眼用水凝胶组合物

1.本发明涉及可用于眼的治疗性应用的水凝胶组合物。本发明还涉及用于制备这些水凝胶组合物的方法以及这些水凝胶组合物用于治疗性应用，特别是在抑制眼瘢痕形成方面的用途。


背景技术：

2.2018年，who报道了在全球，角膜混浊是失明的主要原因。由病症例如微生物性角膜炎引起的角膜感染导致了胶原蛋白和胞外基质的紊乱，形成瘢痕。治疗通常需要用类固醇和抗生素来解决感染。未解决的角膜混浊可导致需要手术性角膜移植。尽管试图通过积极控制感染/炎症来控制角膜瘢痕形成，但使用强效的抗瘢痕形成治疗几乎没有成功。当前滴眼剂治疗的一个限制是低的黏度或弱的胶凝材料，这不会显著延长药物的滞留时间。
3.角膜混浊在全球均是视力损伤(sight impairment)的主要原因，估计全球有2790万人双侧或单侧地受到影响
1.。这样的混浊通常源于复杂的、光学上透明的角膜组织结构的改变，角膜组织结构对于将光折射到视网膜上和随后的神经视觉处理至关重要。通常，角膜瘢痕形成是由一系列病原体包括细菌、寄生虫、真菌、病毒和原生动物引起的眼部感染导致的。在发达国家，毁灭性的角膜感染最常与长期佩戴隐形眼镜和/或镜片卫生不良有关
[2
‑
4]
；其中铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)是突出的致病生物。在革兰氏阴性感染例如假单胞菌的情况下，角膜的结构完整性通过多种毒力因子受到损害，由此微生物侵入上皮细胞，导致许多炎性途径的激活。随后细胞因子从上皮、基质和上皮内炎性细胞的产生，新生血管形成，细胞改变以及降解基质过程
[5]
导致组织重塑失调和复杂布置的胶原原纤维的破坏
[6]
从而导致光学透明度的损失、光折射受损和视力损失。
[0004]
在破坏涉及角膜基质的上皮和bowman’s层的损伤之后，发生涉及角膜上皮、基质和神经、泪腺和泪膜的协调的伤口愈合响应，以恢复角膜结构和功能并维持眼的完整性
[7]
。作为角膜伤口愈合响应的一部分，上皮在上皮受损之后几乎立即开始响应于来自角膜缘小环境(niche)的干细胞增殖而再生
[8]
并且靠近受伤部位的角膜细胞(用于维持胶原蛋白和ecm更新的透明细胞)经历凋亡(由从受损上皮细胞释放的细胞因子诱导)。在损伤之后12至24小时可检测到损伤部位外周的残留角质细胞的增殖和迁移
[9]
。角质细胞响应包括蛋白聚糖的产生和胶原纤维的合成。这些纤维在表型上比初始纤维更大，并且由于蛋白聚糖的保水能力而不会呈现有序规则结构，其导致角膜混浊。骨髓来源的前体细胞和来自角膜缘区域的循环介质的运动通过tgfβ和pdgf活化将角质细胞亚群活化、转化和分化为具有成纤维细胞和肌成纤维细胞特征的细胞类型
[10,9,11]
。从上皮细胞释放的tgfβ通过受损的bowman’s层进入基质细胞，启动肌成纤维细胞分化
[12,13]
。肌成纤维细胞释放细胞因子，其进一步吸引炎性细胞和ecm沉积(例如胶原蛋白、纤连蛋白)以促进成纤维细胞迁移，作为基质重塑阶段的一部分
[14]
。修复过程导致胶原纤维取向的改善、蛋白聚糖的收缩、基质肌成纤维细胞的凋亡和角膜细胞的再增殖，使得结构和功能能够恢复，但具有残留的基质混浊。如果这存在于视轴中，则视力受损。如果角膜上皮屏障没有恢复，则基质代谢变得失调，导致角质松
解(keratolysis)、角膜组织的降解、角膜原纤维布置的进一步紊乱，并最终导致角膜穿孔。这部分地是由于tgfβ的持续释放，导致持续的肌成纤维细胞阻止角膜细胞的基质重建(re
‑
population)
[15,16]
。与其他组织(例如皮肤)不同，在可耐受持续性溃疡或瘢痕的情况下，在角膜中，这可具有永久性角膜瘢痕形成以及视力障碍或失明的破坏性功能影响。
[0005]
目前，感染有细菌性角膜炎的患者的标准临床护理最初集中于对已感染的眼进行灭菌，通过滴眼剂施用强效广谱抗生素，然后添加表面用皮质类固醇以减轻炎症
[8,9]
。这之后是限制瘢痕形成的策略，从加强润滑(以减少眨眼期间眼睑摩擦伤口床的生物力学创伤)到使用全身性药剂(亚抗微生物剂量的用于基质金属蛋白酶抑制的四环素
[10]
)或补充剂(用作抗氧化剂和自由基清除剂的维生素c
[11]
)以试图促进组织重塑。遗憾的是，虽然对眼灭菌有效，但患者通常会留下高度的角膜朦胧(corneal hazing)，如果其损害视轴，则会导致视敏度损失。治疗无响应且大的角膜缺损的手术干预包括：应用羊膜作为生物活性绷带，从而释放抗炎和抗纤维化因子以增强急性损伤期间的上皮再形成(re
‑
epithelialization)和伤口愈合
[12
‑
14]
；或者在已建立的视觉上显著的中央角膜瘢痕的情况下，切除瘢痕组织并更换为供体角膜。羊膜移植和角膜移植的临床结果的可重现性和可重复性充满了失败和排斥反应的风险
[15
‑
18]
。
[0006]
如果对损伤和感染的纤维化反应可以减弱，则将使光学清晰度最大化并保留视觉功能，并且可能不需要手术干预和移植。这样的创新有可能防止数百万个体的永久性失明。如上所述，纤维化是由tgfβ
‑
1活性水平升高驱动的，并因此可能可以使用tgfβ拮抗剂来防止纤维化。饰胶蛋白聚糖(decorin)是天然存在的多效抗纤维化的小的富亮氨酸蛋白聚糖，其以与胶原蛋白结合的高水平天然存在于角膜基质中
22
，并且当被释放时，其通过结合生长因子并将生长因子隔离在ecm内来严格调节tgfβ活性
[19]
。饰胶蛋白聚糖通过调节多种生长因子
[20
‑
24]
包括tgf
‑
β以及直接干扰胶原蛋白原纤维生成
[25
‑
28]
来调节细胞增殖、存活和分化。
[0007]
饰胶蛋白聚糖负责调节胶原原纤维间距和ecm，以实现角膜透明，并且先前已显示抑制角膜中的瘢痕形成和新血管形成
[35]
。饰胶蛋白聚糖的突变与先天性基质营养不良相关的角膜混浊和视觉异常有关
[40]
。角膜纤维化中tgfβ的过度活跃可能会克服内源性饰胶蛋白聚糖维持体内稳态的能力，并且有充分的证据表明，在其他组织中过表达饰胶蛋白聚糖能够降低体内纤维化水平
[41
‑
43]
。
[0008]
人重组(human recombinant，hr)饰胶蛋白聚糖现在可以以gmp形式获得，并且其已显示出具有使脑和脊髓中的纤维化最小化的功能
[29
‑
31]
。迄今为止，尚未报道将可溶性饰胶蛋白聚糖应用于眼表以进行体内治疗的效力。这种情况的可能原因之一可能是由于眼滴剂的黏度相对较低，所以其在早期时间点从角膜表面的清除相对较快(在几分钟的范围内
[32,33]
)，这意味着饰胶蛋白聚糖的任何效力将是有限的。
[0009]
先前的报道(特别是wo 2017/013414)已表明，流体凝胶水凝胶可用于将抗纤维化剂饰胶蛋白聚糖递送至眼以降低瘢痕形成。这些报道强调了在这样的组合物中胶原蛋白的存在对其有效性至关重要。
[0010]
归因于这样的组合物中的胶原蛋白的作用有两个：提高饰胶蛋白聚糖结合纤维化生长因子(例如tgf
‑
β)的能力，和一旦结合就有助于清除这些因子二者。


技术实现要素：

[0011]
在本发明的第一方面中，提供了适合应用于眼的剪切稀化眼用水凝胶组合物(shear
‑
thinning ocular hydrogel composition)，所述组合物包含分散在水性载剂中的：
[0012]
(i)0.1至5.0重量％(例如0.1至3.5重量％，或0.1至2.5重量％)的微凝胶颗粒形成聚合物；和
[0013]
(ii)0.5至100mm的单价和/或多价金属离子盐作为交联剂；
[0014]
其中所述水凝胶组合物具有在3至8范围内的ph并且当水凝胶暴露于剪切时所述水凝胶组合物的黏度降低，并且
[0015]
其中所述组合物还包含饰胶蛋白聚糖。
[0016]
在本发明的另一个方面中，提供了适合应用于眼的眼用水凝胶组合物，其中所述眼用水凝胶组合物包含如本文中限定的包含饰胶蛋白聚糖的剪切稀化水凝胶组合物、基本上由其组成或由其组成。
[0017]
在另一个方面中，本发明提供了制备如本文中限定的剪切稀化眼用水凝胶组合物的方法，所述方法包括以下步骤：
[0018]
a)将微凝胶形成聚合物溶解在水性载剂中以形成聚合物溶液；
[0019]
b)在高于微凝胶颗粒形成聚合物的胶凝温度的温度下将步骤(a)中形成的微凝胶形成聚合物溶液与单价或多价金属离子盐的水溶液混合；以及
[0020]
c)将来自步骤b)的所得混合物冷却至低于微凝胶颗粒形成聚合物的胶凝温度的温度；
[0021]
并且其中：
[0022]
i)在步骤b)期间；或者
[0023]
ii)在步骤c)期间，在其中来自步骤b)的混合物处于高于微凝胶颗粒形成聚合物的胶凝温度的温度下的点向混合物添加饰胶蛋白聚糖。
[0024]
合适地，向混合物添加饰胶蛋白聚糖水溶液形式的饰胶蛋白聚糖。
[0025]
在另一个方面中，本发明提供了制备如本文中限定的剪切稀化眼用水凝胶组合物的方法，所述方法包括以下步骤：
[0026]
a)将微凝胶形成聚合物溶解在包含0.5至100mm的单价和/或多价金属离子盐作为交联剂的水性载剂中，以形成包含0.1至5.0重量％(例如0.1至3.5重量％，或0.1至2.5重量％)的微凝胶颗粒形成聚合物的聚合物溶液；
[0027]
b)在剪切混合下将来自步骤a)的所得混合物冷却至低于微凝胶颗粒形成聚合物的胶凝温度的温度；
[0028]
并且其中：
[0029]
i)在步骤a)中；或者
[0030]
ii)在步骤b)期间，在其中来自步骤a)的混合物处于高于微凝胶颗粒形成聚合物的胶凝温度的温度下的点向混合物添加饰胶蛋白聚糖。
[0031]
合适地，向混合物添加饰胶蛋白聚糖水溶液形式的饰胶蛋白聚糖。
[0032]
在另一个方面中，本发明提供了剪切稀化眼用水凝胶组合物，其可通过本文中限定的任何制备方法获得、其通过本文中限定的任何制备方法获得或者其通过本文中限定的
任何制备方法直接获得。
[0033]
在另一个方面中，本发明提供了如本文中限定的剪切稀化眼用水凝胶组合物，其用于治疗。
[0034]
在另一个方面中，本发明提供了如本文中限定的剪切稀化眼用水凝胶组合物，其用于眼施用。
[0035]
在另一个方面中，本发明提供了如本文中限定的剪切稀化眼用水凝胶组合物，其用于抑制瘢痕形成。
[0036]
在另一个方面中，本发明提供了如本文中限定的剪切稀化眼用水凝胶组合物，其用于治疗微生物性角膜炎。
[0037]
在另一个方面中，本发明提供了根据本发明的眼用组合物，其用作药物。本发明的眼用组合物的合适的医学用途的一些实例在下文中进一步描述。合适地，本发明的组合物可用作用于施用于眼表面的药物。
[0038]
在本发明的一个合适的实施方案中，根据本发明的组合物用于抑制眼中的瘢痕形成。合适地，本发明的组合物可用作用于抑制与角膜炎例如微生物性角膜炎相关的瘢痕形成的药物。合适地，本发明的组合物可用于治疗微生物性角膜炎以抑制瘢痕形成。
[0039]
本发明的眼用水凝胶组合物包含抗纤维化ecm分子饰胶蛋白聚糖。合适地，根据本文中所述任何方面的眼用水凝胶组合物可不包含其他生物来源物质，特别是不包含来自人或其他动物资源的其他生物来源物质。合适地，根据本发明的眼用水凝胶组合物可包含多糖微凝胶形成聚合物，但不包含能够形成凝胶的蛋白质组分。例如，本发明的组合物可不包含除饰胶蛋白聚糖之外的蛋白质。
[0040]
特别地，本发明的眼用水凝胶组合物可不包含除饰胶蛋白聚糖之外的ecm组分。因此，本发明的眼用水凝胶组合物可不包含胶原蛋白或纤维蛋白。事实上，本发明基于本发明人的出乎意料的发现，即包含抗纤维化剂饰胶蛋白聚糖的抗瘢痕形成眼用水凝胶组合物可通过排除另外的ecm组分，并且特别是来自在不存在来自这样的组合物的胶原蛋白和纤维蛋白的情况下的另外的ecm组分而得到改善。这与现有技术的报道形成直接对比，现有技术的报道表明胶原蛋白和任选地纤维蛋白在这些组合物抑制瘢痕形成的能力中发挥至关重要的作用。
[0041]
如wo 2017/013414中所述，在包含存在于这样的组合物中的饰胶蛋白聚糖的水凝胶组合物中，胶原蛋白的存在在以其中优化了饰胶蛋白聚糖对tgf
‑
β的拮抗作用的方式呈递饰胶蛋白聚糖中发挥关键作用。
[0042]
此外，在wo 2017/013414中提出，当与饰胶蛋白聚糖
‑
胶原蛋白复合物结合时，tgf
‑
β和其他结合因子被更有效地隔离，使得它们不能促进纤维化、炎症或血管生成。然后，隔离的因子随着流体水凝胶缓慢地眨眼挤出而从眼表面去除。
[0043]
鉴于以上，将理解的是，技术人员将没有动机考虑使用缺乏胶原蛋白/纤维蛋白的眼用水凝胶组合物，因为这样做将被理解为失去了现有技术的组合物被陈述为实现它们的治疗活性的许多机制。未能并入胶原蛋白(或纤维蛋白)将阻止饰胶蛋白聚糖抗纤维化活性的最佳呈现，否定饰胶蛋白聚糖/胶原蛋白组合比单独的饰胶蛋白聚糖更有效地吸收和去除tgf
‑
β的能力，并防止该组合隔离纤维化生长因子，导致其随后从眼中清除。
[0044]
然而，出乎意料的是，本发明人发现使用包含饰胶蛋白聚糖但缺乏胶原蛋白或纤
维蛋白(或事实上任何其他ecm)的眼用水凝胶组合物在抑制角膜瘢痕形成(例如与微生物性角膜炎相关的瘢痕形成)方面高度有效。事实上，使用其中不存在另外的ecm组分(例如胶原蛋白和/或纤维蛋白)的剪切稀化眼用水凝胶组合物提供了就现有技术的组合物而言不可得到的许多优点。
[0045]
这些优点相对于本发明的眼用水凝胶组合物的生物效应、其材料特性和其制备方式而出现。
[0046]
如实施例部分中列出的结果所示，本发明人已证明包含饰胶蛋白聚糖但不含胶原蛋白或纤维蛋白的本发明的眼用水凝胶组合物能够有效抑制与微生物性角膜炎相关的瘢痕形成。此外，能够与饰胶蛋白聚糖相互作用并“呈递”饰胶蛋白聚糖而不阻碍治疗有效性的ecm成分的缺乏实际上赋予本发明组合物优势。
[0047]
许多ecm组分(包括胶原蛋白和纤维蛋白)均并入了使得它们与其他生物活性分子结合的基序。正是这一特性支持了先前关于在组合物中使用胶原蛋白以在其天然的、并因此更具生物活性的环境中呈递饰胶蛋白聚糖的建议。本发明的优选的微凝胶颗粒形成聚合物例如结冷胶缺乏这种基序。因此，将认识到它们不能以现有技术中归因于胶原蛋白和/或纤维蛋白的方式通过与饰胶蛋白聚糖结合并将该物质维持在在体内发现该物质的构象中而发挥功能。
[0048]
ecm组分上的结合基序在结合细胞或可溶性生物效应分子方面也具有重要作用。这样的分子向宿主内的细胞提供信号或其他生物诱因，并且它们信号传导的中断可能影响宿主的响应。虽然生物途径(例如饰胶蛋白聚糖对纤维化生长因子的结合和抑制)的一些改变具有有益的治疗性作用，但情况并非总是如此。其他生物因素可具有不利影响，在提供它们的部位引起过敏或炎症。通过排除胶原蛋白和/或纤维蛋白(或事实上除饰胶蛋白聚糖之外的ecm组分)，本发明的眼用水凝胶组合物不会受到这样的不期望的生物作用。因此，在在本发明的眼用水凝胶组合物中没有发现另外的生物来源物质的情况下，该组合物的部分接受者对这样的物质的不良响应的能力降低。使用多糖微凝胶形成聚合物(并且不存在蛋白质凝胶形成聚合物)是合适的方法，通过该方法可从本发明的眼用水凝胶组合物中排除不期望的结合基序。
[0049]
ecm组分，例如胶原蛋白和/或纤维蛋白，是“生物来源”物质的实例，“生物来源”物质是通常通过从天然存在来源中提取而获得的生物材料。这些来源(其可以是人或其他动物)提供天然存在的经过“正确”加工成其生物学相关形式(通过重组方法难以实现的结果)的蛋白质。然而，生物来源物质在从中获得其的来源方面可能会发生显著变化。这些可以是“来源间”变化(例如从不同个体获得的产物之间的差异)或“来源内”变化(例如在不同时间从同一个体获得的产物的差异)。健康状况或药物等因素可能加剧来源内变化。因此，与现有技术的那些相比，本发明的眼用水凝胶组合物赋予的另一个优点在于，通过使用不是通过从人或动物来源提取而获得的凝胶材料(例如结冷胶)，它们避免了其性质的这样的变化。
[0050]
在本发明的组合物中使用的流体凝胶的特性允许将生物活性饰胶蛋白聚糖保留在角膜的表面，从而提高饰胶蛋白聚糖的可用性，并且因此提高其抑制瘢痕形成的能力。这是在不需要与饰胶蛋白聚糖相关或复合的胶原蛋白的情况下实现的。相反，这些益处是由于剪切稀化眼用水凝胶组合物的材料特性而产生的。
[0051]
在本发明的组合物中使用的流体凝胶的特性使得饰胶蛋白聚糖被保持在眼表面的眼用水凝胶组合物内。水凝胶在受损部位例如与微生物性角膜炎相关的感染上提供保护层，从而有助于形成治疗性愈合环境。
[0052]
然而，本发明的剪切稀化眼用水凝胶组合物不仅通过保护受损区域而有助于抑制瘢痕形成。本发明人已发现，剪切稀化眼用水凝胶的材料特性使得当它们暴露于与由眨眼产生的剪切力一致的剪切力(即在眨眼期间由组合物与接收者的眼睑的相互作用产生的力)时，发生半固体到液体的转变。认为这种液化导致伴随每次眨眼时的抗纤维化饰胶蛋白聚糖的脉冲释放。在眨眼之后，组合物恢复为其半固体形式，有效地将剩余的饰胶蛋白聚糖储存在贮库(depot)中。以该方式定期和受控地释放饰胶蛋白聚糖建立了高度有利的条件，在该条件下能够发生眼表的无瘢痕愈合。
[0053]
将理解的是，用于本发明的眼用组合物中的剪切稀化水凝胶依赖于在液体与半固体转变之间进行重复转变的能力来实现这种作用。这样的流体凝胶可被称为“自愈”。然而，纤维蛋白的凝胶化机制是不可逆的。因此，在现有技术中描述的凝胶的一些实施方案中纤维蛋白的并入导致组合物一旦“破裂”就不能“愈合”。
[0054]
胶原蛋白(在现有技术中作为饰胶蛋白聚糖的“载体”公开的另一种ecm组分)也不适合于形成流体凝胶。在该情况下，形成这样的凝胶所需的混合导致胶原蛋白在制备过程期间无法适当地凝胶化。
[0055]
因此，基于胶原蛋白和/或纤维蛋白的现有技术凝胶在其在眼中驻留期间缺乏产生饰胶蛋白聚糖的常规“脉冲”的能力，并且因此不能赋予由本发明的眼用水凝胶组合物提供的益处。
[0056]
如上所述，本发明的眼用水凝胶组合物在它们的制造方式方面也提供了现有技术的组合物没有提供的益处。本发明的剪切稀化眼用水凝胶组合物基于其制造的可重现性、其制造的容易性以及涉及制造和分销产品的供应链而提供益处。
[0057]
制造的可重现性在用于医学用途的组合物中是至关重要的。为了允许有效处方，获得批次之间差异很小的一致产品的能力至关重要。如上文进一步说明的，本发明的剪切稀化眼用水凝胶组合物的材料特性决定了它们将治疗性饰胶蛋白聚糖释放到待抑制瘢痕形成的部位的方式。因此，必需能够制造具有可重现材料特性的组合物，以便能够提供实现批次之间一致剂量的组合物。
[0058]
在现有技术的组合物中并入生物来源材料例如胶原蛋白或纤维蛋白，给可重现药物的产生带来了许多重大障碍。纤维蛋白必须从可溶性纤维蛋白原转化而来，并且这通常涉及使用酶凝血酶。维持从一批次到另一批次一致程度的酶活性是一个重大问题。由于纤维蛋白原(凝血酶的底物)在批次之间变化的能力，出现了类似的困难。变化可导致纤维蛋白的自发凝胶化，或至少在所产生的不同批次材料的特性之间的显著差异。这些差异可导致所产生的组合物的饰胶蛋白聚糖释放谱的不可接受的变化。
[0059]
纤维蛋白原向纤维蛋白的酶促转化在纤维蛋白凝胶的产生中所发挥的作用也给制造带来困难。证明产生具有均匀质地和流变特性的组合物是有问题的，因为以通常用于制造剪切稀化凝胶的方式进行处理产生了“块状”产品。这可能与向其眼施用剪切稀化凝胶的对象的不可接受的不适水平有关。
[0060]
确保生物来源材料(无论是纤维蛋白原还是凝血酶)的供应的连续性和一致性也
带来待使用制造材料的供应和所产生组合物的分布方面的困难。酶及其底物可能对其处理方式敏感(因为温度等的变化可能显著影响活性)，并且这种类型的生物凝胶通常需要在制造之后冷藏(或冷冻)储存。生物材料(例如胶原蛋白或纤维蛋白)的使用还与将不期望的污染物(例如感染剂)引入产品的风险相关。
[0061]
鉴于以上可看出，本发明人对其中基本上或完全不存在胶原蛋白或纤维蛋白的本发明的剪切稀化眼用水凝胶组合物的开发代表了与现有技术中所教导的产品的相当大的技术偏离。然而，该偏离赋予了在遵循较早的教导时不可实现的显著的出乎意料的优势。眼用水凝胶组合物的特性、制造和用途均在下面进一步考虑。
[0062]
附图简述
[0063]
以下参考附图进一步描述了本发明的一些实施方案，其中：
[0064]
图1.基于结冷胶的流体水凝胶滴眼剂的处理和固有材料特性。(a)示出了流体凝胶生产的示意图：其中初始溶胶在剪切下持续处理同时进行冷却以形成使用(i)透射显微术和(ii)扫描电子显微术所示出的“带状(ribbon
‑
like)”胶凝实体。(b)针对结冷胶滴眼剂获得的时间依赖性黏度谱，其突出了一定程度的触变性。(c)从滴眼管包装中分配的流体凝胶(凝胶已被染色为蓝色，以便在照片中可见)。(d)在单一频率(1hz，0.5％应变)下获得的作为时间的函数的小变形流变数据。数据示出了剪切之后弹性网络的演变，导致从类液体行为(liquid
‑
like behaviour)转变为类固体行为(solid
‑
like behaviour)。(e)示出了流体凝胶应用之前(顶部图像)和应用之后(底部图像)的眼表的前段oct图像。图像示出了覆盖整个眼表的均匀层。
[0065]
图2.示出了配制的滴眼剂的生物活性的体外测定。(a)载有hrdecorin的滴眼剂在4小时(240分钟)内的累积释放曲线。最佳拟合线遵循幂函数，y＝0.7x
0.7
(r2＝0.99)。(b)pbs对照、仅胶原蛋白和胶原蛋白+hrdecorin的胶原蛋白原纤维生成浊度数据。(c)具有针对胶原蛋白、胶原蛋白+hrdecorin、胶原蛋白+仅流体凝胶(fluid gel，fg)、胶原蛋白+载有hrdecorin的流体凝胶(hrdecorin loaded fluid gel，decfg)的剂量响应曲线的胶原蛋白原纤维生成浊度数据。
[0066]
图3.角膜混浊面积测量。(a)在假单胞菌感染和处理之后第2、3、9、12和16天时拍摄的代表性照片。(b)示出了如由两名独立的不知情的眼科医生从每组的每只单独小鼠拍摄的照片(在图a中示出)中测量的混浊的平均面积
±
sem(mm2)(n＝6；**p<0.01，***p<0.001)的图。
[0067]
图4.角膜上皮再形成。(a)用于评估上皮的角膜中dari
+
细胞核(蓝色)的代表性图像，其举例说明了以下中的上皮的厚度和分层(细胞层数)：初始未受损伤的眼，其显示出正常的非角化复层(约5层)上皮；感染之后第2天拍摄的眼，其与增厚的水肿基质和细胞浸润有关；以及在处理之后第16天拍摄的眼，在第1组(庆大霉素和泼尼松龙)中显示出再上皮化，具有2至3层分层，伴有间质水肿的减少；在第2组(g.p.fg)中显示出分层增加；并且在第3组(g.p.decfg)中显示出完全成熟的上皮(比例尺100μm)。(b)角膜厚度
±
sem的定量，(c)上皮层厚度
±
sem的定量，以及(d)以下中的细胞上皮分层层
±
sem的定量：初始未受损伤的，(n＝6)；在第2天和来自每个处理组(对于每个组n＝6)的在第16天评估的眼。所有量化都是对观察者未知的掩蔽图像进行的。
[0068]
图5.角膜中的胞外基质水平。免疫组织化学染色的代表性图像以及量化以下的ir
的附图：(a)αsma
+
(绿色以对肌成纤维细胞进行染色)、(b)ir纤连蛋白
+
(绿色以对ecm中的纤连蛋白进行染色)和(c)层黏连蛋白
+
(红色以对ecm中的层黏连蛋白进行染色)，在每种情况下都使用dari
+
对细胞核进行染色(蓝色)。对未受损伤的眼、感染之后2天拍摄的眼和用以下多种滴眼剂进行处理16天之后获得的眼进行分析：i)庆大霉素和泼尼松龙(g.p)，ii)庆大霉素、泼尼松龙和流体凝胶(g.p.fg)，以及iii)庆大霉素、泼尼松龙和hrdecorin流体凝胶(g.p.decfg)。所有研究均使用n＝6的处理组进行，其中量化是对观察者未知的掩蔽图像进行的(比例尺＝100μm)。
[0069]
图6.体内实验设计。体内假单胞菌角膜炎研究的实验设计，其中将具有和不具有hrdecorin的流体凝胶滴眼剂与单独的庆大霉素和泼尼松龙滴眼剂进行比较。
[0070]
图7：作为初始结冷胶聚合物浓度的函数的储能模量(g’)，其表示结冷胶微凝胶混悬剂内的弹性结构；使用振幅扫描确定。(a)对于在500rpm的处理速率下制备的不同聚合物浓度在1hz(20℃)下获得的应变扫描。(b)对于在1000rpm的处理速率下的不同聚合物浓度在1hz(20℃)下获得的应变扫描。
[0071]
图8：作为聚合物浓度和处理速度的函数的储能模量的比较。g’在图7中所示的振幅扫描的线性黏弹区(linear viscoelastic region，lvr)内获得。
[0072]
图9：用于治疗干眼症(dry eye)的市售滴眼剂/软膏剂的储能模量的比较。从使用与针对结冷胶混悬剂所述的相同方法进行的振幅扫描中获得的数据。同样，值是在lvr内获得的。虚线表示优化的结冷胶制剂的g’。
[0073]
图10：作为初始结冷胶聚合物浓度的函数的流动谱(flow profile)，其表示结冷胶微凝胶混悬剂的易用性(ease of application)。(a)对于在500rpm的处理速率下制备的不同聚合物浓度在0.1和600s
‑1之间在20℃下获得的黏度扫描。(b)对于在100rpm的处理速率下制备的不同聚合物浓度在0.1和600s
‑1之间在20℃下获得的黏度扫描。
[0074]
图11：在1s
‑1下的作为聚合物浓度和处理速度的函数的微凝胶混悬剂黏度的比较。瞬时黏度是通过使用图10中所示的扫描来测量在1s
‑1下的值而获得的。
[0075]
图12：用于治疗干眼症的市售滴眼剂/软膏剂在1s
‑1下的黏度的比较。从使用与针对结冷胶混悬剂所述的相同方法进行的流动谱中获得的数据。虚线表示优化的结冷胶制剂的黏度。
[0076]
图13：作为所添加的交联剂的函数的储能模量(g’)，其表示结冷胶微凝胶混悬剂内的弹性结构；使用振幅扫描确定。(a)对于用于0.9％(w/v)体系的不同交联剂浓度在1hz(20℃)下获得的应变扫描。(b)对于用于1.8％(w/v)聚合物浓度的不同交联剂浓度在1hz(20℃)下获得的应变扫描。
[0077]
图14：作为交联剂和聚合物浓度的函数的储能模量的比较。g’在图7中所示的振幅扫描的线性黏弹区(lvr)内获得。
[0078]
图15：作为交联剂浓度的函数的流动谱，其表示结冷胶微凝胶混悬剂的易用性。(左)对于用不同浓度的交联剂制备的0.9％(w/v)结冷胶体系在0.1和600s
‑1之间在20℃下获得的黏度扫描。(右)对于用不同浓度的交联剂制备的1.8％(w/v)结冷胶体系在0.1和600s
‑1之间在20℃下获得的黏度扫描。
[0079]
图16：在1s
‑1下的作为聚合物和交联剂浓度的函数的微凝胶混悬剂黏度的比较。瞬时黏度是通过使用图3中所示的扫描来测量在1s
‑1下的值而获得的。
[0080]
图17：作为处理过程中所应用的冷却速率的函数的储能模量(g’)，其表示结冷胶微凝胶混悬剂内的弹性结构；使用振幅扫描确定。(a)对于用于在1000rpm的处理速率下制备的0.9％(w/v)体系的不同冷却速率在1hz(20℃)下获得的应变扫描。(b)对于用于在1000rpm的处理速率下的1.8％(w/v)聚合物浓度的不同冷却速率在1hz(20℃)下获得的应变扫描。
[0081]
图18：作为冷却速率和聚合物浓度的函数的储能模量的比较。g’在图7中所示的振幅扫描的线性黏弹区(lvr)内获得。
[0082]
图19：作为处理过程中所应用的冷却速率的函数的流动谱，其表示结冷胶微凝胶混悬剂的易用性。(a)对于在多种冷却速率下制备的0.9％(w/v)结冷胶体系在0.1和600s
‑1之间在20℃下获得的黏度扫描。(b)对于在多种冷却速率下制备的1.8％(w/v)结冷胶体系在0.1和600s
‑
之间在20℃下获得的黏度扫描。
[0083]
图20：在1s
‑1下的作为聚合物浓度和处理过程中所应用的冷却速率的函数的微凝胶混悬剂黏度的比较。瞬时黏度是通过使用图9中所示的扫描来测量在1s
‑1下的值而获得的。
[0084]
图21：作为处理过程中所施加的机械剪切的函数的储能模量(g’)，其表示结冷胶微凝胶混悬剂内的弹性结构；使用振幅扫描确定。(a)对于用于0.9％(w/v)体系的不同处理速度在1hz(20℃)下获得的应变扫描。(a)对于用于1.8％(w/v)聚合物浓度的不同处理速度在1hz(20℃)下获得的应变扫描。
[0085]
图22：作为处理速度和聚合物浓度的函数的储能模量的比较。g’在图7中所示的振幅扫描的线性黏弹区(lvr)内获得。
[0086]
图23：作为处理过程中所施加的机械剪切的函数的流动谱，其表示结冷胶微凝胶混悬剂的易用性。(a)对于在多种处理速度下制备的0.9％(w/v)结冷胶体系在0.1和600s
‑1之间在20℃下获得的黏度扫描。(b)对于在多种处理速度下制备的1.8％(w/v)结冷胶体系在0.1和600s
‑
之间在20℃下获得的黏度扫描。
[0087]
图24：在1s
‑1下的作为聚合物浓度和胶凝期间的处理速度的函数的微凝胶混悬剂黏度的比较。瞬时黏度是通过使用图9中所示的扫描来测量在1s
‑1下的值而获得的。
[0088]
图25：根据本发明的剪切稀化水凝胶组合物降低了与瘢痕形成相关的标志物在培养的成纤维细胞中的表达。向培养的人真皮成纤维细胞施用tgf
‑
β提高了α
‑
平滑肌肌动蛋白的表达，α
‑
平滑肌肌动蛋白是与瘢痕形成相关的肌成纤维细胞的标志物。图示出了用实验性水凝胶组合物进行的处理对这种表达的影响。本发明的水凝胶眼用组合物能够降低α
‑
sma的表达，指示抑制瘢痕形成的能力。
具体实施方式
[0089]
定义
[0090]
术语“水凝胶”在本文中用于指由分散在水性载剂中的亲水性聚合物形成的凝胶。
[0091]
术语“水性载剂”在本文中用于指水或基于水的流体(例如缓冲液，例如如磷酸盐缓冲盐水或生理流体，例如如血清)。
[0092]
术语“微凝胶”在本文中用于指由聚合物的微丝的网络形成的凝胶的微观颗粒。
[0093]
术语“剪切稀化”在本文中用于限定本发明的水凝胶组合物。该术语在本领域中是
公知的，并且是指当对水凝胶施加剪切力时黏度降低的水凝胶组合物。本发明的剪切稀化水凝胶组合物具有“静息(resting)”黏度(在没有施加任何剪切力的情况下)，并且当施加剪切力时具有较低的黏度。水凝胶组合物的这种特性使得它们能够流动并且当施加剪切力(例如，通过向包含本发明的水凝胶组合物的管或分配器施加力)时能够被施用于身体。一旦在施加剪切下应用并且所施加的剪切力去除，水凝胶组合物的黏度就会提高。通常，本发明的水凝胶组合物在受到剪切力以施用该水凝胶组合物时将具有低于1pa.s的黏度。在低于1pa.s的黏度下，水凝胶组合物将能够流动。静息黏度通常高于1pa.s，例如大于2pa.s、大于3pa.s或大于4pa.s。
[0094]
应理解，对“治疗”的提及包括预防病症以及缓解已确定的病症症状。因此，“治疗”状态(state)、障碍或病症包括：(1)预防或延迟可能患有或易患有所述状态、障碍或病症但尚未经历或表现出所述状态、障碍或病症的临床或亚临床症状的人中发生的所述状态、障碍或病症的临床症状的出现，(2)抑制所述状态、障碍或病症，即阻止、减少或延迟疾病的发生或其复发(在维持治疗的情况下)或其至少一种临床或亚临床症状，或者(3)缓解或减轻疾病，即，引起状态、障碍或病症或者其临床或亚临床症状中的至少一种的消退。
[0095]“治疗有效量”意指当施用于哺乳动物以治疗疾病时足以实现对疾病的这样的治疗的化合物的量。“治疗有效量”将根据化合物、疾病及其严重程度以及待治疗的哺乳动物的年龄、体重等而变化。关于本发明的眼用水凝胶组合物的或待并入这样的眼用水凝胶组合物中的饰胶蛋白聚糖或其他药剂的治疗有效量的另一些考虑因素在本说明书的其他地方进行了更详细的考虑。
[0096]
在本说明书的描述和权利要求书通篇，词语“包含/包括”和“含有/包含”及其变化形式意指“包括但不限于”，并且其不旨在(并且不)排除其他添加物、组分、整数或步骤。在本说明书的描述和权利要求书通篇，除非上下文另外要求，否则单数涵盖复数。特别地，在使用没有数量词修饰的名词的情况下，除非上下文另外要求，否则本说明书应理解为涵盖一个/种或更多个/种。
[0097]
将读者的注意力引导至与本技术有关的与本说明书同时或在本说明书之前提交并且与本说明书一起公开以供公众查看的所有文件和文献，并且所有这样的文件和文献的内容均通过引用并入本文。
[0098]
本发明的眼用水凝胶组合物
[0099]
本发明涉及剪切稀化眼用水凝胶组合物，并且除非上下文另外要求，否则本公开内容中对“水凝胶”、“组合物”或“水凝胶组合物”的所有提及都应视为与“剪切稀化眼用水凝胶组合物”相关。
[0100]
在本发明的第一方面中，提供了剪切稀化眼用水凝胶组合物，其包含分散在水性载剂中的：
[0101]
(i)0.1至5.0重量％(例如0.1至3.5重量％，或0.1至2.5重量％)的微凝胶颗粒形成聚合物；和
[0102]
(ii)0.5至100mm的单价和/或多价金属离子盐作为交联剂；
[0103]
其中水凝胶组合物具有在3至8的范围内的ph并且当水凝胶暴露于剪切时所述水凝胶组合物的黏度降低；并且
[0104]
其中所述组合物包含饰胶蛋白聚糖。
[0105]
本发明的眼用水凝胶组合物是剪切稀化的，这意味着当水凝胶暴露于剪切时组合物的黏度降低。这种特性使得当施加剪切力时水凝胶能够降低黏度和流动，从而使得能够通过施加剪切力(例如，通过挤压滴眼管或管的侧面)对它们进行分配和施用，例如从滴眼管到管。一旦施用并且施加至水凝胶的剪切力减小，水凝胶的黏度就会提高以形成能够在施用点停留较长时间的较稠凝胶。
[0106]
通常，本发明的水凝胶组合物在受到剪切力以施用所述水凝胶组合物时将具有低于1pa.s的黏度。在低于1pa.s的黏度下，水凝胶组合物将能够流动。静息黏度通常高于1pa.s，例如大于2pa.s、大于3pa.s或大于4pa.s。
[0107]
微凝胶颗粒形成聚合物可以是能够在水性载剂中形成微凝胶颗粒的任何聚合物。由微凝胶颗粒形成聚合物形成的微凝胶颗粒可具有任何合适的形态(例如，它们可以是线状的丝或者规则或不规则形状的颗粒)和/或粒度。与大凝胶结构相反，微凝胶颗粒的形成促进了期望的剪切稀化特性。不希望受任何特定理论的束缚，假设在不存在剪切或在低剪切水平的情况下，微凝胶颗粒结合在一起，基本上阻碍了水凝胶的整体流动。然而，在施加剪切力时，相邻微凝胶颗粒之间的相互作用被克服，并且黏度降低，从而使得水凝胶组合物能够流动。一旦所施加的剪切力被去除，则相邻微凝胶颗粒之间的相互作用可以重新形成，使得黏度再次提高并且容易流动的能力受到阻碍。
[0108]
在一个实施方案中，本发明的剪切稀化水凝胶组合物不包含胶原蛋白和/或纤维蛋白。
[0109]
合适地，水凝胶组合物包含0.1至5.0重量％的微凝胶颗粒形成聚合物。在一个实施方案中，水凝胶组合物包含0.1至3.5重量％的微凝胶颗粒形成聚合物。在一个实施方案中，水凝胶组合物包含0.5至2.5重量％的微凝胶颗粒形成聚合物。在一个实施方案中，水凝胶组合物包含0.8至1.8重量％的微凝胶颗粒形成聚合物。在另一个实施方案中，水凝胶组合物包含0.8至1.0重量％(例如0.9重量％)的微凝胶颗粒形成聚合物。
[0110]
合适地，微凝胶颗粒由一种或更多种多糖微凝胶颗粒形成聚合物形成。合适地，微凝胶颗粒不是由饰胶蛋白聚糖形成的。
[0111]
合适地，微凝胶颗粒形成聚合物是一种或更多种多糖微凝胶颗粒形成聚合物。在一个实施方案中，微凝胶颗粒形成聚合物选自以下组中的一种或更多种：结冷胶、藻酸盐、卡拉胶、琼脂糖。在一个具体实施方案中，微凝胶颗粒形成聚合物选自以下组中的一种或更多种：结冷胶、藻酸盐或卡拉胶。在一个更具体的实施方案中，微凝胶颗粒形成聚合物选自结冷胶或藻酸盐。在另一个实施方案中，微凝胶颗粒形成聚合物是结冷胶。在另一个实施方案中，微凝胶颗粒形成聚合物是藻酸盐。
[0112]
在一个替代实施方案中，微凝胶颗粒形成聚合物是明胶。
[0113]
本发明的眼用水凝胶组合物是透明的或半透明的。在一个具体实施方案中，眼用水凝胶组合物是透明的。
[0114]
在一个实施方案中，水凝胶组合物是透明或半透明的并且微凝胶颗粒形成聚合物选自结冷胶、藻酸盐和/或卡拉胶。在另一个实施方案中，水凝胶组合物是透明的并且微凝胶颗粒形成聚合物选自结冷胶、藻酸盐和/或卡拉胶。在一个具体实施方案中，水凝胶组合物是透明的并且微凝胶颗粒形成聚合物是结冷胶或藻酸盐。在另一个实施方案中，水凝胶组合物是透明的并且微凝胶颗粒形成聚合物是结冷胶。
[0115]
结冷胶(也称为结冷胶胶)是由细菌伊乐藻鞘氨醇单胞菌(sphingomonas elodea)产生的水溶性阴离子型多糖。其可以以商品名kelco gel(kelco gel cg la,azelis,uk)以低酰基形式商购获得。
[0116]
水凝胶组合物包含5至100mm的单价和/或多价金属离子盐作为交联剂。金属离子盐可作为一种组分添加至组合物，但它也可存在于组合物的其他组分中，例如如存在于组合物中的缓冲液(例如磷酸盐缓冲盐水)或任何生理流体例如如血清的组分。
[0117]
合适地，水凝胶组合物包含5至40mm的单价和/或多价金属离子盐作为交联剂。在一个实施方案中，水凝胶组合物包含5至30mm的单价和/或多价金属离子盐作为交联剂。在另一个实施方案中，水凝胶组合物包含5至20mm的单价和/或多价金属离子盐作为交联剂。在另一个实施方案中，水凝胶组合物包含5至15mm的单价和/或多价金属离子盐作为交联剂。在另一个实施方案中，水凝胶组合物包含8至12mm(例如10mm)的单价和/或多价金属离子盐作为交联剂。
[0118]
在本发明的一个具体实施方案中，微凝胶颗粒形成聚合物是结冷胶并且组合物包含0.5至40mm、5至15mm、8至12mm或10mm的单价金属离子盐(例如nacl)作为交联剂。
[0119]
在本发明的另一个实施方案中，微凝胶颗粒形成聚合物是藻酸盐并且组合物包含0.5至40mm、5至15mm、8至12mm或10mm的多价金属离子盐(例如ca
2+
盐)作为交联剂。
[0120]
合适地，水凝胶组合物具有在6至8范围内的ph。在一个实施方案中，水凝胶组合物具有在6.5至8范围内的ph。在另一个实施方案中，水凝胶组合物具有在7至7.5范围内的ph(例如ph 7.4)。
[0121]
合适地，本发明的水凝胶组合物具有1pa.s或更大(例如1pa.s至200pa.s或1pa.s至100pa.s)的静息黏度(即零剪切下的黏度)。更合适地，静息黏度为2pa.s或更大(例如2pa.s至200pa.s或2pa.s至100pa.s)、3pa.s或更大(例如3pa.s至200pa.s或3pa.s至100pa.s)、4pa.s或更大(例如4pa.s至200pa.s或4pa.s至100pa.s)、或者5pa.s或更大(例如5pa.s至200pa.s或5pa.s至100pa.s)。
[0122]
当水凝胶组合物受到剪切力时，黏度降低。合适地，黏度降低至低于静息黏度的、凝胶可以流动和施用的值。通常来说当施加剪切力时，黏度将降低至小于1pa.s的值。
[0123]
在一个实施方案中，水凝胶组合物具有1pa.s或更大(例如1pa.s至200pa.s或1pa.s至100pa.s)的静息黏度，并且当受到剪切力时，黏度降低至低于1pa.s。
[0124]
在另一个实施方案中，水凝胶组合物具有2pa.s或更大(例如2pa.s至200pa.s或2pa.s至100pa.s)的静息黏度，并且当受到剪切力时，黏度降低至低于2pa.s(例如降低至低于1pa.s)。
[0125]
在另一个实施方案中，水凝胶组合物具有3pa.s或更大(例如3pa.s至200pa.s或3pa.s至100pa.s)的静息黏度，并且当受到剪切力时，黏度降低至低于3pa.s(例如降低至低于1pa.s)。
[0126]
在另一个实施方案中，水凝胶组合物具有4pa.s或更大(例如4pa.s至200pa.s或4pa.s至100pa.s)的静息黏度，并且当受到剪切力时，黏度降低至低于4pa.s(例如降低至低于1pa.s)。
[0127]
在另一个实施方案中，水凝胶组合物具有5pa.s或更大(例如5pa.s至200pa.s或5pa.s至100pa.s)的静息黏度，并且当受到剪切力时，黏度降低至低于5pa.s(例如降低至低
于1pa.s)。
[0128]
为了避免疑义，本文中引用的所有黏度值均在20℃的正常环境温度下引用。本发明的水凝胶组合物的黏度可使用本领域中公知的标准技术来确定。例如，可使用配备有喷砂平行板(40mm，1mm间隙高度)的ar
‑
g2(tainstruments,uk)流变仪在20℃下获得黏度谱。
[0129]
合适地，水凝胶在零剪切下具有5pa至40pa的弹性模量。
[0130]
本发明的水凝胶的弹性模量可通过本领域中公知的技术来确定。
[0131]
一些具体实施方案
[0132]
本发明的一些具体实施方案包括其中剪切稀化眼用水凝胶组合物包含饰胶蛋白聚糖和以下的那些：
[0133]
(1)0.1至5.0重量％(例如0.1至3.5重量％或0.1至2.5重量％)的微凝胶颗粒形成聚合物(例如结冷胶)；
[0134]
0.5至40mm的单价金属离子盐(例如nacl)或多价金属离子盐(例如ca
2+
)作为交联剂；并且
[0135]
水凝胶组合物的ph为3.5至8。
[0136]
(2)0.1至5.0重量％(例如0.1至3.5重量％或0.1至2.5重量％)的微凝胶颗粒形成聚合物(例如结冷胶)；
[0137]
0.5至40mm的单价金属离子盐(例如nacl)或多价金属离子盐(例如ca
2+
)作为交联剂；并且
[0138]
水凝胶组合物的ph为6至8。
[0139]
(3)0.1至5.0重量％(例如0.1至3.5重量％或0.1至2.5重量％)的微凝胶颗粒形成聚合物(例如结冷胶)；
[0140]
0.5至40mm的单价金属离子盐(例如nacl)或多价金属离子盐(例如ca
2+
)作为交联剂；并且
[0141]
水凝胶组合物的ph为6.5至7.5。
[0142]
(4)0.5至2.0重量％的微凝胶颗粒形成聚合物(例如结冷胶)；
[0143]
0.5至40mm的单价金属离子盐(例如nacl)或多价金属离子盐(例如ca
2+
)作为交联剂；并且
[0144]
水凝胶组合物的ph为3.5至8。
[0145]
(5)0.8至1.8重量％的微凝胶颗粒形成聚合物(例如结冷胶)；
[0146]
0.5至40mm的单价金属离子盐(例如nacl)或多价金属离子盐(例如ca
2+
)作为交联剂；并且
[0147]
水凝胶组合物的ph为6至8。
[0148]
(6)0.8至1.0重量％的微凝胶颗粒形成聚合物(例如结冷胶)；
[0149]
0.5至40mm的单价金属离子盐(例如nacl)或多价金属离子盐(例如ca
2+
)作为交联剂；并且
[0150]
水凝胶组合物的ph为6.5至7.5。
[0151]
(7)0.5至2.5重量％的微凝胶颗粒形成聚合物(例如结冷胶)；
[0152]
0.5至40mm的单价金属离子盐(例如nacl)或多价金属离子盐(例如ca
2+
)作为交联剂；并且
[0153]
水凝胶组合物的ph为3.5至8。
[0154]
(8)0.5至2.5重量％的微凝胶颗粒形成聚合物(例如结冷胶)；
[0155]
5至20mm的单价金属离子盐(例如nacl)或多价金属离子盐(例如ca
2+
)作为交联剂；并且
[0156]
水凝胶组合物的ph为6至8。
[0157]
(9)0.5至2.5重量％的微凝胶颗粒形成聚合物(例如结冷胶)；
[0158]
5至15mm的单价金属离子盐(例如nacl)或多价金属离子盐(例如ca
2+
)作为交联剂；并且
[0159]
水凝胶组合物的ph为6至8。
[0160]
(10)0.5至2.5重量％的微凝胶颗粒形成聚合物(例如结冷胶)；
[0161]
8至12mm(例如10mm)的单价金属离子盐(例如nacl)或多价金属离子盐(例如ca
2+
)作为交联剂；并且
[0162]
水凝胶组合物的ph为6至8。
[0163]
(11)0.5至2.5重量％的微凝胶颗粒形成聚合物(例如结冷胶)；
[0164]
0.5至40mm的单价金属离子盐(例如nacl)或多价金属离子盐(例如ca
2+
)作为交联剂；并且
[0165]
水凝胶组合物的ph为6至8。
[0166]
(12)0.8至1.8重量％的微凝胶颗粒形成聚合物(例如结冷胶)；
[0167]
5至20mm的单价金属离子盐(例如nacl)或多价金属离子盐(例如ca
2+
)作为交联剂；并且
[0168]
水凝胶组合物的ph为6至8。
[0169]
(13)0.8至1.0重量％的微凝胶颗粒形成聚合物(例如结冷胶)；
[0170]
5至15mm的单价金属离子盐(例如nacl)或多价金属离子盐(例如ca
2+
)作为交联剂；并且
[0171]
水凝胶组合物的ph为6至8。
[0172]
(14)0.8至1.0重量％的微凝胶颗粒形成聚合物(例如结冷胶)；
[0173]
8至12mm(例如10mm)的单价金属离子盐(例如nacl)或多价金属离子盐(例如ca
2+
)作为交联剂；并且
[0174]
水凝胶组合物的ph为6至8。
[0175]
治疗剂
[0176]
如前所讨论的，本发明的剪切稀化眼用水凝胶组合物包含药物活性治疗剂饰胶蛋白聚糖。在本发明的某些实施方案中，水凝胶组合物可包含一种或更多种另外的药理学活性剂。可存在任何合适的药理学活性剂。例如，水凝胶组合物可包含选自以下的一种或更多种另外的药理学活性剂：另外的抗纤维化剂；抗感染剂；和抗炎剂。
[0177]
在一个实施方案中，眼用水凝胶组合物包含饰胶蛋白聚糖，其量为0.1至1.0mg/ml；0.1至0.5mg/ml；0.1至0.4mg/ml；或0.2至0.3mg/ml。
[0178]
在另一个实施方案中，在以上段落(1)至(14)中限定的任一种水凝胶组合物中，眼用水凝胶组合物包含饰胶蛋白聚糖，其量为0.1至1.0mg/ml；0.1至0.5mg/ml；0.1至0.4mg/ml；或0.2至0.3mg/ml。
[0179]
眼用水凝胶组合物可包含任意合适量的另外的药理学活性剂。例如，水凝胶组合物可包含0.01至50重量％的另外的药理学活性剂。
[0180]
在包含抗感染剂例如抗生素庆大霉素的本发明组合物的一个实施方案中，所述抗感染剂可以以1至5mg/ml的量存在。例如，抗感染剂，例如庆大霉素，可以以1至4mg/ml、1至3mg/ml或1至2mg/ml的量存在。抗感染剂，例如庆大霉素，可以以2至4mg/ml或2.5至3.5mg/ml的量存在。
[0181]
在包含抗炎剂例如类固醇泼尼松龙的本发明组合物的一个实施方案中，所述抗炎剂可以以0.5至250mg/ml的量存在。合适地，抗炎剂例如泼尼松龙可以以1.25至170mg/ml，例如1.25至50mg/ml或1.25至10mg/ml的量存在。
[0182]
制备本发明的水凝胶组合物的方法
[0183]
本发明还提供了制备如本文中限定的剪切稀化眼用水凝胶组合物的方法，所述方法包括以下步骤：
[0184]
a)将微凝胶形成聚合物溶解在水性载剂中以形成聚合物溶液；
[0185]
b)在高于微凝胶颗粒形成聚合物的胶凝温度的温度下将步骤(a)中形成的微凝胶形成聚合物溶液与单价或多价金属离子盐的水溶液混合；以及
[0186]
c)将来自步骤b)的所得混合物冷却至低于微凝胶颗粒形成聚合物的胶凝温度的温度；
[0187]
并且其中：
[0188]
i)在步骤b)期间；或者
[0189]
ii)在步骤c)期间，在其中来自步骤b)的混合物处于高于微凝胶颗粒形成聚合物的胶凝温度的温度下的点向混合物添加饰胶蛋白聚糖。
[0190]
合适地，步骤a)通过将微凝胶颗粒形成聚合物和水性载剂加热至高于微凝胶颗粒形成聚合物的胶凝温度的温度来进行。例如，在其中微凝胶颗粒形成聚合物是结冷胶的一些实施方案中，结冷胶/水性载剂混合物可加热至60至90℃(例如70℃)以溶解结冷胶聚合物。
[0191]
应理解，所溶解的聚合物的量将取决于水凝胶组合物中所需的聚合物的量(即，其将在上文中针对水凝胶组合物所限定的限制内)。
[0192]
在步骤b)中，将步骤a)中形成的溶液合适地维持在高于微凝胶颗粒形成聚合物的胶凝温度的温度下，并与单价或多价金属离子盐的水溶液混合。合适地，在步骤b)中，在添加单价或多价金属离子盐的溶液之前、期间和/或之后，持续搅拌来自步骤a)的溶液。例如，混合物可以以50至2000转/分钟(revolution per minute，rpm)的速率混合以确保彻底混合。在一个实施方案中，可使用300至900rpm或500至800rpm的混合速率。本领域技术人员将理解，可改变混合速率和混合设备以提供期望水平的剪切/搅拌。
[0193]
在其中微凝胶颗粒形成聚合物是结冷胶的一个实施方案中，来自步骤a)的结冷胶/水性载剂溶液可被冷却至例如35至50℃(例如40℃)的温度，然后与单价阳离子溶液混合。
[0194]
应理解，所添加的单价或多价金属离子盐溶液的量将取决于最终水凝胶组合物中所需的金属离子盐的量(即，其将在上文中针对水凝胶组合物所限定的限制内)。
[0195]
在步骤c)中，将来自步骤b)的混合物冷却至低于微凝胶颗粒形成聚合物的胶凝温
度的温度，使得在水凝胶组合物中形成微凝胶颗粒。合适地，来自步骤b)的混合物在恒定的混合下逐渐冷却。在一个实施方案中，来自步骤b)的混合物在施加持续搅拌/剪切的情况下以恒定的冷却速率冷却。在搅拌/剪切下的冷却可以继续直至混合物达到环境温度(例如20℃)，此时可收集并储存最终的水凝胶组合物，例如在冷藏条件下。
[0196]
步骤c)中使用的冷却速率和所施加的剪切/搅拌量可变化。例如，可使用0.2至4℃/分钟、0.5至3℃/分钟、0.5至2℃/分钟、0.5至1.5℃/分钟或1℃/分钟的冷却速率。所施加的剪切量可以是例如50至2000rpm、300至900rpm或400至500(例如450)rpm。可使用任何合适的设备来提供所需的搅拌/剪切。在所附实施例中，使用配备有杯(cup)和叶片几何形状(vane geometry)(杯：直径35mm，叶片：直径28mm)的旋转流变仪(ar
‑
g2,ta instruments,uk)来提供所需的剪切。
[0197]
可向所述方法的步骤b)或步骤c)中的混合物添加饰胶蛋白聚糖。合适地，在步骤c)期间，在其中混合物高于微凝胶颗粒形成聚合物的胶凝温度的点，添加饰胶蛋白聚糖。最合适地，将来自步骤b)的混合物冷却至高于微凝胶颗粒形成聚合物的胶凝温度的温度，添加饰胶蛋白聚糖并将其彻底混合到混合物中，并随后将混合物进一步冷却至低于微凝胶颗粒形成聚合物的胶凝温度的温度。
[0198]
合适地，向步骤b)或步骤c)中的混合物添加饰胶蛋白聚糖水溶液形式的饰胶蛋白聚糖。
[0199]
除饰胶蛋白聚糖之外，可在步骤b)或步骤c)期间(在高于微凝胶颗粒形成聚合物的胶凝温度的温度下)添加另外的药理学活性剂。
[0200]
在另一个方面中，本发明提供了制备如本文中限定的剪切稀化眼用水凝胶组合物的方法，所述方法包括以下步骤：
[0201]
a)将微凝胶形成聚合物溶解在包含0.5至100mm的单价和/或多价金属离子盐作为交联剂的水性载剂中以形成包含0.1至5.0重量％(例如0.1至3.5重量％或0.1至2.5重量％)的微凝胶颗粒形成聚合物的聚合物溶液；
[0202]
b)在剪切混合下将来自步骤a)的所得混合物冷却至低于微凝胶颗粒形成聚合物的胶凝温度的温度；
[0203]
并且其中：
[0204]
i)在步骤a)中；或者
[0205]
ii)在步骤b)期间，在其中来自步骤a)的混合物处于高于微凝胶颗粒形成聚合物的胶凝温度的温度下的点向混合物添加饰胶蛋白聚糖。
[0206]
在本发明的上述方面中，除了将微凝胶颗粒形成聚合物直接溶解在包含0.5至100mm的单价和/或多价金属离子盐作为交联剂的水性载剂中之外，该方法与以上限定的先前方法相同。上述步骤a)、b)和c)的条件和变量同样适用于所述方法的这种变体。
[0207]
可向所述方法的步骤a)或步骤b)中的混合物添加饰胶蛋白聚糖。合适地，在步骤b)期间，在混合物高于微凝胶颗粒形成聚合物的胶凝温度的点，添加饰胶蛋白聚糖。最合适地，将来自步骤a)的混合物冷却至高于微凝胶颗粒形成聚合物的胶凝温度的温度，添加饰胶蛋白聚糖并将其彻底混合到混合物中，并随后将混合物进一步冷却至低于微凝胶颗粒形成聚合物的胶凝温度的温度。
[0208]
合适地，向步骤a)或步骤b)中的混合物添加饰胶蛋白聚糖水溶液形式的饰胶蛋白
聚糖。
[0209]
除饰胶蛋白聚糖之外，可在步骤a)或步骤b)期间(在高于微凝胶颗粒形成聚合物的胶凝温度的温度下)添加另外的药理学活性剂。
[0210]
在另一个方面中，本发明提供了剪切稀化凝胶组合物，其可通过本文中限定的任何制备方法获得、其通过本文中限定的任何制备方法获得或者其通过本文中限定的任何制备方法直接获得。
[0211]
本发明组合物的医学用途和使用本发明组合物的治疗方法
[0212]
本发明的一个方面提供了用作药物的本发明组合物。本发明组合物适合于以下医学用途：抑制瘢痕形成(如在本发明的另一个方面中所述的)；以及预防和/或治疗感染；和预防和/或治疗炎症。用于这样的医学用途的组合物可根据需要包含选自以下的活性剂：抗纤维化剂；抗感染剂；和抗炎剂。
[0213]
如上文已提及的，本发明组合物也适用于医学治疗的方法。例如，本发明组合物可用于选自以下的方法：用于抑制瘢痕形成的方法；用于预防和/或治疗感染的方法；和用于预防和/或治疗炎症的方法。在实施这样的方法时，可根据需要向以下对象施用本发明组合物：需要抑制瘢痕形成的对象；需要预防和/或治疗感染的对象；或需要预防和/或治疗炎症的对象。
[0214]
合适地，本发明的组合物可用于在患有微生物性角膜炎的对象中用于抑制瘢痕形成的方法。这样的用途还可预防和/或治疗引起微生物性角膜炎的感染。这样的用途还可预防和/或治疗与微生物性角膜炎相关的炎症。
[0215]
如上，用于这样的治疗方法的组合物可根据需要包含选自以下的活性剂：另外的抗纤维化剂(除饰胶蛋白聚糖之外)；抗感染剂；和抗炎剂。
[0216]
除非在上下文另外要求的情况下，否则本公开内容中阐述的关于本发明组合物的医学用途的考虑也应被视为适用于使用本发明组合物的治疗方法。类似地，本公开内容中阐述的关于使用本发明组合物的治疗方法的考虑也应被视为适用于本发明组合物的医学用途。
[0217]
抑制瘢痕形成
[0218]
认为瘢痕形成在许多临床情况下会导致有害作用。例如，眼的瘢痕形成可与视力丧失和失明风险有关。
[0219]
应理解，“抑制瘢痕形成”涵盖部分抑制瘢痕形成和完全抑制瘢痕形成二者。下文进一步描述与根据本发明可抑制瘢痕形成的程度相关的合适值。
[0220]
合适地，用于抑制瘢痕形成的本发明的眼用组合物可包含结冷胶。如上文进一步讨论的，与现有技术组合物相比，包含结冷胶和饰胶蛋白聚糖的本发明的眼用组合物在抑制瘢痕形成方面提供了出乎意料的益处。特别地，与使用ecm材料(例如胶原蛋白和/或纤维蛋白)的现有技术的那些组合物相比，并入了剪切稀化结冷胶水凝胶的本发明的眼用水凝胶组合物提供了显著的益处。
[0221]
可通过本发明组合物的医学用途来抑制的眼中瘢痕形成的种类包括角膜的瘢痕形成、视网膜的瘢痕形成、眼表的瘢痕形成和视神经中和周围的瘢痕形成。虽然本发明组合物适合于表面使用，但是应理解，表面施用的药剂可对内部解剖学具有影响。因此，施用于眼表面的组合物可有效抑制眼内瘢痕形成。合适地，使用本发明的组合物或方法来抑制的
瘢痕形成可包括：与感染例如微生物性角膜炎相关的瘢痕形成；与意外伤害相关的瘢痕形成；和与手术伤害相关的瘢痕形成。
[0222]
本发明的眼用水凝胶组合物在抑制与角膜炎相关的瘢痕形成方面具有特别的效用。角膜炎可由感染例如微生物感染、病毒感染、寄生虫感染或真菌感染引起。本发明的组合物和方法在抑制与微生物性角膜炎相关的瘢痕形成方面显示出特别的效用。
[0223]
角膜炎也可因伤害或包括自身免疫病(例如类风湿性关节炎或舍格伦综合征(sjogren’s syndrome))在内的疾病而引起。本发明的组合物和方法还可用于抑制与由这些原因引起的角膜炎相关的瘢痕形成。
[0224]
合适地，本发明的组合物可包含另外的药理学活性剂，例如另外的抗纤维化剂；抗感染剂；抗炎剂。
[0225]
可通过本发明组合物的医学用途来抑制的眼中瘢痕形成还可包括：与手术，例如用于治疗青光眼的手术(例如通过插入支架)和手术操作例如lasik或lasek手术相关的瘢痕形成；以及与意外伤害相关的瘢痕形成。
[0226]
技术人员将知道允许鉴定和量化眼中瘢痕形成的许多合适的方法。这些方法也可用于鉴定眼中瘢痕形成的抑制。因此，它们可用于举例说明本发明组合物的有效医学用途、鉴定饰胶蛋白聚糖的治疗有效剂量以及鉴定和/或选择并入到本发明组合物中的另外的药理学活性剂。
[0227]
技术人员将意识到，存在许多这样的参数：通过这些参数可评估眼中瘢痕形成的抑制。这些参数的一些实例在实施例中进一步讨论。这些中的一些，例如ecm组分或肌成纤维细胞的诱导，也常见于眼之外的身体部位，而另一些则是眼特有的。
[0228]
例如，眼中的瘢痕形成可通过角膜混浊提高来指示。这样的角膜混浊提高可通过不透明的角膜面积的提高来证明。因此，瘢痕形成的抑制可通过与合适的对照相比角膜混浊降低来指示。这样的角膜混浊降低可通过不透明的角膜面积的降低来证明。
[0229]
在实施例中列出的数据中证明了包含抗纤维化剂饰胶蛋白聚糖的本发明组合物降低角膜混浊以及随时间维持这样的降低的能力。
[0230]
类似地，眼的瘢痕形成可通过肌成纤维细胞存在的提高来指示。因此，瘢痕形成的抑制可通过与合适的对照相比肌成纤维细胞数目的降低来指示。
[0231]
肌成纤维细胞在受伤部位处发育并与瘢痕形成响应的进展相关。它们的特征在于它们表达α
‑
平滑肌肌动蛋白(α
‑
smooth muscle actin，α
‑
sma)。肌成纤维细胞对瘢痕形成具有许多不良影响，包括在愈合的区域内引起收缩。与瘢痕形成相关的肌成纤维细胞的提高可通过α
‑
平滑肌肌动蛋白表达的提高来证明。这种类型的肌成纤维细胞数目的降低可通过α
‑
平滑肌肌动蛋白表达的降低来证明。如在体外和体内评估的，本发明的组合物能够抑制α
‑
sma表达，从而证明它们抑制瘢痕形成的能力。
[0232]
如实施例中进一步讨论的，本发明的组合物能够在体内抑制肌成纤维细胞分化，并且还能够在微生物性角膜炎的实验模型中随时间维持这种降低的分化。
[0233]
肌成纤维细胞分化可响应于tgf
‑
β1的作用而提高，tgf
‑
β1是一种引起对α
‑
sma表达的诱导的纤维化生长因子。实施例列出了体外研究(在人真皮成纤维细胞中)的细节，其举例说明了本发明组合物阻断α
‑
sma表达的这种提高的能力。这表明尽管在所使用的示例性组合物中不存在胶原蛋白和/或纤维蛋白，但并入到本发明的眼用水凝胶组合物中的饰
胶蛋白聚糖能够有效地阻断纤维化生长因子(例如tgf
‑
β)的活性。
[0234]
纤维化还与受伤部位处的ecm成分的表达和沉积有关。在瘢痕形成中沉积的ecm的量可提高，并且ecm的布置可与未受损的比较组织中发现的不同。实施例中给出的数据举例说明了使用本发明组合物的治疗产生了其中ecm组分的布置更接近于未受伤组织的布置的组织，由此举例说明了这些组合物在抑制瘢痕形成中的效用。
[0235]
与合适的对照剂相比，包含抗纤维化饰胶蛋白聚糖的本发明眼用组合物可以能够实现至少5％的对眼中纤维化的抑制。例如，与合适的对照剂相比，合适的抗纤维化剂可以能够实现至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的抑制。与合适的对照剂相比，适合于并入到本发明组合物中的抗纤维化剂可以能够基本上实现对瘢痕形成的完全抑制。
[0236]
出于同样的原因，与合适的对照相比，本发明组合物抑制眼中瘢痕形成的医学用途或使用这样的组合物抑制眼中瘢痕形成的治疗方法可实现至少5％的抑制。例如，与合适的对照相比，这样的医学用途或治疗方法可实现至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的抑制。与合适的对照相比，本发明的医学用途或治疗方法可基本上实现对瘢痕形成的完全抑制。
[0237]
本领域技术人员将容易地确定合适对照的选择。仅举例来说，用于评估本发明组合物抑制眼中的瘢痕形成的能力的合适对照可以由公认的标准护理(standard of care)或其实验性代用物提供。
[0238]
除非上下文另外要求，否则在眼的瘢痕形成的情况下，在此给出的值和其他考虑因素通常可全部都可特别适用于角膜瘢痕形成。
[0239]
适合于并入到本发明组合物中的活性剂
[0240]
除抗纤维化剂饰胶蛋白聚糖之外，旨在用于医学用途或用于治疗方法的本发明组合物可包含另外的活性剂。可参考预期的医学用途来选择合适的另外的活性剂。然而，为了举例说明，合适的另外的活性剂可选自：另外的抗纤维化剂；抗感染剂；和抗炎剂。
[0241]
为了避免疑义，本发明的组合物可合适地包含多于一种活性剂。在组合物包含多于一种活性剂的情况下，所述活性剂可以是特定类别活性剂内的多于一种活性剂(例如两种或更多种抗纤维化剂)，或选自两种或更多种不同类别的药剂的组合(例如抗纤维化饰胶蛋白聚糖和抗感染剂，或抗纤维化饰胶蛋白聚糖和抗炎剂)。
[0242]
可并入到本发明组合物中的另外的抗纤维化剂的一些实例在下文中更详细地讨论。
[0243]
仅举例来说，适合于作为活性剂并入到本发明组合物中的抗感染剂可以是抗微生物剂。例如，这样的抗病毒剂、抗真菌剂或抗蠕虫剂。在抗微生物剂的情况下，合适的抗感染剂可以是抗生素，例如庆大霉素。可并入到本发明组合物中的抗微生物剂的许多其他合适的实例，包括另外的抗生素，将是本领域技术人员公知的。
[0244]
包含抗感染剂的本发明组合物可用于预防和/或治疗感染的方法中。因此，应理解，这样的组合物可施用于需要预防和/或治疗感染的对象。需要这样的预防和/或治疗的对象可以是患有微生物性角膜炎的对象。
[0245]
用于作为活性剂并入到本发明组合物中的抗炎剂可选自：类固醇，例如皮质类固醇(例如泼尼松龙)；非甾体抗炎药(non
‑
steroidal anti
‑
inflammatory drug，nsaid)，例如cox
‑
1和/或cox
‑
2酶抑制剂；抗组胺剂，例如h1受体拮抗剂；白介素
‑
10；吡非尼酮；免疫调节剂；和类肝素剂(heparin
‑
like agent)。
[0246]
包含抗炎剂的本发明组合物可用于预防和/或治疗炎症的方法中。因此，这样的组合物可施用于需要预防和/或治疗炎症的对象。合适地，对象可以是患有慢性炎症或急性炎症或者处于发生慢性炎症或急性炎症的风险之中的对象。仅举例来说，炎症可由微生物性角膜炎引起。
[0247]
合适地，本发明的组合物可包含用于与抗感染剂庆大霉素和抗炎剂泼尼松龙组合使用的饰胶蛋白聚糖。这种类型的组合物可包含饰胶蛋白聚糖、泼尼松龙和庆大霉素。本发明的这样的组合物适用于抑制与微生物性角膜炎相关的瘢痕形成，如实施例中列出的数据所示的。
[0248]
本发明的组合物并入了治疗有效量的抗纤维化剂饰胶蛋白聚糖。抗纤维化剂，例如饰胶蛋白聚糖的治疗有效量在下文中进一步详细讨论。本发明的组合物还可包含治疗有效量的另外的活性剂。
[0249]
治疗有效量的饰胶蛋白聚糖或另外的活性剂将能够在单次施用中或作为包含多次发生施用的治疗过程的一部分实现期望的临床结果。技术人员将充分了解用于计算多种类型的活性剂的治疗有效量的合适方案和程序。
[0250]
合适地，活性剂可以以0.1ng/ml至10mg/ml的浓度并入到本发明组合物中。例如，活性剂可以以1ng/ml至5mg/ml、10ng/ml至2.5mg/ml、或20ng/ml至1mg/ml、约0.1μg/ml至0.5μg/ml，合适地约0.24μg/ml的浓度并入到本发明组合物中。
[0251]
抗纤维化剂
[0252]
抗纤维化剂是能够引起对向其提供所述抗纤维化剂的身体部位中的瘢痕形成的抑制的药剂。在说明书的其他地方更一般地考虑了瘢痕形成的抑制。
[0253]
并入到本发明的眼用水凝胶组合物中的饰胶蛋白聚糖是抗纤维化剂的一个实例，并且许多其他抗纤维化剂是本领域技术人员已知的。因此，技术人员将能够容易地确定可有利地并入到本发明组合物中用于抑制瘢痕形成的抗纤维化剂。下面提供了适合于这样的用途的抗纤维化剂实例的非排他性列表。
[0254]
合适的抗纤维化剂可选自：抗纤维化胞外基质(ecm)组分；抗纤维化生长因子(出于本公开内容的目的，其应被视为还涵盖抗纤维化细胞因子、趋化因子等)；和纤维化剂的抑制剂，例如功能阻断抗体。
[0255]
抗体可通过与细胞信号传导剂结合并由此阻断由这些药剂的活性引起的功能来用于破坏某些细胞活动。可被阻断的这样的活动的一些实例包括：细胞增殖、细胞迁移、蛋白酶产生、细胞凋亡和失巢凋亡。仅举例来说，合适的阻断抗体可以能够结合以下细胞信号传导剂组中的一种或更多种：ecm组分、生长因子、细胞因子、趋化因子或matrikine。
[0256]
饰胶蛋白聚糖是抗纤维化ecm组分的一个实例。饰胶蛋白聚糖可以是人饰胶蛋白聚糖。合适地，饰胶蛋白聚糖可以是人重组饰胶蛋白聚糖。可并入到本发明组合物中的人重组饰胶蛋白聚糖的一个实例是由catalent pharma solutions,inc.以“galacorin
tm”的名称生产和销售的。
[0257]
用于并入到本发明组合物中的饰胶蛋白聚糖可以是这种蛋白聚糖的全长天然存在形式。或者，本发明的组合物可以使用天然存在的饰胶蛋白聚糖的抗纤维化片段或抗纤维化变体。
[0258]
天然存在的饰胶蛋白聚糖是一种蛋白聚糖。蛋白聚糖(包含核心蛋白和糖胺聚糖链二者)或其片段可用于本发明的水凝胶组合物。然而，本发明人已经证明单独的核心蛋白(没有糖胺聚糖链)足以抑制眼中的瘢痕形成。因此，在本说明书中对饰胶蛋白聚糖(或其片段或变体)的提及可以替代地被解释为针对没有糖胺聚糖链的核心蛋白。本发明人认为，用于与纤维化生长因子(例如tgf
‑
β)结合并阻断其生物学功能的是饰胶蛋白聚糖的核心蛋白。
[0259]
饰胶蛋白聚糖的合适的抗纤维化片段可占全长天然存在分子的多至50％、全长天然存在分子的多至75％、或全长天然存在分子的多至90％。合适的饰胶蛋白聚糖抗纤维化片段可包含饰胶蛋白聚糖的tgf
‑
β结合部分。
[0260]
饰胶蛋白聚糖的抗纤维化变体与天然存在蛋白聚糖的不同之处在于核心蛋白的氨基酸序列中存在一个或更多个突变。这些突变可引起核心蛋白中存在的一个或更多个氨基酸残基的添加、缺失或替换。仅举例来说，与天然存在核心蛋白的氨基酸序列相比，适合于并入到本发明组合物中的合适的饰胶蛋白聚糖抗纤维化变体可包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少10个、至少15个或至少20个突变。
[0261]
除非在上下文另有要求的情况下，否则本文中对饰胶蛋白聚糖的提及，连同该药剂在本发明组合物中的并入，也应被视为涵盖饰胶蛋白聚糖的抗纤维化片段或抗纤维化变体的使用。
[0262]
在一个合适的实施方案中，饰胶蛋白聚糖构成本发明组合物中存在的唯一ecm组分。合适地，饰胶蛋白聚糖可以是并入到根据本发明的眼用水凝胶组合物中的唯一抗纤维化活性剂。
[0263]
适合于并入到本发明组合物中的抗纤维化生长因子包括选自以下的那些：转化生长因子β3、血小板源性生长因子aa、胰岛素样生长因子
‑
1、表皮生长因子、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，fgf)2、fgf7、fgf10、fgf22、血管内皮生长因子a、角质形成细胞生长因子和肝细胞生长因子。
[0264]
纤维化剂的抑制剂代表可并入到本发明组合物中的另外的抗纤维化剂的合适的实例。这样的抑制剂的一些实例包括与纤维化剂结合并因此阻断纤维化剂活性的药剂。这样的抑制剂的一些实例包括功能阻断抗体或细胞受体(纤维化剂通过其诱导细胞信号传导)的可溶性片段。这样的抑制剂的其他实例包括阻止纤维化剂表达的药剂。这些种类的抑制剂的一些实例包括选自反义寡核苷酸和干扰rna序列的那些。
[0265]
适用于抑制瘢痕形成的本发明的组合物将并入治疗有效量的抗纤维化剂。这样的治疗有效量将能够在单次施用中或者作为包含多次发生的施用的治疗过程的一部分抑制瘢痕形成。上文考虑了可如何评估瘢痕形成的抑制以及因此可如何计算或识别治疗有效量的细节。
[0266]
仅举例来说，本发明组合物可包含浓度为0.1ng/ml至10mg/ml、1ng/ml至5mg/ml、10ng/ml至2.5mg/ml、20ng/ml至1mg/ml、约0.1μg/ml至0.5μg/ml，合适地约0.24μg/ml的饰胶蛋白聚糖。
[0267]
表面施用和表面组合物
[0268]
本发明的组合物适合于表面施用于眼。为了避免疑义，在本公开内容的上下文中，“表面施用”被认为涉及将组合物直接施用于眼的表面。适合于这样的表面施用的本发明组合物可被称为本发明的表面眼用组合物。
[0269]
本发明的表面组合物可用于施用于在眼的表面上的感染或受伤包括但不限于：感染、擦伤、切口、切除、烧伤和刺伤伤口的部位。合适地，本发明的表面组合物可用于施用于角膜。
[0270]
将理解的是，表面组合物可以以在这样的情况下使用的常规方式配制。例如，合适的表面组合物可配制成使得其不对施用所述表面组合物的感染或受伤区域诱发刺激或炎症。
[0271]
实施例
[0272]
本发明人已提供了用于持续递送强效抗瘢痕形成分子(hrdecorin)的新的滴眼剂系统。该滴眼剂的新颖之处在于在制备期间的结构化方法，该方法产生了可在固态和液态之间转变的材料，使得通过眨眼缓慢去除保留在动态环境中。在假单胞菌角膜炎(pseudomonas keratitis)的鼠模型中，施加滴眼剂导致在16天内降低角膜混浊。更明显的是，添加hrdecorin导致无瘢痕恢复和角膜完整性，如由完全上皮再形成以及αsma、纤连蛋白和层黏连蛋白的降低所表明的。该药物递送系统对于患有微生物性角膜炎的患者是理想的非侵入性抗纤维化治疗，可能在不求助于手术的情况下挽救可能无法进行角膜移植的发展中国家的许多人的视力。
[0273]
本发明人已提供了新类别的滴眼剂材料的报告，所述材料允许治疗剂长时间保留在眼睛表面上，同时通过眨眼过程逐渐清除。该材料是通过对基于结冷胶的水凝胶进行剪切形成的，所述基于结冷胶的水凝胶是目前以稀释形式使用以在凝胶化过程期间增稠滴眼剂(例如timoptol)的材料。施加剪切阻止了连续聚合物网络的形成，并导致形成可呈现球形和带状形态的相互作用的颗粒。剪切处理后，当溶液静止时，这些颗粒相互作用并形成连续结构。然而，当施加剪切时(例如当通过滴眼管挤出时)，干扰颗粒的连续网络并且材料液化。随后去除剪切力导致立即愈合。该材料能够经历的固
‑
液
‑
固转变意味着它完全符合眼表，并且通过眼睑眨眼动力学逐渐去除。重要的是，结冷胶是光学透明的并且因此该材料可在施加后继续传输光，对患者造成的干扰最小。
[0274]
已开发了可载有饰胶蛋白聚糖以提供局部药物递送并保留在眼表的流体凝胶滴眼剂。该材料组合了结构化的结冷胶与蛋白聚糖，饰胶蛋白聚糖。另外，结合高光学清晰度，fda批准的聚合物(fda参考号172.665)与临床级hrdecorin相结合，提供了进入临床的快速途径。因此，本研究在充分建立的假单胞菌角膜炎鼠模型中，研究了具有和不具有hrdecorin的流体凝胶对角膜混浊、伤口愈合和纤维化的影响，作为用于管理严重细菌性感染的临床应用的前导。
[0275]
流体凝胶制剂和特性
[0276]
流体凝胶的处理包括使聚合物溶液、结冷胶通过带夹套的销式搅拌器，在该搅拌器中流体凝胶经历高水平的剪切同时被迫(热)通过其溶胶
‑
凝胶转变(图1a)。这限制了通常在静态凝胶的形成中观察到的长程有序(long
‑
range ordering)，从而限制了凝胶核向离散颗粒的生长
[34,35]
。以该方式制备的滴眼剂中的微观结构已使用以下两种技术显示：1)
光学显微术，其中使用聚乙二醇操纵连续相的折射率，以及2)冻干以使用扫描电子显微术(scanning electron microscopy，sem)成像(分别为图1a(i)和1a(ii))。两种显微技术均突出了所得凝胶实体的绞合微观结构，其中它们的大长宽比和随后的大流体动力学半径产生了所得材料特性(黏度和弹性结构化)
[36]
。
[0277]
流体凝胶的独特特性使得它们在静止时表现出伪固体特性，但可在力下流动。在此，提高施加在系统上的剪切力导致非牛顿剪切稀化行为，这是高度絮凝化或浓缩的聚合物分散体/溶液的典型特征
[37]
(图1b)。因此，在低剪切下，观察到比典型的基于水的滴眼剂高超过数个数量级的大黏度，其在施加期间稀化并随后由于颗粒在流动中的解缠结和排列而闪烁
[38,39]
。这使得微凝胶混悬剂对于通过滴管瓶施加是理想的，在施加于眼时通过喷嘴快速剪切稀化(图1c)。施加后，3
‑
维结构矩阵的恢复是在眼表上获得高保留时间的关键。在与初始斜坡(ramp)相对的时间尺度上，剪切的时间依赖性去除被用于收集有关这样的结构化、探测滴眼剂滞后的信息。滴眼剂系统显示出一定程度的触变性(图1b)，从而恢复了大部分原始黏度。使用线性流变学以及在线性黏弹区内在应变下弹性结构的演变检查凝胶
‑
带之间的弱相互作用的存在(图1d)。观察到最初在剪切后，流体凝胶表现出典型的类液体行为，其中损耗模量(g”)主导储能模量(g’)。在此之后，作为凝胶带之间相互作用形成的函数的g’的提高导致达到交叉，此时系统开始表现为固体
‑
凝胶
[40]
。因此，随时间的进一步结构化导致伪固体行为，其中在凝胶实体之间形成连续网络。在施加时剪切稀化同时能够在剪切后快速重构的能力使得滴眼剂能够施加于眼表充当屏障。使用单次5μl施加流体凝胶滴眼剂，显示凝胶均匀分布覆盖整个眼表，包括啮齿动物眼中的角膜、相邻结膜和穹窿(眼睑和眼球之间的空间)(图1e)。
[0278]
体外滴眼剂活性
[0279]
基于结冷胶的滴眼剂系统被配制成用于与我们的研究所使用的候选抗纤维化剂hrdecorin一起进行药物递送。从滴眼剂系统中释放hrdecorin的速率随时间几乎是线性的(图2a)。浊度被用作原纤维形成(大的、不定向胶原蛋白纤维的形成)的量度，显示为hrdecorin的函数(图2b&c)。明显的是，hrdecorin在原纤维形成的动力学中发挥了关键作用，减缓了原纤维形成的开始，并且达到平衡也快得多(图2b)。高于临界浓度0.5μg/ml，观察到hrdecorin在抑制原纤维形成方面的积极作用，突出了浓度依赖性，直至达到最小浊度(>10μg/ml)，高于该浓度没有发生进一步降低(图2c)。此外，该测定表明流体凝胶载体对原纤维形成没有影响，与仅胶原蛋白的对照紧密相关。
[0280]
载有的滴眼剂对角膜混浊的体内效力
[0281]
使用良好建立的细菌性角膜炎模型
[41]
，将经麻醉的小鼠(每组n＝6)在受损的角膜表面上用铜绿假单胞菌(p.aeruginosa)(105cfu)进行攻击。基于细菌性角膜炎患者的标准治疗，开发了治疗感染的治疗方案。在铜绿假单胞菌孵育12小时以确定角膜感染之后，在12小时时间内用每2小时庆大霉素(1.5％)的方案处理眼睛以对感染进行灭菌(通过拭子培养确认)。
[0282]
在灭菌阶段后，在初始接种之后2天，在上午8点至晚上8点之间每4小时施用单次5μl结冷胶滴眼剂，持续另外13天，包括以下处理组：1)庆大霉素和泼尼松龙(gentamicin and prednisolone，g.p)；2)庆大霉素、泼尼松龙和流体凝胶(gentamicin,prednisolone s and fluid gel，g.p.fg)以及；3)庆大霉素、泼尼松龙和hrdecorin流体凝胶(gentamicin,
prednisolone and hrdecorin fluid gel，g.p.decfg)(表1)。
[0283]
在整个16天实验中以一定间隔拍摄角膜的图像来测量角膜混浊的变化(图3a)。在第16天对所有小鼠实施安乐死。与用单独的标准护理(庆大霉素和泼尼松龙)处理的眼相比，在用流体凝胶和用hrdecorin流体凝胶滴眼剂加标准护理处理的眼中显示出混浊面积(由对处理组不知情的两名临床眼科医生独立测量)更早的尺寸降低。因此，在第9天，与仅用庆大霉素和泼尼松龙处理的眼(3.5
±
0.4mm2)相比，用具有hrdecorin流体凝胶的标准护理处理的眼显示出显著(p<0.001)更低的混浊面积(1.9
±
0.3mm2)。在第12天时，与庆大霉素和泼尼松龙组并且还与具有标准护理的流体凝胶组相比，接受具有标准护理的hrdecorin流体凝胶滴眼剂的小鼠维持显著更低(p<0.01)的混浊面积(平均混浊面积：第1组＝3.5
±
0.7mm2，第2组＝3.0
±
0.1mm2，相比之下第3组＝2.1
±
0.2mm2；图3b)。这些结果说明了本发明的眼用水凝胶组合物在抑制眼的瘢痕形成，特别是抑制与微生物性角膜炎相关的瘢痕形成方面的效用和提高的效力。
[0284]
具有hrdecorin的流体凝胶滴眼剂对角膜上皮再形成的影响
[0285]
上皮分层/成熟与基质厚度一起被选择作为结果测量以评估角膜上皮再形成，并观察来自水肿和细胞浸润的基质增厚(作为感染的标志物)。假单胞菌感染严重破坏了角膜结构，其中与129.3
±
10.7μm的初始角膜厚度值相比，在感染之后第2天角膜厚度平均提高为218.7
±
24μm。在第2天时感染的角膜与正常未受损伤的对照相比具有更薄的上皮层(19.2
±
2.1μm相对于35.5
±
1.7μm；图4a&b)。在添加单独的流体凝胶的情况下以及在hrdecorin滴眼剂处理的情况下超过13天，明显的是上皮再形成得到了改善。与庆大霉素和泼尼松龙组(22.5
±
2.1μm厚，具有2.7
±
0.2个细胞层)以及庆大霉素、泼尼松龙和流体凝胶组(22.8
±
1.3μm厚，具有3.4
±
0.1个细胞层)中的上皮相比，用载有hrdecorin的流体凝胶滴眼剂处理导致上皮层的分层程度提高(26.1
±
2.4μm厚，由3.6
±
0.2个细胞层组成)。然而，不同组之间的差异没有达到统计学显著性(图4b、c和d)。
[0286]
流体凝胶对肌成纤维细胞和胞外基质水平的影响
[0287]
免疫反应性(immunoreactivity，ir)用于评估纤维化程度，作为高于从未受损伤的角膜获得的基线的像素强度的比(在此称为阈值)。在初始未受损伤的角膜中，角膜基质中的αsma免疫反应性(ir)水平非常低，表明存在很少的肌成纤维细胞(图5a)。在感染之后两天，在灭菌之后一天，感染的角膜表现出基质αsma染色提高23％，达到高于阈值26.5
±
3.0％的水平(根据未受损伤的角膜归一化)，表明肌成纤维细胞的分化提高。在用仅标准护理处理的眼中，基质irαsma的水平在第16天时保持升高，为32.7
±
6.1％。当眼也用具有或不具有hrdecorin的流体凝胶滴眼剂处理时，基质αsmair的水平在第16天时显著降低，分别为13.4
±
2.9％和2.0
±
0.4％，表明在角膜基质内的肌成纤维细胞活化较少。hrdecorin流体凝胶在使αsmair水平保持为低方面最有效，导致与未受损伤的角膜相似的值，表明与单独的流体凝胶相比，在流体凝胶中添加hrdecorin对肌成纤维细胞分化具有附加有益作用(图5a)。
[0288]
使用纤连蛋白和层黏连蛋白ir研究由肌成纤维细胞产生的基质ecm水平(图5b和c)。在感染之后第2天观察到基质ir纤连蛋白的量提高，在庆大霉素和泼尼松龙处理之后第16天时仍然为高(在第0天和第16天的ir纤连蛋白分别为83.9
±
5.5％和75.3
±
11.5％)。具有或不具有hrdecorin的流体凝胶显著地将纤连蛋白ir的水平分别降低至31.6
±
5.8％和
13.9
±
5.3％，表明两个滴眼剂处理组之间存在临界显著差异(p＝0.051)。ir层黏连蛋白水平(图5c)表明，当与未受损伤的角膜相比时，感染提高了层黏连蛋白水平，在第2天时，从未受损伤中的2.15
±
0.6％提高至感染组中的16.3
±
4.6％。在庆大霉素和泼尼松龙处理之后的第16天，ir层黏连蛋白水平继续升高至42.5
±
8.2％。与庆大霉素和泼尼松龙组类似，在用流体凝胶处理之后的第16天，平均的ir层黏连蛋白水平仍然为高，其中ir层黏连蛋白水平为38.0
±
12.0％。向流体凝胶添加hrdecorin与庆大霉素和泼尼松龙处理相比显著降低了层黏连蛋白水平(12.4
±
5.5％相对于42.3
±
8.2％)，而不具有hrdecorin的流体凝胶对该ecm参数没有影响。
[0289]
讨论
[0290]
提高眼保留是提高对表面治疗的治疗响应和生物效率二者的关键，因为角膜前泪膜的周转(每分钟约20％
[42]
)导致水性药物的快速消除，降低了递送至靶组织部位的滴度。因此，目前许多眼病症是通过白天和晚上递送的强化表面治疗或许多患者不喜欢的侵入性方法(包括眼周或玻璃体内注射以靶向眼内病理状况)来治疗的。在其中药物无效的更严重的病例中，可能需要手术来治疗或去除由此产生的角膜瘢痕，从而提高发病风险并延长治疗后患者不适的持续时间。从结冷胶形成的结构化或“流体凝胶”提供了关键的进步，因为它能够持续递送能够阻止瘢痕形成并消除对侵入性手术修复策略的需求的分子，例如hrdecorin。结冷胶流体凝胶的主要优点是在当其通过施加器(applicator)并在角膜表面凝固时，它能够在固态和液态之间转变。该独特的特性集来源于由在零剪切下彼此弱相互作用的带和颗粒组成的材料的微观结构。这些相互作用通过施加剪切被打破并在其去除后重构。以该方式，材料然后可通过自然眨眼机制从眼表逐渐清除。当施加于角膜表面时，弱弹性结构的发展导致形成透明且可吸收的绷带，具有滴眼剂(施加中的)和水凝胶镜片(持续释放)的益处，没有任一者的缺点。事实上，单独的流体凝胶显示出提供了有利于伤口愈合的微环境，即使没有核糖体蛋白添加也降低角膜混浊和瘢痕形成的标志物。重要的是，如由胶原蛋白纤维生成数据所表明的，流体凝胶不干扰hrdecorin的生物活性。因此，该系统为临床环境提供了优异的候选技术，并且在许多患者组群中提高了药物施用依从性。
[0291]
铜绿假单胞菌角膜炎的小鼠模型提供了评价载有hrdecorin的流体凝胶针对假单胞菌感染的当前标准护理(庆大霉素和泼尼松龙)的抗瘢痕形成能力的稳健的、临床相关的手段
[43]
。一旦建立感染，铜绿假单胞菌侵入角膜上皮细胞，从而破坏自然愈合响应且角膜成纤维细胞转化为角膜肌成纤维细胞，导致纤维化微环境
[44]
。表面施用具有或不具有hrdecorin的滴眼剂导致在滴眼剂处理7天和10天之后角膜混浊水平降低，其中添加hrdecorin显示出明显的进一步优点。没有预期仅流体凝胶处理的作用，因为最初的体外研究表明该载体似乎是惰性的。单独的流体凝胶的治疗效力可能是由于在受损角膜中形成了允许的微环境，在其中凝胶带的闭塞作用(缠绕以在伤口周围形成屏障)提供了防止由溃疡的眼上的眨眼造成的生物力学创伤的治疗性绷带。还可将波尼松龙和庆大霉素隔离在其结构内，增强治疗性物质在眼表面的保留，从而类似于生态系统的假肢置换(prose
(tm)
装置)提高生物利用度，但具有可吸收的附加优点。在视力保护方面，这样的角膜混浊降低将有益于患者
[58]
。愈合阶段的一个重要方面涵盖分层的非角化上皮的恢复。与泪膜一起，顶端黏膜(由脂质、黏蛋白和水性层构成)为眼表提供营养和润滑，并且是眼第一道防线的基础。经hrdecorin处理的眼表现出对正常解剖的最大改善的恢复，基质水肿、厚度和胞外基质沉积
降低，外加上皮形态得到改善。先前已在许多动物模型中证明了hrdecorin对纤维化标志物的降低；调节一系列生长因子(例如vegf、igf
‑
1、egf、pdgf)及其受体，特别是通过smad 2和3途径的tgfβ信号传导，防止角膜成纤维细胞的分化。另外，它对基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，mmp)和金属蛋白酶组织抑制剂(tissue inhibitors of metalloproteinase，timp)的调节导致纤维溶解和瘢痕形成减弱
[29,46
‑
48]
。
[0292]
已通过引入流体凝胶载体，改善在眼表上的保留时间增强了hrdecorin帮助愈合，并且特别是降低瘢痕形成的固有能力。鉴于在该小鼠模型中损伤的严重程度，我们提出饰胶蛋白聚糖的内源性水平可能不足以中和tgfβ过度活跃和随后的纤维化级联以防止角膜瘢痕形成。也可能是位于泪膜内眼表面的、角膜和房水(aqueous humour)内的内源性饰胶蛋白聚糖被结合并且不可自由地用于隔离活性tgfβ(图7)。
[0293]
与标准护理相比，我们的制剂的独特特征是它们能够提高上皮再形成的速率。这是限制眼损伤的核心，因为持续的上皮缺陷导致角膜代谢功能障碍、基质融化和穿孔。在流体凝胶滴眼剂制剂中添加hrdecorin比标准护理和单独的流体凝胶更多地降低ecm积累并且，这与该模型中混浊的进一步降低(与早期时间点相比)有关。这表明我们的hrdecorin流体凝胶滴眼剂提供了足够的剂量，以防止该模型中的纤维化并促进伤口恢复，或者改变流体凝胶的化学结构以提高包扎效果。已在体内清楚地证明了该流体凝胶制剂的益处，其在物理上(角膜混浊降低)和药理学上(与降低的纤维化标志物有关)二者均观察到。然而，由于立法限制，在本研究中生成的数据限于16天的时间点。然而，在未来的研究中检查随后时间点将是有意义的。
[0294]
单独的流体凝胶对受损角膜表面的作用表明对内源性生长因子的影响，这是通过添加hrdecorin而增强的一种作用。流体凝胶可通过数种机制帮助角膜愈合：首先，流体凝胶的独特黏弹性特性作为液体，其在眼表上进行自结构化以形成半固体封闭治疗敷料，用于进行不受干扰的愈合；其次，在流体凝胶的凝胶化期间形成的螺旋结构域可为内源性饰胶蛋白聚糖提供模拟支架以结合、隔离关键生长因子，例如tgfβ和/或外源递送的hrdecorin；第三，主要由水(99.1％)组成的流体凝胶基质产生细胞因子远离伤口部位的梯度驱动扩散，再次导致防止纤维化所需的自然平衡的恢复。
[0295]
本发明人已在存在流体凝胶和饰胶蛋白聚糖流体凝胶的情况下看到了两种不同的响应，并且在未来的研究中，其对梳理每种响应的机制将是重要的。我们预期单独的流体凝胶提供保护屏障，同时可能以我们尚不了解的方式影响炎性细胞和成纤维细胞行为。重要的是，流体凝胶促进角膜上皮的再生，导致伤口闭合。我们假设流体凝胶通过促进增殖和分化来影响角膜缘上皮干细胞小环境，这可能在疾病情况下失调，并提供治疗性绷带以帮助基质修复。然而，在该研究中，我们没有透明质酸盐或仅羧甲基纤维素组来探究(interrogate)这些眼用润滑装置是否具有类似的作用。此外，除在眼伤口愈合环境的情况下隔离tgfβ之外，饰胶蛋白聚糖的多方面作用例如抑制炎症和血管生成以及调节自噬需要在转化为临床之前进行进一步研究。
[0296]
总之，本发明人已证明，在与细菌性角膜炎相关的纤维化的临床相关鼠模型中，新的滴眼剂技术可用于提供抗纤维化药物如hrdecorin向角膜的持续表面递送。滴眼剂使得hrdecorin能够在足够长时间内并以足够的滴度与眼表面保持接触以显著降低角膜瘢痕形成。此外，该研究表明，未载有的流体凝胶本身也具有愈合作用，这表明该作用是通过其固
有的材料微观结构和随后的特性产生的。滴眼剂的材料特性不仅提高了抗瘢痕形成药物保留时间，而且该滴剂的使用者友好性质也会受到患者的欢迎，为预防在角膜感染之后普遍存在的瘢痕形成病理提供了简单的治疗。当与当前的标准护理相比时，已证明该技术成功降低了角膜混浊并降低了通常指示瘢痕形成过程的标志物，为患有微生物性角膜炎的患者提供了理想的治疗选择，降低了视觉上显著的角膜混浊的发生并且潜在地消除了矫正手术干预的需要。鉴于在发展中国家移植可用性和手术干预的设施通常不可用，我们认为该技术将来可帮助挽救许多患者的视力。
[0297]
材料和方法
[0298]
研究设计
[0299]
本研究的目的是探索新的流体凝胶用于将饰胶蛋白聚糖递送至眼表以降低角膜混浊和细菌性角膜炎后的瘢痕形成的用途。该研究分为三个评价阶段：(i)与滴眼剂施加的难易程度相关的材料特性，(ii)配制的hrdecorin的生物活性的体外评估，以及(iii)具有/不具有hrdecorin的流体凝胶的体内抗瘢痕形成效力，与当前的标准护理相比，使用假单胞菌角膜炎的小鼠模型(一旦感染之后对眼进行灭菌)。因为效应量未知，因此样本量(每个实验组n＝6)基于资源方程。所有分析均由对实验分组不知情的观察者进行，并且小鼠被随机分配到处理组和对照组二者。
[0300]
材料
[0301]
流体凝胶(fg)和hrdecorin流体凝胶(decfg)产生
[0302]
流体凝胶滴眼剂的制备
[0303]
通过首先将低酰基结冷胶(kelco gel cg la,azelis,uk)溶解在去离子水中来产生流体凝胶。在环境温度下以正确的比例将结冷胶粉末添加至去离子水以得到1％(w/v)溶液。在配备有磁力搅拌器的加热板上在搅拌下将溶胶加热至70℃，直至所有聚合物溶解。一旦溶解，将结冷胶溶胶添加至配备有杯和叶片几何形状(杯：直径35mm，叶片：直径28mm)的旋转流变仪(ar
‑
g2,tainstruments,uk)的杯。然后将系统冷却至40℃。然后添加pbs(4.76mg/ml)和氯化钠水溶液(0.2m)中的hrdecorin(galacorin
tm
；catalent,usa)以得到最终浓度为0.9％(w/v)结冷胶、0.24mg/ml hrdecorin和10mm nacl。在此之后，将混合物在剪切(450/秒)下以1℃/分钟的速率冷却至20℃的最终温度。然后移出样品并储存在4℃下直至进一步使用。在不具有hrdecorin的流体凝胶的情况下，调整比例以使最终滴眼剂的组成为0.9％(w/v)结冷胶、10mm nacl。
[0304]
流体凝胶滴眼剂的材料表征
[0305]
显微术：对于透射显微术样品，首先使用聚乙二醇400(peg400)以1:4(滴眼剂与peg400)的比例稀释。在此之后，使用olympus fv3000分析样品。使用imagej(http://imagej.nih.gov/ij/；由国立卫生研究院(national institutes of health),bethesda,md,usa在公共领域提供)处理图像。
[0306]
对于扫描电子显微术样品，首先通过以与透射显微术相同的方式将结冷胶在去离子水中稀释至1:9的比例来制备冻干样品。然后使用液氮快速冷冻样品并放置在冷冻干燥器中过夜以留下粉末。然后将干燥的样品附着到碳桩(stub)上并使用sem分析。
[0307]
流变学：使用配备有喷砂平行板(40mm，1mm间隙高度)的ar
‑
g2(tainstruments,uk)流变仪在20℃下获得黏度谱。使用2分钟的平衡以确保恒定的测试温度。在此之后，施加
0.1至600/秒(扫描时间为3分钟)的时间依赖性的斜升(ramp up)和斜降(ramp down)。使用相同的设备在单频率下获得恢复谱。通过以600/秒剪切10秒使样品恢复活力。在此之后，在1hz、0.5％应变下监测储能和损耗(分别为g’、g”)。交叉点被用作样品开始像黏弹性固体一样起作用的点。
[0308]
hrdecorin从流体凝胶中释放
[0309]
通过将1ml含hrdecorin的流体凝胶放置在6孔板中，累积测定从凝胶中释放hrdecorin的水平。然后将2ml dmem放置在样品上，并将板在37℃下孵育。在每个时间点，移除培养基用于测量hrdecorin并用新鲜的培养基更换。使用对人饰胶蛋白聚糖(r&d systems,minneapolis,usa)具有特异性的elisa根据制造商的方案对饰胶蛋白聚糖释放进行量化。
[0310]
体外hrdecorin生物活性测定
[0311]
胶原蛋白原纤维生成：对于剂量响应曲线，将75μl pbs添加至保持在冰上的96孔板的每个孔。通过向第一孔添加400μg/ml的hrdecorin并随后在整个板中连续稀释(2倍稀释)来制备不同的hrdecorin剂量。稀释后，向每个孔添加另外的150μl pbs缓冲液。然后，将75μl的i型胶原蛋白(鼠尾；corning,uk)(800μg/ml)添加至每个孔，并在37℃下孵育2小时。使用405nm读板仪读取后续的吸光度读数。每个测定由一式两份空白对照和一式三份标准稀释物接着是一式三份样品稀释物组成。如下确定原纤维形成的动力学：使用与剂量响应类似的设置而不进行连续稀释；在读板仪内孵育样品，并且每2分钟采集数据点。
[0312]
假单胞菌角膜炎模型和体内立体显微术
[0313]
体内假单胞菌模型的处理施用方案在图6中示出。在第2天采集的初始未受损伤的组和感染的角膜组也包括在实验计划中。由于效应量未知，因此每个对照或处理组的n＝6的样本量基于资源方程
[49]
。在感染假单胞菌之前，小鼠被随机分配到每个处理组和对照组。每个处理程序和样本量在下面进一步详细描述。对于体内研究，由对实验组不知情的研究者进行分析。
[0314]
假单胞菌角膜炎的体内鼠模型
[0315]
将铜绿假单胞菌pao1菌株在高盐lb(每升为10g胰蛋白胨、5g酵母提取物和11.7g nacl，补充有10mm mgcl2和0.5mm cacl2)中在37℃下培养18小时。亚培养物在光密度(optic density，od)为0.2(od650nm，约1
×
108cfu/ml)时获得。将铜绿假单胞菌在pbs中洗涤(
×
3)，以300rpm离心5分钟并以1
×
105cfu/2.5μl的密度重悬于pbs中。c57bl/6小鼠(jackson实验室,ca,usa)被饲养在无病原体的条件下，自由获得食物和水，并且根据arrive指南、关于在眼科和视力研究中使用动物的arvo声明进行供养并且还遵守由加州大学欧文分校(the university of california,irvine)制定的指南。对于接种，将小鼠麻醉并且使用26g针以3
×
1mm平行划痕擦伤一个角膜上皮，并接种2.5μl铜绿假单胞菌(1
×
105cfu)(菌株pao1)
64,65
。小鼠在接种后保持镇静2小时以允许感染渗透到眼中，并置于恢复中。在24小时之后，每2小时用5μl庆大霉素(1.5％,qehb pharmacy,birmingham,uk)处理清醒小鼠，持续12小时以对感染进行灭菌。在另外12小时之后，根据其以下处理组，在上午8点至晚上8点之间每4小时向小鼠施用滴眼剂(每种化合物5μl)，持续另外13天：(1)庆大霉素+泼尼松龙(0.5％,qehb pharmacy)，(2)庆大霉素+泼尼松龙+流体凝胶，或(3)庆大霉素+泼尼松龙+具有hrdecorin的流体凝胶。检查小鼠的角膜混浊、溃疡和穿孔。用与leica mzf iii立体显微
镜连接的spot rtke相机(诊断仪器)捕获角膜的正面24位彩色照片。第16天在麻醉下通过颈椎脱位对小鼠实施安乐死，并将眼摘出并放置在pbs中的4％pfa中进行免疫组织化学处理。
[0316]
混浊量化
[0317]
两名不知情的独立临床眼科医生以相同的随机顺序(该顺序由独立统计学家提供)分析所有照片。使用imagej，以mm2
±
sem描绘和测量混浊面积。在观察者开始图像分析之前，就角膜混浊、适当和不适当的图像的限定达成一致。随机顺序规定在测量区域内不应该有时间趋势。使用bland
‑
altman方法[62]对九十九个成对的混浊测量值评估观察者之间的一致性限制。测量差异近似正态分布。bland
‑
altman分析揭示，一位评估者的评估量很可能略小于另一位，但平均差异在统计学上与零无差异(双侧p值＝0.29)。在评估者内进行了少量重复测量，但不足以正式测试观察者内的一致性限制。
[0318]
用于上皮再形成和ecm的组织处理和免疫组织化学
[0319]
将用于ihc的摘出的眼通过浸入在pbs中的4％pfa中在4℃下过夜进行后固定，然后使用pbs中的提高浓度的蔗糖(10％、20％和30％；sigma)各自在4℃下冷冻保护24小时。然后将眼嵌入剥离模具容器(agar scientific,essex,uk)中的最佳切割温度(optimal cutting temperature，oct)包埋介质(thermo shandon,runcorn,uk)中，并随后使用恒冷箱切片机(bright,huntingdon,uk)在
‑
22℃下在旁矢状平面中以15μm的厚度切片，并放置在superfrost载片(fisher scientific,usa)上。将中央切片(在视神经平面中)用于所有ihc研究并储存在
‑
80℃下。将冷冻切片解冻30分钟，然后在pbs中洗涤3
×
5分钟，接着是用0.1％triton x
‑
100(sigma)透化20分钟。使用pbs中的0.5％bsa、0.3％吐温
‑
20(均来自sigma)和15％正常山羊血清(vector实验室,peterborough,uk)将组织切片中的非特异性抗体结合位点封闭30分钟，然后在一抗(αsma、层黏连蛋白和纤连蛋白；1:200；均来自sigma)中在4℃下再次孵育过夜，接着是洗涤3
×
5分钟，并在室温下与二抗(山羊抗小鼠alexa fluor 488 1:500，山羊抗小鼠alexa fluor 594 1:500,molecular probes,paisley,uk)一起孵育1小时。然后将切片洗涤3
×
5分钟并在含dapi(vector实验室)的vectorshield封固剂(mounting medium)中封固。与单独的二抗一起孵育的对照组织切片均呈阴性染色。
[0320]
免疫组织化学成像和量化
[0321]
在ihc之后，将切片在zeiss axioscanner荧光显微镜(axio scan.z1,carl zeiss ltd.)上以
×
20成像，每种抗体使用相同的曝光时间。根据先前描述的方法
61
，通过测量像素强度来量化ihc染色。简言之，用于量化ecm ir的目的区域由对基质内的所有眼/处理具有相同规定尺寸的目的区域限定。每个基质取总共30个单独的强度测量(目的区域)以覆盖整个区域。在这些限定的目的区域内量化ecm沉积，并使用imagej计算高于来自未受损伤的角膜的标准化背景阈值的ir像素的百分比。对于每种抗体，基质区域中的亮度阈值水平使用未受损伤的未经处理角膜设定，以限定用于测试组分析的参考水平。图像被分配随机文件名，以确保评估者对处理组不知情。
[0322]
统计分析
[0323]
所有统计分析均使用spss 20(ibm,chicago,il,usa)进行。进行正态分布检验以确定最合适的统计分析来比较处理。统计显著性确定为p<0.05。对于混浊测量，使用具有
tukey事后检验的anova对角膜宽度、上皮厚度、αsma、纤连蛋白和层黏连蛋白数据进行分析。对于上皮细胞层数的dapi测量，由于数据不是正态分布的，因此使用了kruskal
‑
wallis检验。
[0324]
表1
[0325]
表1.处理组的表。突出向每组施用(+)或未向每组施用(
‑
)的治疗剂组合的表，n＝6。
[0326][0327]
另一些技术信息
[0328]
1.生物聚合物列表：
[0329]
[0330][0331]
表2：基于多糖和蛋白质二者的生物聚合物的表，所述聚合物具有使用剪切技术加工成微凝胶混悬剂的潜能。已给出了电荷、蛋白质的等电点(isoelectric point，pi)、胶凝机制和光学透明度的附加信息
‑
如果凝胶是透明的，则凝胶在眼科设备中具有潜在的应用，但这不限于此。
[0332]
1.“流体凝胶”(微粒混悬剂)材料特性：
[0333]
黏度/流动行为
[0334]
通过两种主要方法寻求最佳滴眼剂黏度：当前商业滴眼剂/软膏剂的流变学表征和咨询眼科临床医生。商业眼用产品的表征突出了用于医学病症例如干眼症的跨越滴眼剂和眼用软膏剂二者的大范围黏度；其中需要最佳长保留时间。在1s
‑1时收集并比较黏度(选择作为剪切稀化初始阶段内的值，以避免设备的人为因素)(表2和图6(a.1.部分))，突出了产品之间的相似黏度作为主要由以下制成的聚合物的函数：基于石蜡、卡波姆和生物聚合物。
[0335]
·
表1：市售滴眼剂/软膏剂在1s
‑1时得出的黏度的表。
[0336][0337]
在基于石蜡和卡波姆二者的眼用产品的情况下，说明书中给出了警告以告知患者由于该滴剂可能导致模糊和不适。因此，制剂黏度的外部限制是基于针对这些产品获得的值确定的：
[0338]
最大
‑
200pa.s；并且最小4pa.s
[0339]
在其中测试所有制剂的所有情况下，这些值均未被超过。因此，用结冷胶作为用于凝胶化的生物聚合物制备的所有制剂均可在这些限制内使用。然而，在临床建议的帮助下，缩小了在黏度方面更优化的制剂。
[0340]
在制备了一组不同的制剂后，需要临床医生被要求对产品进行操纵并关于合理的滴眼剂产品对它们进行评级。从该数据发现，在以下黏度范围内的滴眼剂更容易施加：
[0341]
5至50pa.s，
[0342]
具有良好的保留，具有最佳滴：
[0343]
约10至20pa.s。
[0344]
此外，系统应表现出剪切稀化行为。
[0345]
1.1.1.限定的参数
[0346]
·
表2：在1s
‑1(20℃)时发现的滴眼剂制剂的潜在黏度的总结。
[0347][0348]
弹性
[0349]
静止时的弹性在产品使用中发挥很大的作用，以受控的方式保留和递送活性物(active)。认为微凝胶混悬剂在静止时产生弱弹性网络的能力驱动了与产品相关的高保留时间。同样，这些限制是基于市售滴眼剂和软膏剂的表征(图3(a.1.部分))。如针对黏度所见，在多种产品之间观察到类似的相关性，其中将产品分组为聚合物类型(表4)。
[0350]
·
表3：使用市售滴眼剂/软膏剂的振幅扫描得出的储能(弹性模量)的表。
[0351][0352]
同样，与黏度类似，对于所有测试的制剂，没有超过针对当前产品获得的值。因此，用结冷胶作为用于凝胶化的生物聚合物制备的所有制剂均可在这些限制内使用。
[0353]
最大
‑
20000pa；并且最小1pa
[0354]
然而，当由临床医生分析时，这被缩小至
[0355]
1至250pa，
[0356]
其中最佳制剂介于
[0357]
20至40pa。
[0358]
1.1.2.限定的参数
[0359]
·
表4：在1hz(20℃)时使用滴眼剂制剂的应变扫描在线性黏弹区(lvr)内发现的潜在弹性模量的总结。
[0360][0361][0362]
ph
[0363]
由于生物聚合物的化学组成以及沿其各自骨架的不同化学部分，它们具有不同的天然ph。与眼表接触的产品的ph是重要的，因为许多化学损伤在ph<4和ph>10的范围内形成，正常生理接近7.11
±
1.5。因此，将滴眼剂配制成在该范围(4至10)之间，其中一些产品降低低至ph 3.5(盐酸丙美卡因溶液)1。因此，基于来自文献的该数据，滴眼剂制剂的ph应在以下范围内：
[0364]
3.5至8.6
[0365]
然而，包含蛋白质的许多活性物的递送要求制剂是中性的。在这些情况下，可将pbs(磷酸盐缓冲盐水)添加至滴眼剂，将ph限制为中性酸度。因此，在制剂中已缩小至以下ph：
[0366]
6.5至7.5，
[0367]
其中优化的制剂为：
[0368]
7.4。
[0369]
1.1.3.限定的参数
[0370]
·
表5：滴眼剂制剂的潜在ph值的总结。
[0371][0372]
2.“流体凝胶”(微粒混悬剂)制剂：
[0373]
生物聚合物浓度
[0374]
(参见实验记录(write
‑
up)a.1.)
[0375]
最终，制剂的材料特性取决于产品中初始聚合物的浓度。因此，材料特性的上限和下限用于评价材料制剂，提供聚合物浓度的上限和下限。由于所有系统均表现出剪切稀化行为，因此限制仅基于满足静止时的黏度(在1s
‑1时)和弹性行为二者的标准。因此，已针对滴眼剂制剂设定最大范围：
[0376]
0.1至5.0重量％(例如0.1至3.5重量％或0.5至2.5％)(w/v)，
[0377]
其中值在针对市售产品发现的那些内。这已缩小至落入临床医生的建议内：
[0378]
0.5至1.5％(w/v)，
[0379]
其中优化的制剂由以下组成：
[0380]
0.9％(w/v)。
[0381]
2.1.1.限定的参数
[0382]
·
表6：滴眼剂制剂的潜在ph的总结。
[0383][0384]
交联剂浓度
[0385]
(参见实验记录a.2.)
[0386]
从结冷胶制剂的表征获得的数据表明，盐含量不影响系统的黏度，但是，它确实对静止时凝胶的弹性响应具有影响。同样，配制的系统都没有超过由商业产品设定的上限和下限，因为这样的上限和下限浓度已被限定为：
[0387]
5至40mm。
[0388]
然而，力学谱表明，在较高的盐浓度下，当在线性黏弹区外变形时，形成了弹性网络的显著降低。这表明较低的盐浓度导致更多的塑性行为，这被认为对患者将是更舒适的。因此，已将制剂的缩小的限制调整为；
[0389]
5至20mm，
[0390]
其中优化的制剂为：10mm。
[0391]
2.1.2.pbs
[0392]
添加pbs可用于操纵系统的ph。在这些情况下，添加5％v/v(5％被确定为与治疗性饰胶蛋白聚糖一起添加的量，因此尚未在该领域中进行进一步研究)，将影响系统内盐的水平。已计算pbs中单价离子的浓度并列于表8中。
[0393]
表7：突出pbs的成分和浓度的表
[0394][0395]
因此，已改变交联剂的范围(表9)，降低了下限，因为pbs中的离子含量足以驱动凝胶化过程。
[0396]
2.1.3.限定的参数
[0397]
·
表8：具有和不具有pbs的滴眼剂的交联剂浓度的总结。
[0398][0399]
3.“流体凝胶”(微粒混悬剂)处理参数：
[0400]
热处理
[0401]
制造中的热处理是凝胶形成的关键。通常来说，热参数分为两部分：处理温度和冷却速率。
[0402]
4.1.1.处理温度
[0403]
入口和出口是确保聚合物在处理前处于溶胶中并在低于凝胶化转变的温度下离开的关键。由于在较高温度下蛋白质活性变性，因此最初将入口温度设定为尽可能接近凝胶化温度。因此，将其设定为40℃。然而，这不是必需的，入口温度的关键方面是保持其高于凝胶化温度，以防止早期凝胶化和堵塞。出口温度的作用是确保在储存之前已完成聚合物的排序/结构化。这防止了阶段和异质混悬剂形成期间的聚集。因此，对于结冷胶，已将该温度限定为20℃，使得聚合物能够通过凝胶化过程。因此，出口温度由磨机的夹套控制，该夹套设定为在处理期间提供足够的冷却。这可被改变，从而导致不同的冷却速率。
[0404]
4.1.2.冷却速率
[0405]
(参见实验记录a.3.)
[0406]
已知溶胶
‑
凝胶转变期间的冷却速率对于最终材料特性非常重要；因为较高的冷却速率导致结构的快速形成和较弱的整体模量。然而，对于微凝胶混悬剂，这仅在较高聚合物浓度下观察到。观察到对于最佳滴眼剂制剂，未观察到材料特性的变化，这表明可使用大范围的参数：
[0407]
0.1至6℃/分钟，
[0408]
而在1.8％w/v聚合物下，它更依赖于所需的弹性结构。
[0409]
4.1.3.限定的参数
[0410]
·
表9：结冷胶滴眼剂制剂的冷却速率的总结。
[0411][0412]
4.2剪切速率
[0413]
(参见实验记录a.3.)
[0414]
处理期间的剪切速率显示出与冷却速率非常类似的结果，其中优化的聚合物浓度不受处理剪切的影响。同样，较高的浓度显示出依赖性。因此，对于优化的制剂，可施加非常
宽范围的剪切：
[0415]
50至2000rpm(设备极限)，
[0416]
其可缩小至：
[0417]
500至1500rpm，
[0418]
其中优化的设置：
[0419]
1000rpm(以防止对处理设备的压力)
[0420]
4.2.1.限定的参数
[0421]
表10：结冷胶滴眼剂制剂的处理速率的总结
[0422][0423]
5.混悬剂参数的总结：
[0424]
表11：滴眼剂制剂的潜在ph的总结。
[0425][0426][0427]
5.混悬剂参数的总结：
[0428]
表12：滴眼剂制剂的潜在ph的总结。
[0429][0430]
另一些实验数据
[0431]
a.1.实验
‑
结冷胶浓度：聚合物浓度对所得流体凝胶材料响应的影响
[0432]
目的：
[0433]
·
了解在加工成微凝胶混悬剂后，聚合物浓度如何影响最主要的材料特性(黏度和弹性)。
[0434]
·
缩小合适滴眼剂制剂的聚合物浓度容差(tolerance)。
[0435]
材料和方法：
[0436]
材料：
[0437]
·
结冷胶(kelco)
[0438]
·
nacl(fisher chemicals，批号：1665066)
[0439]
结冷胶微凝胶混悬剂(microgel suspension，ms)的制备：
[0440]
储备溶液的制备：
[0441]
nacl溶液的制备：
[0442]
通过使用容量瓶将干燥晶体(1.16g)添加至去离子水(100ml)来制备nacl(0.2m)。然后使用倒置技术使nacl溶解以帮助该过程。一旦完全溶解，将溶液保持在环境条件下直至进一步使用。
[0443]
结冷胶溶胶的制备：
[0444]
通过将粉末状聚合物以不同比例溶解在水/nacl溶液中来制备结冷胶溶胶，使得处理后的最终浓度等于0.5、0.9、1.35、1.8和2.35％(w/v)。简言之，称取结冷胶粉末(2.5、4.5、6.75、9.0和11.75g)并添加至450ml去离子水。允许在搅拌下将混合物加热至95℃，使
得聚合物溶解。一旦完全溶解，将25ml nacl储备溶液(0.2m)添加至该溶液中，得到10mm的处理后浓度。然后在处理之前使溶胶在95℃下达到热平衡。
[0445]
结冷胶ms的处理：
[0446]
使用设定为20℃的夹套针磨机(jacketed pin mill)制备ms。使用蠕动泵(peristaltic pump)将结冷胶溶胶以3ml/分钟泵入到针磨机中，以便其进入40℃的处理室。在使用注射器和注射泵进入之前，将水泵入到结冷胶流(以0.16ml/分钟的速度)中以便它们撞击，将结冷胶溶胶稀释至最终浓度(0.5、0.9、1.35、1.8和2.35％(w/v)，10mm nacl)。然后使混合物在其通过研磨单元(milling unit)时在剪切(500rpm或1000rpm)下冷却。在离开时，在20℃下，将凝胶包装并储存在4℃下直至进一步测试。
[0447]
材料分析：
[0448]
流变学：
[0449]
使用配备有喷砂平行板(直径：40mm，间隙高度：1mm)的流变仪(ta，ar
‑
g2)在20℃下测试所有样品。结果在图7至图9中示出。
[0450]
振幅扫描(amplitude sweep)：
[0451]
振幅扫描是在0.1％至100.0％的范围内以应变控制模式获得的。将样品装载到仪器中并降低上部几何形状。一旦经修整，使样品在测试前在20℃下保持平衡。以对数方式在1hz下获得测量值。
[0452]
流动谱：
[0453]
样品的黏度谱是使用连续斜坡获得的。将样品装载到仪器中并降低上部几何形状。一旦经修整，使样品在测试前在20℃下保持平衡。在3分钟的斜坡内，在0.1至600s
‑1之间以速率控制模式对样品施加提高的剪切，其中以对数方式获得数据点。
[0454]
结果：
[0455]
小变形流变学：参见图7至图9和以上讨论。
[0456]
大变形流变学：参见图10至12和以上讨论。
[0457]
讨论：
[0458]
可观察到聚合物浓度对它们的弹性性质和黏度二者的影响，其中两种特性均显示出相同的趋势；提高直至在高于1.8％(w/v)的浓度下达到平稳时期(图2和3)。这样的观察源于微凝胶颗粒的形成，其中通过在聚合物系统的整个凝胶化中施加剪切，限制阻止了连续网络形式的形成。该过程的主要结果意味着凝胶实体分散在非凝胶介质中，类似于w1/w2乳剂。因此，混悬剂的流变学也与乳剂的流变学密切相关；其中提高液滴或颗粒的相体积(在该情况下)导致更接近并提高系统的弹性性质(g’)和黏度二者。在该情况下，提高聚合物浓度导致更大数目的颗粒，直至达到最大填充分数(packing fraction)。高于此，看不到材料特性的进一步变化。
[0459]
将多种混悬剂的弹性(储能模量，g’)和黏度与针对当前滴眼剂/软膏剂收集的数据进行比较，遍及一系列材料：基于石蜡、卡波姆和生物聚合物的系统(图3和6)。观察到所有结冷胶系统均表现出在当前商业眼用产品的阈值内的g’和黏度，表明所有系统均适用，而不管聚合物浓度如何。然而，为了便于施加(从一次性施加器)和舒适(如通过包装描述的视力模糊)，最接近基于卡波姆和生物聚合物的滴剂的值是最佳的。因此，在0.5至1.35％(w/v)范围内的结冷胶浓度是最合适的。另外，针对眼应用，咨询独立临床医生得出0.9％
(w/v)，最接近地模拟临床医生限定的特性。
[0460]
混悬剂的屈服行为也非常重要，特别是在用于递送的保留机制中，因为快速屈服系统导致了快速清除。反之亦然，在系统根本不屈服的情况下，材料不容易从身体消除。线性黏弹区(lvr)是混悬剂屈服行为的良好指示，当系统离开该线性区域时，微弱的颗粒间相互作用开始分解，并且系统流动。观察到lvr的长度是聚合物浓度的函数，显示出与结冷胶含量的反比关系(图1)。在此，在较低的聚合物浓度下，混悬剂可在分解之前在较高的应变下操纵，在身体的动态区域中提供了变得缓慢吸收的封闭的屏障。在0.5％至1.35％(w/v)的范围内观察到类似的lvr，表明它们的表现类似。
[0461]
随后的屈服剪切稀化行为对于施加和消除二者也是至关重要的，允许混悬剂在液化后容易流动。无论聚合物浓度如何，在所有系统中均观察到剪切稀化(图4)。通过颗粒间相互作用的破坏和流动排列而产生的高度剪切稀化使系统容易地通过喷嘴(注射器、一次性施加器等)施加；其中小压力导致高水平的剪切。
[0462]
结论：
[0463]
总之，表明聚合物浓度在结冷胶微凝胶混悬剂的所得材料特性中发挥关键作用。发现材料特性，例如弹性(由材料固有g’值表示)和黏度是聚合物浓度的函数，提高直至在1.8％(w/v)下形成平稳时期。实际上，这意味着所有系统均适用于在眼环境内施加或注射，与已有的市售产品进行了密切比较，并表现出了通过小孔口挤出所需的强剪切稀化行为。此外，通过与商业产品进行比较并通过与独立临床医生的交谈，0.5至1.35％(w/v)的聚合物范围被缩小，其中证明0.9％(w/v)对于最终制剂最佳。
[0464]
a.2.实验
‑
交联剂(nacl)浓度：交联剂浓度对所得流体凝胶材料响应的影响。
[0465]
目的：
[0466]
·
了解在加工成微凝胶混悬剂后，交联剂浓度如何影响最主要的材料特性(黏度和弹性)。
[0467]
·
缩小合适滴眼剂制剂的交联剂浓度容差。
[0468]
材料和方法：
[0469]
·
结冷胶(kelco,)
[0470]
·
nacl(fisher chemicals，批号：1665066)
[0471]
结冷胶微凝胶混悬剂(ms)的制备：
[0472]
储备溶液的制备：
[0473]
nacl溶液的制备：
[0474]
通过使用容量瓶将干燥晶体(0.58、1.16、2.32和4.64g)添加至去离子水(100ml)来制备nacl(0.1、0.2、0.4和0.8m)。然后使用倒置技术使nacl溶解以帮助该过程。一旦完全溶解，将溶液保持在环境条件下直至进一步使用。
[0475]
结冷胶溶胶的制备：
[0476]
通过将粉末状聚合物溶解在水/nacl溶液中来制备结冷胶溶液，使得处理后的最终浓度等于0.9％和1.8％(w/v)。简言之，称取结冷胶粉末(4.5g、9.0g)并添加至450ml的去离子水。允许在搅拌下将混合物加热至95℃，使得聚合物溶解。一旦完全溶解，将25ml nacl储备溶液(0.1、0.2、0.4和0.8m中任一者)添加至溶液，得到5、10、20或40mm的处理后浓度。然后在处理之前使溶胶在95℃下达到热平衡。
[0477]
结冷胶ms的处理：
[0478]
使用设定为20℃的夹套针磨机制备ms。使用蠕动泵将结冷胶溶胶以3ml/分钟泵入到针磨机中，以便其进入40℃的处理室。在使用注射器和注射泵进入之前，将水泵入到结冷胶流(以0.16ml/分钟的速率)中以便它们撞击，将结冷胶溶胶稀释至最终浓度(0.9％和1.8％(w/v)；5、10、20或40mm nacl)。然后使混合物在其通过研磨单元时在剪切(1000rpm)下冷却。在离开时，在20℃下，将凝胶包装并储存在4℃下直至进一步测试。
[0479]
材料分析：
[0480]
流变学：
[0481]
使用配备有喷砂平行板(直径：40mm，间隙高度：1mm)的流变仪(ta，ar
‑
g2)在20℃下测试所有样品。
[0482]
振幅扫描：
[0483]
振幅扫描是在0.1％至100.0％的范围内以应变控制模式获得的。将样品装载到仪器中并降低上部几何形状。一旦经修整，使样品在测试前在20℃下保持平衡。以对数方式在1hz下获得测量值。
[0484]
流动谱：
[0485]
样品的黏度谱是使用连续斜坡获得的。将样品装载到仪器中并降低上部几何形状。一旦经修整，使样品在测试前在20℃下保持平衡。在3分钟的斜坡内，在0.1至600s
‑1之间以速率控制模式对样品施加提高的剪切，其中以对数方式获得数据点。
[0486]
结果：
[0487]
小变形流变学
‑
参见图13至14
[0488]
大变形流变学
‑
参见图15至16
[0489]
讨论：
[0490]
从机理上讲，盐在许多聚合物(包括结冷胶)的凝胶化中发挥至关重要的作用。盐的类型，特别是化合价(单价、二价、三价等)是所得凝胶特性的关键；通常来说，化合价的提高提高了凝胶强度，因为在聚合物之间形成了更多的桥。然而，在结冷胶的情况下，二价离子，例如ca
2+
导致所得凝胶发浑(浊度提高)。因此，单价离子例如na
+
可用于强化螺旋之间的连接位点，形成3
‑
维凝胶结构。因此，所得凝胶强度是添加的盐(也称为交联剂)浓度的函数。交联剂浓度对通过剪切凝胶化形成的微凝胶混悬剂(“流体凝胶”)的形成以及所得微凝胶混悬剂(“流体凝胶”)的影响可在图1和2中清楚地看出。在此，对于所研究的两种聚合物浓度可观察到nacl浓度和弹性(g’)响应之间的相关性，与已知的凝胶化机制(对于较高的交联剂浓度，强度提高)相对应(图2)。此外，力学谱(图1)突出了材料屈服特性的变化。观察到在最高盐浓度(40mm)下，材料应变依赖性提高，表明在离开lvr(线性黏弹区)时g’的下降更快。这样的观察结果与典型的材料响应紧密吻合，当凝胶变得更强时其变得更脆。在这些情况下，认为随着系统变得更密集地交联，材料在其达到临界应变时表现得更接近破裂，这与塑性变形相反。尽管较高的浓度是可扩散的，但增强的应变依赖性降低了它们在例如眼的应用中的使用，其中提高变形的可塑性导致更光滑的表面，并预期提高敏锐度和舒适度。
[0491]
还测试了盐浓度对滴眼剂黏度的影响。在所有系统中几乎没有观察到变化(图2)，其中所有制剂均显示出明显的剪切稀化行为且总体黏度最终取决于生物聚合物浓度。然而，观察到在0.9％(w/v)结冷胶和最高盐浓度(40mm)下，混悬剂的整体黏度较低。这样的观
察伴随着误差的提高，可能是由一定程度的脱水收缩(syneresis)(水的排出)引起的，其中交联密度提高将聚合物拉得更近，导致聚合物不足以构建水相。因此，这些系统的稳定性潜在地受到损害，从而随时间导致异构系统。
[0492]
结论：
[0493]
总之，向生物聚合物系统添加盐导致对最终产品强度的操纵。提高盐浓度最终提高了系统中的交联数目和最终的材料弹性行为。另外，未看到这样的影响使得黏度剧烈变化，然而，在较低的聚合物浓度下，过多的交联会导致形成异质混悬剂和差的稳定性。使用应变扫描来探测弹性结构允许分析混悬剂的屈服行为，突出了在40mm制剂时的较高应变依赖性。预期在眼应用中，塑性性质的降低将引起患者的不适，因此，建议交联剂的上限为20mm。
[0494]
a.3.实验
‑
冷却速率：处理期间应用的冷却速率对于结冷胶微凝胶混悬剂(“流体凝胶”)的制备的影响。
[0495]
目的：
[0496]
·
了解冷却速率对结冷胶微凝胶混悬剂的所得材料特性(黏度和弹性)发挥的作用。
[0497]
·
将冷却速率缩小至适合滴眼剂处理的容差。
[0498]
材料和方法：
[0499]
·
结冷胶(kelco,)
[0500]
·
nacl(fisher chemicals，批号：1665066)
[0501]
结冷胶微凝胶混悬剂(ms)的制备：
[0502]
储备溶液的制备：
[0503]
nacl溶液的制备：
[0504]
通过使用容量瓶将干燥晶体(1.16g)添加至去离子水(100ml)来制备nacl(0.2m)。然后使用倒置技术使nacl溶解以帮助该过程。一旦完全溶解，将溶液保持在环境条件下直至进一步使用。
[0505]
结冷胶溶胶的制备：
[0506]
通过将粉末状聚合物溶解在水/nacl溶液中来制备结冷胶溶液，使得处理后的最终浓度等于0.9％和1.8％(w/v)。简言之，称取结冷胶粉末(4.5g、9.0g)并添加至475ml的去离子水。允许在搅拌下将混合物加热至95℃，使得聚合物溶解。一旦完全溶解，将25ml nacl储备溶液(0.2m)添加至结冷胶溶胶，得到10mm的最终浓度。然后在处理之前使溶胶在95℃下达到热平衡。
[0507]
结冷胶ms的处理：
[0508]
使用夹套针磨机制备ms，由此改变夹套温度和磨机内的滞留时间，导致冷却速率为1、3和6℃/分钟。作为实例：夹套设定为5℃，并且流量为20ml/分钟，入口处流体温度为46，且出口为16，在该速率下的滞留时间为5分钟，因此冷却速率等于6℃/分钟。在离开时，将凝胶包装并储存在4℃下直至进一步测试。
[0509]
材料分析：
[0510]
流变学：
[0511]
使用配备有喷砂平行板(直径：40mm，间隙高度：1mm)的流变仪(ta，ar
‑
g2)在20℃
下测试所有样品。
[0512]
振幅扫描：
[0513]
振幅扫描是在0.1％至100.0％的范围内以应变控制模式获得的。将样品装载到仪器中并降低上部几何形状。一旦经修整，使样品在测试前在20℃下保持平衡。以对数方式在1hz下获得测量值。
[0514]
流动谱：
[0515]
样品的黏度谱是使用连续斜坡获得的。将样品装载到仪器中并降低上部几何形状。一旦经修整，使样品在测试前在20℃下保持平衡。在3分钟的斜坡内，在0.1至600s
‑1之间以速率控制模式对样品施加提高的剪切，其中以对数方式获得数据点。
[0516]
结果：
[0517]
小变形流变学：参见图17和18
[0518]
大变形流变学：参见图19和20
[0519]
讨论：
[0520]
冷却在结冷胶水凝胶的形成中发挥关键作用，其迫使聚合物通过无规卷曲向螺旋转变。研究了冷却速率对流体凝胶形成的影响，以评价材料响应的相关变化。观察到在较低的聚合物浓度(0.9％(w/v))下，冷却速率对系统内的弹性程度和整体黏度二者几乎没有影响。然而，在较高浓度(1.8％(w/v))下，冷却速率对弹性模量(g’)具有多得多的显著影响(图2)。认为在较高聚合物浓度下，颗粒保持更接近得多，因此受颗粒变形的影响多得多。较慢的冷却速率使颗粒形成缓慢得多，导致更有序、更坚固的结构。然而，几乎没有观察到对黏度的影响，表明颗粒彼此间的相互作用程度类似，其中当颗粒彼此“挤压”通过时，在微观尺度上表征颗粒。
[0521]
获得的数据表明在较高聚合物浓度下对材料特性的额外控制程度。能够在不改变整体黏度的情况下改造系统的特定弹性特性。这在身体多个部位的递送系统内是重要的，允许将半固体样结构放置在原位，提供屏障或延长保留。此外，能够保持相同的黏度意指即使它在静止时表现得更固体样，系统仍可注射。
[0522]
结论：
[0523]
发现冷却速率的影响取决于聚合物浓度，发现优化的滴眼剂制剂不依赖于所应用的冷却速率。然而，在较高浓度下，弹性结构可被精细地调整，而不影响黏度谱。因此，当系统处于静止时，可操纵固体性程度，但在较大变形时仍保持可流动(可注射)。
[0524]
a.4.实验
‑
处理时应用的混合速度：处理期间应用的混合速度对于结冷胶微凝胶混悬剂(“流体凝胶”)的制剂的影响。
[0525]
目的：
[0526]
·
了解处理期间的混合速度对结冷胶微凝胶混悬剂的所得材料特性(黏度和弹性)发挥的作用。
[0527]
·
将处理期间的混合速度缩小至适合滴眼剂制剂的容差。
[0528]
材料和方法：
[0529]
·
结冷胶(kelco,)
[0530]
·
nacl(fisher chemicals，批号：1665066)
[0531]
结冷胶微凝胶混悬剂(ms)的制备：
[0532]
储备溶液的制备：
[0533]
nacl溶液的制备：
[0534]
通过使用容量瓶将干燥晶体(1.16g)添加至去离子水(100ml)来制备nacl(0.2m)。然后使用倒置技术使nacl溶解以帮助该过程。一旦完全溶解，将溶液保持在环境条件下直至进一步使用。
[0535]
结冷胶溶胶的制备：
[0536]
通过将粉末状聚合物溶解在水/nacl溶液中来制备结冷胶溶液，使得处理后的最终浓度等于0.9％和1.8％(w/v)。简言之，称取结冷胶粉末(4.5g、9.0g)并添加至450ml的去离子水。允许在搅拌下将混合物加热至95℃，使得聚合物溶解。一旦完全溶解，将25ml nacl储备溶液(0.2m)添加至溶液，得到10mm的处理后浓度。然后在处理之前使溶胶在95℃下达到热平衡。
[0537]
结冷胶ms的处理：
[0538]
使用设定为20℃的夹套针磨机制备ms。使用蠕动泵将结冷胶溶胶以3ml/分钟泵入到针磨机中，以便其进入40℃的处理室。在使用注射器和注射泵进入之前，将水泵入到结冷胶流(以0.16ml/分钟的速率)中，以便它们撞击，将结冷胶溶胶稀释至最终浓度(0.9％和1.8％(w/v)，10mm nacl)。然后使混合物在其通过研磨单元时在剪切(100、500、1000和2000rpm)下冷却。在离开时，在20℃下，将凝胶包装并储存在4℃下直至进一步测试。
[0539]
材料分析：
[0540]
流变学：
[0541]
使用配备有喷砂平行板(直径：40mm，间隙高度：1mm)的流变仪(ta，ar
‑
g2)在20℃下测试所有样品。
[0542]
振幅扫描：
[0543]
振幅扫描是在0.1％至100.0％的范围内以应变控制模式获得的。将样品装载到仪器中并降低上部几何形状。一旦经修整，使样品在测试前在20℃下保持平衡。以对数方式在1hz下获得测量值。
[0544]
流动谱：
[0545]
样品的黏度谱是使用连续斜坡获得的。将样品装载到仪器中并降低上部几何形状。一旦经修整，使样品在测试前在20℃下保持平衡。在3分钟的斜坡内，在0.1至600s
‑1之间以速率控制模式对样品施加提高的剪切，其中以对数方式获得数据点。
[0546]
结果：
[0547]
小变形流变学：参见图21和22
[0548]
大变形流变学：参见图23和24
[0549]
讨论：
[0550]
在0.9％(w/v)和1.8％(w/v)两种浓度下研究了在结冷胶生物聚合物的整个溶胶
‑
凝胶转变中施加的剪切程度。在较低的聚合物浓度下，弹性(由g’定义的)和黏度二者不依赖于整个凝胶化谱中所经历的剪切程度。在所有情况下，所得材料表现出在大变形期间的剪切稀化和静止时的固体样行为，然而，这样的观察的振幅没有改变(图2和图4)。对于1.8％(w/v)系统的黏度谱发现了相同的情况，其中尽管与0.9％(w/v)系统相比观察到黏度升高，但它们不依赖于处理期间所施加的剪切。然而，静止时系统的弹性性质确实显示出依
赖性，随着剪切提高，最终储能模量(g’)降低。认为在凝胶化过程期间提高所施加的混合直接影响单独颗粒的微观结构，且限制水平的提高阻止了更刚性颗粒的生长。作为结果，颗粒更易变形且g’更低。
[0551]
结论：
[0552]
总之，在处理期间改变混合速度对具有低聚合物浓度的微凝胶混悬剂的最终材料特性没有发挥大的作用。因此，可在不改变滴眼剂制剂的最终特性的情况下施加广泛的处理剪切。然而，对于用于“乳膏样”可分散系统的较高浓度，剪切处理在静止时的固体样行为程度中发挥更重要的作用。在这些情况下，可针对预期用途操纵弹性程度。
[0553]
在本说明书的描述和权利要求书通篇，词语“包含/包括”和“包含/含有”及其变化形式意指“包括但不限于”，并且它们不旨在(并且不)排除其他部分、添加物、组分、整数或步骤。在本说明书的描述和权利要求书通篇，除非上下文另有要求，否则单数形式涵盖复数形式。特别地，在使用没有数量词修饰的名词的情况下，除非上下文另外要求，否则本说明书应理解为表示一个/种或更多个/种。
[0554]
除非与其不相容，否则结合本发明的特定方面、实施方案或实例描述的特征、整数、特性、化合物、化学部分或基团将被理解为可适用于本文中所述的任何其他方面、实施方案或实例。本说明书(包括任何随附权利要求书、摘要和附图)中所公开的所有特征和/或如此公开的任何方法或过程的所有步骤均可以以任何组合形式进行组合，其中这样的特征和/或步骤中的至少一些为不相容的组合除外。本发明不限于任何前述实施方案的细节。本发明扩展到本说明书(包括任何随附权利要求书、摘要和附图)中所公开的特征中的任一新特征或任何新组合，或如此公开的任何方法或过程的步骤中的任一新步骤或任何新组合。
[0555]
将读者的注意力引导至与本技术有关的与本说明书同时或在本说明书之前提交并且与本说明书一起公开以供公众查看的所有文件和文献，并且所有这样的文件和文献的内容均通过引用并入本文。
[0556]
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