控制分子电转移的方法和系统与流程

1.本发明涉及一种用于将治疗分子，例如裸质粒dna或rna，电转移传送(也称为电穿孔)至组织内的目标细胞群的系统。该系统的应用示例是使用近场电转移(电穿孔)系统将dna传送至细胞，该近场电转移系统使用连续电极阵列，其中电极集成在插入组织的阵列中，并且电穿孔所针对的细胞与电极相邻而非位于电极之间。


背景技术：

2.电穿孔是分子生物学中使用的一种技术，其中向细胞施加电场以增加细胞膜的渗透性，从而允许将化学物质、药物、dna或rna引入细胞。基本原理是由两个电极之间的高压脉冲产生的电场在高强度电场内引起细胞的质膜的瞬时介电击穿，使dna或其他分子能够进入细胞。
3.常规的电穿孔使用物理分离的电极之间的电场，导致通过电极之间的组织的直流路径。发明人发现利用与物理上连续的线性电极阵列相邻的电场可以利用比使用开放场电穿孔实现相同数量细胞转染所需的更低的累积电荷来实现阵列附近的细胞的转染，其中目标细胞或组织被放置在电极之间的直流路径中。在本发明人的先前的专利申请公开no.wo2011/006204、no.wo2014/201511和no.wo2016/205895中描述了在邻近连续电极阵列的目标区域内刺激转染的技术的发展，它们的公开内容提供了本公开的背景，且可以参考它们以更好地理解发明人的近场电穿孔技术。在wo2016/205895中，发明人公开了一种系统，其中，在其内发生电刺激细胞转染的区域通过基于电极阵列配置和用于产生电场的脉冲序列而控制产生的电场内的梯度来进行控制。wo2016/205895的系统示出了发明人发现的在经受更陡电场梯度的组织区域内改进细胞转染的实际应用。本发明通过配置电极阵列几何形状和脉冲序列来驱动阵列以控制电场的形状来在穿过目标区域的电场中产生轮廓，将这一发现应用于邻近阵列的用于细胞转染的目标区域。用于控制电场形状的变量包括物理上连续的电极阵列配置和刺激脉冲参数。与以前已知的开放场电穿孔相比，使用受控电场成形能够以更低的累积电荷实现提高的细胞转染功效。然而，存在对于另外改进电转移技术的需要。


技术实现要素：

4.根据第一方面，提供了一种使用系统来控制治疗分子向目标细胞群的电转移传送的方法，该系统包括：被配置为插入生物组织的两个或更多个物理连续电极的阵列；和脉冲发生器，其配置为选择性地驱动该两个或更多个电极作为一个或更多个阳极和一个或更多个阴极，用于施加电脉冲，该方法包括：
5.使用一个或更多个电脉冲来确定对作为阳极和阴极驱动的电极的第一选择，并且对于所选择的电极确定该一个或更多个电脉冲的电脉冲参数以产生用于邻近该阵列的目标治疗区域的第一成形电场，其中电极的物理配置、电极和阳极和阴极的选择以及施加的电脉冲参数，控制邻近该阵列的目标治疗区域的电场内的梯度轮廓；
6.使用一个或更多个电脉冲来确定对作为阳极和阴极驱动的电极的第二选择，并且对于所选择的电极确定该一个或更多个电脉冲的电脉冲参数以产生用于邻近该阵列的目标治疗区域的第二成形电场；
7.使用对作为阳极和阴极被驱动的电极的第一选择来控制脉冲发生器施加一个或更多个单极脉冲的第一序列，以产生第一成形电场；和
8.使用对作为阳极和阴极被驱动的电极的第二选择来控制脉冲发生器施加一个或更多个单极脉冲的第二序列，以提供第二成形电场。
9.根据另一方面，提供了一种电转移传送系统，包括：
10.两个或更多个物理上连续的电极的阵列，被配置为插入生物组织；
11.脉冲发生器，其电连接到阵列的电极，并被配置为施加一个或更多个电脉冲以选择性地驱动两个或更多个电极作为一个或更多个阳极和一个或更多个阴极，以在邻近该阵列的生物组织中产生电场，其中电场被成形为基于电极的物理配置、电极和阳极以及阴极的选择以及施加的电脉冲参数来提供电场内梯度的受控轮廓；和
12.控制器，被配置为控制脉冲发生器，该控制器被配置为控制脉冲发生器以使用作为阳极和阴极被驱动的电极的第一配置来施加一个或更多个单极脉冲的第一序列，以提供第一成形电场，以及使用作为阳极和阴极被驱动的电极的第二配置来提供一个或更多个单极脉冲的第二序列，以提供第二成形电场。
13.在系统的一个实施例中，一个或更多个另外的电极被选择以使用一个或更多个电脉冲作为阳极和阴极来驱动，并且对于所选择的电极，确定该一个或更多个电脉冲的电脉冲参数，以产生用于邻近阵列的目标治疗区域的第二成形电场；并且对于电极的各个另外的选择，控制器控制脉冲发生器以使用对作为阳极和阴极被驱动的电极的各个另外的选择，施加两个或更多个单极脉冲的另外序列，以产生各个另外的成形电场，其中各个另外的选择在目标治疗区域内产生与先前电场的电场梯度不同的受控电场梯度。可以选择对电极的选择和脉冲的序列以产生电场序列，其中随后的电场各自具有相对于先前电场以递增角度穿过目标治疗区域的电场梯度。
14.在一个实施例中，电极的第一选择包括一个或更多个阳极和一个或更多个阴极的线性配置，并且电极的第二选择包括具有阳极和阴极被切换从而极性相反的相同电极。
15.在一个实施例中，电极阵列是二维阵列，并且其中电极的第一选择包括一个或更多个阳极和一个或更多个阴极的配置，并且电极的第二选择包括如下电极配置：该配置包括与第一选择不同的电极，选择为以在目标治疗区域内产生电场梯度的变化。
16.该方法还可以包括以下步骤：使用一个或更多个电脉冲来确定对要作为阳极和阴极驱动的电极的一个或更多个另外的选择，并且对于所选择的电极确定一个或更多个电脉冲的电脉冲参数，以生成用于相邻阵列的目标治疗区域的第二成形电场；并且对于电极的各个另外的选择，控制脉冲发生器以使用对被驱动为阳极和阴极的电极的各个另外选择来施加一个或更多个单极脉冲的另外序列，以生成各个另外的成形电场，其中各个另外选择在目标治疗区域内生成与先前电场的电场梯度不同的受控电场梯度。在一个实施例中，选择对电极选择和脉冲的序列，以生成电场序列，其中随后的电场各自都具有相对于先前电场以增量角度通过目标治疗区域的电场梯度。
17.在一些实施例中，增加或减少阳极和阴极之间的间距用于控制治疗区域的半径。
附图说明
18.结合本发明的所有方面的实施例现在将仅参考附图通过示例的方式进行描述，在附图中：
19.图1是根据本发明实施例的电转移系统的示例性框图，
20.图2示出了dna到细胞的极化电转移，
21.图3示出了hek293细胞使用不同脉冲序列驱动的相同2电极线性阵列表达报告质粒dna，
22.图4显示了单向方差分析，对于图3中所示的结果，每个治疗组n＝4，
23.图5a
‑
5d显示了使用串联阵列配置的映射电场和细胞转化结果，
24.图6a
‑
6c显示了使用交替阵列配置的映射电场和细胞转化结果，
25.图7a
‑
7b显示了使用1+2阵列配置的映射电场和细胞转化结果，
26.图8a
‑
8b显示了使用1+5阵列配置的映射电场和细胞转化结果，
27.图9a
‑
9b显示了使用1+8阵列配置的映射电场和细胞转化结果，
28.图10示出了操纵阳极和阴极之间的间隙的一些效果，
29.图11是备选系统配置的框图，
30.图12a
‑
c显示了使用8电极线性阵列的单相和双相电转移比较分析的第一个例子，
31.图13显示了使用8电极线性阵列的单相和双相电转移比较分析的第二个示例，以及
32.图14是示出了利用交替双相脉冲来延长脉冲间间隔会增强基因表达的图。
具体实施方式
33.公开了一种电转移系统，其利用电场梯度方向的变化来帮助将分子，例如裸质粒dna，传送至细胞。系统100(如图1的框图中所示)包括被配置为插入生物组织的两个或更多个物理上连续的电极的阵列110、脉冲发生器120和控制器130。脉冲发生器120电连接到阵列110的电极，并被配置为施加一个或更多个电脉冲以选择性地驱动两个或更多个电极作为一个或更多个阳极和一个或更多个阴极，以在邻近阵列的生物组织中产生电场。电极的物理配置、电极和阳极以及阴极的选择以及施加的电脉冲参数控制在与电极阵列相邻的组织中产生的电场内的梯度的形状和轮廓。控制器130被配置为使用对被驱动为阳极和阴极的电极的第一配置来控制脉冲发生器120施加一个或更多个单极脉冲的第一序列，以提供第一成形电场，以及使用对被驱动为阳极和阴极的电极的第二配置来施加一个或更多个单极脉冲的第二序列，以提供第二成形电场。使用成形电场和不同的第一和第二电场梯度所实现的效果是增加细胞表面积的量，其中分子可以被电场梯度刺激以接触细胞并通过电转移而进入细胞。增加被分子包被的细胞膜面积会增加细胞吸收分子(转染)的可能性。如果在两个不同极性的脉冲之间存在等待期，则在仅使用每个极性的一个脉冲的情况下，电转移效率会提高。在一个实施例中，等待期是15ms或更长，例如15
‑
400ms，可选地10
‑
600ms。在使用两个或更多个单极脉冲的两个(或更多个)序列的情况下，也可以在极性改变之间使用等待期。
34.阵列110可以被配置为临时插入到组织中，例如该阵列可以被结合到用于插入到组织中进行治疗的探针中，然后被移除。该阵列可以被配置为电极的线性阵列。可选地，可
以使用连续电极的二维或三维阵列。阵列可以被配置为允许一些电极作为阳极和阴极驱动，该电极从大量电极中选择出来(因此不是所有都被一次驱动)，这可以基于电极和极性的选择而实现阳极和阴极的不同配置。可选地，该阵列可预先配置为两个电极(或多个电极组合在一起以作为单个电极操作)并选择性地驱动为阳极或阴极。在一些实施例中，阵列可以是可植入的，例如耳蜗植入阵列，其可以被配置用于除听觉刺激模式之外的电转移模式，或者与深部脑刺激兼容的仿生电极阵列可以类似地利用分子电转移的这种动态电场成形模式来开发。其他类型的可植入阵列可以被配置为在延长的时期内植入到目标区域中以使得能够随着时间的推移(例如数周、数月或数年)多次应用基于电转移的疗法。所有这些变化都被认为在本公开的范围内。
35.众所周知，dna电转移到细胞是极化的。当施加足够的电压以产生适合将裸dna输送到细胞的电场时，这种dna积累在细胞的面向阴极的一侧上(例如，dna复合物与细胞膜的电介导形成及其对基因传递的影响，如图2所示。图2中所示的示意图示出了细胞dna的占据仅从一侧进入目标细胞。为了提高电转移效率，需要提高dna对细胞的覆盖。因此，预期电穿孔脉冲的交替极性将提高细胞转染的功效—然而，发明人的工作已经证明，使用交替脉冲事实上降低了转染功效。
36.图3的图像310、330、350示出了使用不同脉冲序列驱动的相同2电极阵列通过hek293细胞表达的报告质粒dna。图3的图像是在巨细胞病毒(cmv)启动子下编码报告的裸质粒dna的电转移后，在hek293细胞单层中mcherry荧光报告表达的示例；脉冲串中10x100μs脉冲x10ma在单相模式下使用发明人开发的原型电流刺激器(也可以使用专有的恒流刺激器或恒压刺激器)和两个连续细长电极的线性阵列—其中一个作为阳极(+ve)驱动，一个作为阴极(
‑
ve)驱动—来输送。施加的刺激序列以单相模式320应用—其中所有十个脉冲具有相同的极性—以及以双相模式340应用，其中五个脉冲具有相同的极性，然后第二组五个脉冲具有相反的极性(双相)。第三个脉冲串配置具有交替的正向和负向脉冲(交替双相)360。脉冲间间隔为400微秒。将dna和电转移阵列放置在盖玻片上的细胞上。脉冲被传送，且然后盖玻片在成像前返回培养48小时。该实例表明，双相模式340中dna电转移效率330显著提高。图4显示了单向方差分析，每个处理组n＝4。
37.图3中的图像显示了使用线性阵列电穿孔探针通过近场电转移进行dna细胞转染的区域，电穿孔发生在与线性电极阵列相邻的区域中。大多数细胞被转染所处的区域是其中线性阵列产生的电场集中的区域。310的图示显示响应于一系列单极电穿孔脉冲320(称为单相脉冲序列)的应用而转染的细胞，相反，350显示利用使用交替极性电穿孔脉冲(交替双相)驱动的相同电极阵列而转染的细胞，令人惊讶的是，与单相结果310相比，这种电荷平衡的交替双相模式导致dna电转移和报告基因表达的显著减少。从dna被驱动到细胞的面向负电极的一侧的效果来看，人们可能期望交替脉冲具有将dna驱向细胞的两侧的效果，并通过增加暴露于dna的细胞面积来提高转染功效，但令人惊讶的是，使用交替极性提供了非常差的结果。
38.在使用几个单极脉冲的序列和随后的几个相反极性的单极脉冲的另外序列(称为双相)进行电转移的情况下，则转染功效显著提高，如图3的330所示。这些结果表明通过延长将dna驱向细胞并维持与细胞膜的接触(粘附)来进行电转移，转染功效得以提高。图3和4中所示的单相结果310与交替双相结果350的比较证明了这一点。双相结果功效的进一步提
高提供了证据，即在将dna朝向细胞沿一个方向驱动长时间的电转移后，改变到相反的极性，且使dna从相反的方向朝向细胞驱动，并覆盖相反的一侧，会进一步提高转染功效。
39.本公开描述了一种使用发明人称为“切换模式电转移”的技术来提高将dna传送到细胞中的效率的方法。这是一种使用连续电极阵列来产生电场的电转移模式，该电场在相邻阵列具有受控电场梯度。切换模式操作使用第一单极脉冲序列产生通过目标区域的具有受控电场梯度的第一成形电场，并使用第二单极脉冲序列产生第二成形电场，改变通过治疗区域的电场梯度的方向。电场梯度的这种变化导致分子(dna)从不同方向被驱向细胞，且从而覆盖细胞的不同区域。本系统的实施例使用多个单极脉冲来产生和维持各个成形电场一段时间，该时间足以在dna分子和细胞之间建立功能性接触以实现转染。应注意的是，在应用单极脉冲序列期间，可能不会发生细胞对dna分子的完全转染或摄取。建立功能性接触应被理解为包括细胞摄取dna的任何阶段：尽管驱动的电转移电场停止或改变方向，但其仍能使摄取继续进行。这可能包括通过内吞等过程摄取与细胞质膜结合的dna(或rna)。
40.在图3中，发明人提供了概念数据证明，显示了当基因电转移阵列中的电极极性在脉冲串期间切换时，利用电极的连续阵列(在本实例中为线性阵列)在单层模式中由hek293细胞对报告质粒dna的增强表达。正是这种切换的性质提供了dna(或rna)电转移功效的改进。本发明人显示了根据特定要求切换脉冲极性可以实现dna电转移效率的出乎意料的提高。在该方法和系统的一个实施例中，电转移脉冲串包括一系列一种极性的脉冲，随后是一系列相反极性的脉冲。发明人已经显示了，在电极上在正极性和负极性之间交替的潜在明显且有利的策略(通常用于连续电刺激作为电荷恢复策略)实际上适得其反，导致dna电转移的效率较低。因此，通过使用一系列单极电流转移脉冲顺序构建dna转移，然后是相反极性的脉冲，效率的意外增益提供了该系统的显著转染功效优势。
41.申请人的在先公开no.wo2016/205895公开了一种用于控制电场梯度以进而控制发生转染的区域的系统。本文公开的这项技术的当前发展利用这种能力来成形电场，以通过改变电场梯度的方向来控制在细胞的相当大的面积上的细胞电转移涂层。通过将分子从不同的方向驱向细胞，这基本上使细胞能够用dna分子进行受控“涂绘”以进行电转移。此外，通过使用几个单极脉冲，可以在改变电场梯度方向之前在dna分子和细胞之间形成功能性接触，并可能驱使dna分子远离细胞表面。
42.本发明的电转移技术以电极阵列附近的细胞为目标，其中通过电流源(阳极)和电流返回(阴极)的组合在阵列周围形成电场，成形电场内的梯度控制其中发生细胞转染的区域。通过改变电场梯度方向，可以增加处理dna分子对细胞的覆盖，从而提高转染功效。图5
‑
9中显示了映射电场的示例，示出了基于改变阵列配置的治疗区域的变化，且从而示出了产生的电场。图5b、6a、7a、8a和9a显示了由八电极阵列的不同阳极和阴极配置产生的映射电场电位的示例，且图5c、5d、6b、6c、7b、8b和9b显示了各个阵列配置在电穿孔之后的细胞转化的结果分布。阵列中的8个电极按以下组合配置为阳极和阴极：
43.串联
–
四个并置的阴极，然后是四个并置的阳极，所有元件的间隔为300μm，总长度为5mm(如图5b
‑
5d中所示)；
44.交替
–
在300μm间隔内交替的阴极和阳极，总长度5mm(如图6a
‑
6c中所示)；
45.1+2
–
300μm间隔内的单个阳极和单个阴极(如图7a
‑
7b中所示)；
46.1+5
–
单个阳极和单个阴极，间隔为2.45mm(如图8a
‑
8b中所示)；和
47.1+8
–
单个阳极和单个阴极，间隔为4.55mm(如图9a
‑
9b中所示)。
48.图5b、6b、7b、8b和9b显示了阵列配置对电穿孔介导的基因传送的影响的比较，所有阵列配置使用具有以下参数集的脉冲序列驱动：40v、10个脉冲、50ms持续时间和1个脉冲/秒。尽管所有阵列配置都产生了显著的细胞转导(cell transduction)，但由于阵列配置、阳极和阴极之间的空间以及阳极和阴极的数量和模式的不同，对转化效率有显著影响。1+2阵列驱动配置产生了直径～1毫米的球状细胞场，有源电极位于中心(图7b)。交替阵列驱动配置对转染细胞场产生线性偏差，延长了阵列的长度(～5mm；81.8
±
11.3gfp
‑
阳性细胞)，如图6b和6c中所示。1+5和1+8阵列驱动配置产生较小的平均转化细胞数，其具有低密度分布(图8b和9b)。串联配置的转染效率显著高于任何其他配置(图5c和5d)，且模式形状呈球形，以阵列中点为中心，其是四个阳极和四个阴极之间的汇合点。发明人的测试显示了当阵列被配置为将阳极和阴极组合在一起作为双极(“串联”配置)时，实现高效细胞转导所需的电荷传送最少。
49.为了比较，图5b、6a、7a、8a和9a显示了为每个阵列配置映射的电场，在施加到阵列的100ms 4v脉冲300结束时测量场电位，如图5a所示。图5a还示出了使用串联阵列配置以0.5v到4v(100ms持续时间)记录的场电位的迹线310。与以“交替”配置连线的等量电极相比，“串联”配置允许显著更高的转导效率。该研究还表明，较小的双极电极配置效率较低(1+2、1+5、1+8)。“串联”阵列配置显示出意外的细胞转导效率的原因归因于电场聚焦的几何形状(图5b)。串联阵列400表现出最高的电场轮廓密度，从阳极和阴极410之间的结点开始零位追踪(图5b)。相比之下，尽管使用相同数量的电极，但交替阵列配置500具有较低的电场密度梯度，沿着阵列分布，峰值在阵列510的末端(图6a)。鉴于细胞的球形gfp正场以“串联”阵列的零点为中心(图5c和5d；与图5b中电极4和5之间的点410正交)，数据表明是细胞上的电场梯度，而不是电位的绝对阶跃变化，驱动电穿孔和dna摄取。其他阵列配置的细胞分布显示出与被测量的电场相似的关联，并且1+2>1+5>1+8中gfp阳性细胞数量的下降与电场相对于电极的展宽相关。
50.阵列周围的电场(且特别是电场内的梯度)与转化细胞的空间映射密切相关。因此，细胞转导取决于细胞上的电位梯度，而不是绝对电压。这在使用0.9％盐水溶液的串联配置的等高线图(contourmap)中最为明显，其中场中的零区域正交于电极4和5之间的阵列迁移(图5b)。场等高线(contourline)在这条线附近最陡峭，并保持与转导细胞图相对应的球形形状。串联阵列的两端的任一端处的电位测量值最大，但更均匀。随着分开双极电极的距离增加，场密度下降，如通过比较图7b、8b和9b各自中的1+2、1+5和1+8阵列的结果所证明的。
51.从上面的描述应该显而易见的是，可以选择电极配置和脉冲参数的组合来实现具有受控电场梯度的成形电场。产生这些受控电场的一个关键要素是阵列配置。一个实施例被设想为包括一片连续电极的阵列，例如排列成二维网格(即矩形、六边形、三角形等网格配置)并连接以允许选择性地使用电极的组合以有效地提供多种电极配置，以及当所选择的电极被驱动为阳极和阴极时，在电场的形状和梯度中的相关变化。例如，一行电极可以以如下方式来被选择并驱动：第一组相邻电极充当组合阴极，而另一组相邻电极充当组合阳极—串联配置。然后可以选择并驱动相对于第一行成角度的另外一组的对齐电极，以改变电场梯度的方向。例如，选择一组不同的电极可以导致产生通过目标区域的电场，电场梯度
相对于先前的电场成角度。在极性简单地反转的情况下，具有相似形状的电场具有相反的电场梯度。选择不同的电极组可以改变相对电场梯度角。选择不同的电极组也可以改变电场形状。可以基于目标电场形状(或多个形状)选择任何电极配置。可以选择不同电极的序列，并且使用电转移脉冲驱动它们，以最佳地靶向治疗区域，以通过电场梯度、形状和极性将带电分子传送至细胞表面。
52.一些实施例基于电极的线性阵列扩展了这种转染靶向能力以提供“切换模式”电转移策略，其中脉冲的极性和电极阵列内转移电流的电极组合两者都可以在脉冲串内或多个脉冲串内切换，以围绕组织内的目标细胞旋转聚焦电场；有效地将dna涂在细胞的所有表面上；从概念上讲，能够实现对细胞的“涡旋电转移”dna涂覆。
53.在一些实施例中，电极配置还控制转染区域相对于线性电极阵列的范围。如图5b所示，阵列中间附近的电场梯度具有最陡峭的电场梯度，且图5c和5d的结果表明该区域是最多细胞被转染的区域。场形状归因于线性排列的细长阳极和阴极的组合(在该配置中，阳极和阴极中的各个都包括多个相邻的线性排列的电极)。阳极和阴极的细长性质有助于控制产生的电场形状，从而控制转染区域。改变细长阳极和阴极之间间隙的宽度会改变与阵列正交的转染区域的范围。通过改变间隙，可以扩大或缩小电场形状，从而扩大或缩小转染区域。在所示示例中，增加电极之间的间隙会扩大电场和转染区域，而减小间隙会限制场。应该注意的是，对于本示例中使用的脉冲参数，这种场形状控制或矢量化适用于电极之间最多约5mm的间隙。结合电流水平的相应增加，增加该间隙可能是可行的，但是由于由较高电流水平引起的潜在负面副作用，使用另外组的电极以使得能够治疗更大的区域可能是优选。控制电场的径向扩展也称为矢量化。图10示出了操纵阳极和阴极之间的间隙的效果。
54.图10图像1020至1050示出了在操纵线性电极阵列的阳极和阴极之间的间隙的情况下转染区域的膨胀和收缩，在图10的实例中，使用了显示为1010的类型的探针，其具有线性两电极阵列，电极之间的间距不同。操纵电场的效果
‑
通过减少两个铂铱电极(绝缘支架上的2mm x 0.35mm直径
‑
如右上图所示)之间的间隔来实现，其中一串电脉冲(恒定电流，100μsx10脉冲，400μs脉冲间隔，10ma+ve相位)。数据显示了质粒dna(绿色荧光报告蛋白
‑
gfp
‑
在巨细胞病毒(cmv)启动子下)的电转移的空间控制，其使用等渗多糖载体传送至人胚肾(hek)293细胞的单层。将dna和电转移阵列放置在盖玻片上的细胞上。脉冲被传送，且然后盖玻片在成像前返回培养48小时。最高电场强度在两个电极之间的零点附近。随着电极分离，足以进行dna电转移的电场会扩大，直到获得重组dna表达盒的最佳分散和表达细胞密度(电极间隔为1
–
4mm之间)。
55.在另外的实施例中，通过在近场电极阵列内的电极之间切换(例如扩大或缩小电场)，脉冲极性的操纵可以与电场形状的动态改变相结合。这种切换可能发生在脉冲串序列期间，或发生在脉冲串之间，以便场的极性和矢量化两者都围绕目标细胞旋转。这用于将dna“涂”到细胞表面膜上。通过沿线性阵列移动两个主电极(各自长2mm，直径350μm)的间距的作用，可以看到电场的改变的矢量化的方法
‑
如图10中所示。
56.系统实施例可以将单独的组件用于阵列、脉冲发生器和控制器，或者可以将这些功能集成到综合系统中。图11中示出了包括控制器的系统实施例的框图，系统1500包括如上所述的电极阵列1510和控制器1530。在该框图中，示出控制器包括脉冲发生器1520，然而脉冲发生器可以为一件单独的设备。所示实施例还包括可选特征，例如配置模块1540，以实
现对如上所述的阵列配置的控制；药剂(agent)传送模块1550，控制通过探针传送治疗药剂；用户界面1560；以及存储器1570，其用于存储诸如治疗参数1580和治疗日志1590的数据。
57.在一个实施例中，使用计算机系统来实施控制器，该计算机系统可以包括系统的全部功能，或者通过数据连接控制专用硬件组件。控制器硬件、固件和软件的任何可能配置都在本发明的范围内预见。在一个实施例中，控制器功能可以使用专用硬件设备来实现，例如被修改以提供控制器功能的脉冲发生器版本或专用硬件设备，例如包括硬件逻辑asic(专用集成电路)或fpga(现场可编程门阵列)、实现控制器功能的固件和软件。专用系统的优势在于可以独立于商业软件平台和操作系统，这可能有利于获得监管部门的批准并将系统的使用限制为预期目的。然而，该实施例的缺点可能是增加了的系统开发和持续维护成本，并且缺乏利用技术领域中的新技术或发展的灵活性。
58.可选地，控制器功能可以作为在诸如个人计算机、服务器或平板电脑之类的计算机系统上可执行的软件程序来提供，并且被配置为向独立脉冲发生器和诸如药剂传送致动器的其他可选硬件提供控制指令。设想到能够使用市售的计算机硬件执行的基于软件的控制器实施例为专家提供用户界面1560，以输入电穿孔处理1580的参数，然后这些参数被存储在存储器1570中以用于驱动脉冲发生器1520和可选的配置模块1540和电穿孔治疗传送期间的药剂传送模块1550。在一个实施例中，这可以包括控制器分析目标治疗区域参数和载体溶液参数；确定合适的电极阵列配置(一个或多个)；以及定义至少一个基于上述关系计算的脉冲序列，以实现每个适当阵列配置的目标治疗场。在其中药剂传送可由控制器控制的实施例中，控制器还可以计算和定义治疗脉冲序列中的药剂传送致动。在其中阵列配置可由控制器控制的实施例中，控制器还定义由配置模块实施的阵列配置。在其中阵列配置取决于固定阵列配置的选择的实施例中，专家/外科医生/临床医生可以将选定的探针阵列配置输入到控制器中，或者控制器可以输出探针选择建议。如果确定阵列和脉冲序列的不止一种组合适合满足治疗要求，则可能的组合可以输出给外科医生/专家/临床医生以供选择。
59.控制器的一些实施例可以提供软件来对治疗建模。在一些实施例中，用于建模的数据可以包括患者成像数据(即，mri或ct扫描)，以使得能够结合患者数据来考虑建模的治疗场。建模数据还可以包括治疗药剂载体溶液的选项。例如，确定可行或最佳的载体溶液参数以通过建模安全地实现预期的治疗结果。可选地，在有限数量的载体溶液选项可用的情况下，对每个选项的潜在结果进行建模，以有助于专家/外科医生/临床医生做出决策。
60.应当理解，与计划治疗相关联而提供的系统功能可能是复杂的并且利用复杂的软件模型来确定驱动物理治疗设备所需的数据。但实际执行治疗所需的实际数据可能非常简单—定义的阵列配置(其甚至可能是固定阵列)、定时脉冲序列和可选地用于控制所选药剂溶液的药剂传送的信号。因此，控制器可以简单地输出用于驱动物理治疗设备的序列数据。
61.脉冲发生器1520的实施例可以在电压或电流驱动模式下操作。在一个实施例中，脉冲发生器是自主的独立单元，具有独立于控制器的其自己的电源。脉冲发生器可以与控制器进行数据通信，以使控制器能够用脉冲序列对脉冲发生器进行编程。可选地，脉冲序列可由控制器计算并通过手动编程或数据传输(例如通过直接连接、无线连接或通过诸如便携式固态存储设备之类的物理介质)加载到脉冲发生器中，并且脉冲发生器独立于用于治
疗传送的控制器而被操作。将脉冲发生器与控制器隔离可能是某些系统的安全要求，特别是使一次性dna(或rna)传送探针能够使用已经批准并可用于人类临床使用的脉冲发生器进行操作。在某些国家，这可以使探针获得独立的监管批准，以便与所选的商用和监管批准的脉冲发生器结合使用。
62.本系统和方法的实施例可以有利地应用于dna治疗、涉及核酸电转移的分子治疗领域，例如裸质粒dna和rna，或其他带电分子。实施例可用于制药和生物技术行业，并可适用于从事基于dna的疗法并需要高效的非病毒dna传送平台的任何行业。
63.图12
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14显示了原型测试结果的示例。
64.示例1：1μg/μl浓度时mcherry报告质粒的仿生阵列定向基因电转移(badge)后
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单相与双相脉冲串后，电脉冲极性对荧光报告蛋白表达的影响。
65.图12a
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12c显示了使用仅一种极性的单向脉冲的脉冲序列(图12a)和具有相同脉冲数和幅度但极性改变的双相脉冲序列(图12b)的电转移比较示例的结果。图12中的测试结果示出了切换电极极性对hek293细胞中mcherry表达的影响。在使用8电极动物模型耳蜗植入阵列进行dna电转移后4天，mcherry荧光使用共聚焦显微镜来成像。该阵列以串联配置接线(四个相邻的pt/lr电极带组合为阳极，接下来的四个电极组合为阴极)。在电转移前～24小时接种圆形盖玻片(直径18mm)，此时hek293细胞融合度约为50％。在9％蔗糖、0.09％nacl和500um的naoh中传送20μldna(cmvp
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mcherry和pfar4
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bdnf
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nt3各1ug/ul)后，使用通过基因传送阵列传送的10x40ma 100μs脉冲进行电转移。然后将电转移转染的盖玻片放入30mm的培养皿中，其中有4ml的含有5％胎牛血清(fbs)的达尔伯克改良伊格尔培养基(dmem)细胞培养基。单相是指5个固定极性的脉冲。双相是指用一个极性的电极施加5个脉冲，然后极性相反的5个脉冲。4天后，对活细胞进行成像，且随后针对bdnf和nt
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3elisa将2x0.5ml等分的培养基快速冷冻。图12a显示了用10个脉冲转染的盖玻片的例子，每个脉冲具有相同的4个组合电极作为活动(active)和相反的4个作为返回(电极)。图12b显示了用5个脉冲转染的盖玻片的例子，其中4个组合电极为活动的，4个相反的电极为返回(电极)，然后是在切换电极极性后的5个脉冲。图12c显示了来自叠加的各个盖玻片的数据的箱线图，边界代表25％和75％的数据限制，条形代表95％的分布限制。实心线是中位数，虚线是平均值。通过t
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测试进行统计比较。
66.示例2：4μg/μl浓度时mcherry报告质粒的仿生阵列定向基因电转移(badge)
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单相与双相脉冲串后，电脉冲极性对荧光报告蛋白表达的影响。
67.图13显示了切换电极极性对hek293细胞中核局部mcherry报告基因表达的影响的示例。在使用8电极动物模型耳蜗植入阵列进行dna电转移后4天，mcherry荧光通过共聚焦显微镜成像。仿生阵列以串联配置接线(四个相邻的pt/ir电极带组合为阳极，且接下来的四个电极组合为阴极)。圆形盖玻片(直径18mm)在badge前～24小时用hek293细胞接种，此时hek293细胞融合度为约50％。在9％蔗糖、0.09％nacl和500μm的naoh的载体溶液(总质粒dna浓度为4μg/μl)中将20uldna施加到盖玻片(4ug/ulcmvp
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mcherry)后，badge使用通过基因传送阵列传送的10x40ma 100μs脉冲来执行。然后将电转移转染的盖玻片放入30mm培养皿中，其中有4ml含有5％胎牛血清(fbs)的达尔伯克改良伊格尔培养基(dmem)细胞培养基。单相是指具有固定电极极性的所有10个脉冲。双相是指用一个极性的电极施加5个脉冲，然后极性相反的5个脉冲。箱线图是关于来自叠加的各个盖玻片的数据。边界代表25％和75％
的数据限制，条形代表95％的分布限制。实心线是中位数；虚线是平均值。通过mann
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whitney秩和检验进行统计比较。
68.实施例3：具有交替极性的脉冲间间隔的影响
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在mcherry报告质粒的仿生阵列定向基因电转移(badge)后受驱的荧光报告蛋白表达。
69.图14显示了结果图，其图示了用交替双相脉冲延长脉冲间间隔会增强基因表达。该测试使用badge电极的交替双相极性(在每个脉冲之间从(+)变为(
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)；持续时间为10x4ms)导致当脉冲间间隔超过16ms时hek293细胞的转染增加。2μg/μl的cmvp
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mcherry报告质粒在9％蔗糖、0.09％nacl和500μm的naoh载体溶液中(20μl总体积质粒dna应用于18mm盖玻片上的hek293细胞)。各种条件下n＝5；盖玻片上的总像素强度代表mcherry衍生的荧光(核局部化)通过共聚焦成像的整合。kruskal
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wallis使用tukey检验多重配对比较对等级进行单向方差分析。
70.本发明领域的技术人员将理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下可以进行许多修改。
71.在随后的权利要求和本发明的前述描述中，除非上下文由于表达的语言或必要的暗示而另有要求，否则“包括”一词或诸如“包括了”或“包括有”等变体以包含性的意义使用，即指定所述特征的存在但不排除本发明的各种实施例中另外的特征的存在或添加。
72.应当理解，如果在本文中提及任何现有技术出版物，则此类参考不构成承认该出版物构成澳大利亚或任何其他国家的本领域公知常识的一部分。