆菌dsm32963催化了二十碳五烯酸(epa)转化为具有生物活性的18-羟基-二十碳五烯酸(18-hepe)。
从具有0.1％葡萄糖的10mlaufluriabertami肉汤(lb，thermofisherscientific)(lbg)中，将巨大芽孢杆菌dsm32963的培养物在100ml培养瓶中在30℃和200rpm生长24小时。将完整的培养物转移至在lbg中的200ml主培养物中。主培养物在2升培养瓶中在30℃和200rpm生长6小时。然后以10ml的体积份收获细胞培养物，通过离心(15分钟，4000rpm，室温)除去上清液，并将细胞沉淀重悬于10mllbg中或含9.76g/lfessif-v2(biorelevant.com)的lbg中(fessif-v2是牛磺胆酸盐、磷脂和其它被设计用于模拟胆汁表面活性剂的组分的混合物)，并添加2ml脂质储液(该储液由实施例2中的无菌过滤的制剂制得)，以分别在每个实验中获得相同的epa浓度(表5)。另外，还将补充剂分别添加到没有细胞的摇瓶中的不同培养基中，并在相同条件下进行处理以针对非生化学产物的形成作为对照。将这些培养物和相应的对照在100ml摇瓶中在30℃和200rpm孵育16小时。
表5：补充剂、储液的制备及其epa含量计算值(g/l)
随后，通过离心(15分钟，4000rpm，室温)分离所述细胞，取出上清液以分析ω-3代谢物的存在。将上清液用由水/乙腈混合物组成的溶剂进行稀释(上清液:溶剂的比例为1:2，溶剂组成：65％的h2o，ph8和35％的mecn)。
过滤稀释的上清液样品，然后将其通过lc/esi-ms分析(agilentqqq6420,gemini3μc6-phenyl)以正sim模式在m/z318下用于检测18-羟基-二十碳五烯酸(18-hepe)以及在m/z302下用于检测前体化合物epa。
在存在和不存在胆汁盐的情况下，当将ω-3脂肪酸作为用磷脂配制的ω-3赖氨酸盐提供给巨大芽孢杆菌dsm32963细胞时，形成了18-hepe，并在上清液中最有效地检测到18-hepe。结果总结在表6中。
表6：在不存在和存在胆汁酸的情况下，培养物上清液的测量的18-hepe浓度(mg/l)
实施例7：通过添加磷脂分散的ω-3脂肪酸盐刺激人骨髓间充质基质细胞的扩增
人骨髓间充质基质细胞(msc)以细胞疗法的形式用于医学目的，并用于衍生出用于组织工程的特定细胞和组织类型，例如用于生成软骨细胞以制作体外软骨。为此，需要合适的培养基组合物，其允许有效扩增/繁殖分离的细胞。通常认为如果使用无血清的化学成分确定的培养基，则需要补充脂质。如以下段落中所描述的，评价了在本发明中描述的脂质配制剂有效扩增基质细胞的适用性。
制备了化学成分确定的细胞培养基，如由jung等人(cytotherapy,2010；12:637-657)描述的。在表7中示出所述培养基的组成。
表7：用于培养间充质基质细胞的化学成分确定的培养基的组成
化学成分确定的脂质浓缩物由thermofisherscientific(目录号11905031)获得，并且由用非离子表面活性剂(聚山梨酯80和pluronicf-68)配制的脂肪酸和胆固醇的混合物组成。
制备了另外两批这种培养基，其中一批没有化学成分确定的脂质浓缩物，和另一批次中，化学成分确定的脂质浓缩物被替换为用dopc配制的ω-3赖氨酸盐的制剂(实施例1.3)。将0.1ml液体制剂添加到100ml细胞培养基中，相当于1000倍稀释，并且得到的脂肪酸浓度为约10mg/l。
在来自骨髓单核细胞的化学成分确定的培养基中衍生的人骨髓间充质基质细胞得自stemcelltechnologies，按照供应商的建议进行解冻，并在三种不同形式的培养基中扩增。以150000细胞/ml的细胞密度接种培养基，并在co2培养箱中在t25细胞培养瓶中扩增细胞。每2-3天更换培养基，并在汇合之前传代细胞。用accutasetm(stemcelltechnologies)分离细胞，测定活细胞浓度，并在每次传代时以150000细胞/ml接种新鲜的培养基。
从传代次数和测量的细胞浓度计算累积群体倍增(cpd)作为生长性能的指标。令人惊奇地，本发明发现，当与没有添加脂质的培养基(cpd＝4.77)相比时，如文献中描述的化学成分确定的脂质浓缩物对cpd没有积极作用(cpd＝4.63)。与此相反，添加用dopc配制的ω-3赖氨酸盐确实具有积极作用，并导致cpd增加到7.37。