APJ表达促进剂的制作方法

apj表达促进剂
技术领域
1.本发明涉及apj表达促进剂。


背景技术：

2.皮肤弹力对表观的年龄、外观影响大，维持、改善皮肤弹力是美容上的大课题。关于皮肤弹力，进行了大量与胶原、弹性蛋白、透明质酸这样的真皮层的基质有关的研究。例如，真皮层的胶原的量有大影响是众所周知的。在以往的美容方法中，为了实现皮肤弹力的改善，专注于通过真皮成纤维细胞的活化而使弹性纤维增加，找到具有真皮成纤维细胞的活化作用、胶原产生促进作用的成分，应用于化妆料。
3.迄今为止，作为通过胶原的产生促进来预防/改善皮肤的年龄增长变化的来源于天然物的成分，报导了异黄酮化合物、植物甾醇等，此外发现了滨海前胡(国际公开第2013/099378号)、侧柏种子(国际公开第2012/057123号)、琉球矢竹、薜荔和番杏(日本特开2011
‑
195505号公报)等的植物提取物。此外，已知经由在成纤维细胞中表达的整联蛋白等黏附分子，成纤维细胞与细胞外基质相互作用，这样的相互作用与弹性有关(非专利文献1)。迄今为止的认识着眼于皮肤弹力与胶原或成纤维细胞的黏附分子的关系。
4.现有技术文献
5.专利文献
6.专利文献1：日本专利第5808769号公报
7.专利文献2：日本特开2012
‑
20942号公报
8.专利文献3：日本特开2013
‑
209339号公报
9.专利文献4：国际公开第2012/133825号
10.专利文献5：日本特开2018
‑
172410号公报
11.专利文献6：日本特表2019
‑
501899号公报
12.专利文献7：国际公开第2007/072980号
13.专利文献8：日本专利第5648149号公报
14.非专利文献
15.非专利文献1：j.inv.dermatology(2013)vol.133,899
‑
906
16.非专利文献2：blood,2010,volume 115,number 15,3166
‑
3174
17.非专利文献3：diabetes,vol.62,june 2013，1970
‑
1980
18.非专利文献4：j cell physiol.2019；234:61
‑
74
19.非专利文献5：kidoya et al.,embo j.2008feb 6；27(3):522
‑
34
20.非专利文献6：kajiya et al.,j dermatol sci.2018oct；92(1):3
‑521.非专利文献7：nakatani et al.,skin res technol.2013feb；19(1):e332
‑8

技术实现要素：

22.发明所要解决的课题
23.本发明的课题是提供通过与以往的皮肤弹力改善剂、方法不同的机制来改善皮肤弹力的物质、以及筛选具有皮肤弹力改善作用的物质的方法。
24.用于解决课题的手段
25.本发明者们为了改善皮肤弹力而进行了深入研究，结果发现，经由使apj的表达增强所带来的血管的稳定化、功能提高，和/或通过抑制由年龄增长引起的皮肤血管的减少而皮肤弹力改善，进一步也发现促进apj的表达的新物质，从而完成了本发明。
26.本发明涉及下述发明：
27.(1)一种apj表达促进剂，用于改善皮肤弹力。
28.(2)一种apj表达促进剂，由选自蕺菜提取物、樱叶提取物、和印楝叶提取物中的1种或多种生药组成。
29.(3)
30.一种皮肤弹力改善剂，包含(1)或(2)所述的apj表达促进剂。
31.(4)
32.一种皮肤弹力改善剂的筛选方法，以apj表达作为指标。
33.(5)
34.根据(4)所述的筛选方法，包括下述步骤：
35.用包含候选药剂的培养基将生物体试样进行培养；
36.测定生物体试样中的apj表达；以及
37.在apj表达与对照相比增加了的情况下，将候选药剂确定为具有皮肤弹力改善作用的物质。
38.(6)
39.一种用于实施(4)或(5)的任一项所述的筛选方法的试剂盒，包含用于确定apj表达的试剂。
40.(7)
41.一种用于改善对象的皮肤弹力的美容目的的方法，包括促进对象的apj表达的步骤。
42.(8)
43.根据(7)所述的方法，对象的apj表达的促进通过将(3)所述的皮肤弹力改善剂施与对象来实现。
44.发明的效果
45.本发明的apj表达促进剂可以促进apj的表达。如果apj的表达被促进，则可实现血管的稳定化，皮肤弹力被改善。包含选自蕺菜提取物、樱叶提取物、和印楝叶提取物中的1种或多种生药的apj表达促进剂经由血管的稳定化而对皮肤弹力改善是有效的。此外，通过本发明的筛选方法，可以选择具有皮肤弹力改善作用的物质。通过本发明的筛选方法而选择的皮肤弹力改善剂通过apj的表达促进，经由血管的稳定化，而改善皮肤弹力。通过改善皮肤弹力，可以改善皱纹、松弛这样的肌肤的问题。
附图说明
46.图1显示3d血管形成真皮模型制成的情形。
47.图2为显示用抗pecam
‑
1/cd31抗体染色了的血管(绿)和用抗i型胶原抗体染色了的i型胶原(红)的局部存在的血管形成模型的显微镜照片。
48.图3的左图为将通过超声波声学扫描显微镜测定了人皮肤切片的声速(硬度)值(m/s)而得的图像与该切片的血管(红)的可视化免疫染色图像重叠了的图。作为代表例，对年轻人(20岁)和中老年人(50岁)进行显示。右图为将血管周围的声速(硬度)值定量化，显示年轻人(10～20岁)和中老年人(50～70岁)的平均值的图。图中，＊＊＊表示通过学生t检验而具有显著性差异(＊＊＊p<0.001)。
49.图4为显示胶原浓度(mg/ml)与储能弹性模量g’(pa)的关系的图。
50.图5为显示胶原浓度(mg/ml)与接触力(mn)的关系的图。
51.图6为对于在具有各浓度(mg/ml)的胶原凝胶内培养后的3d血管形成真皮模型，用抗pecam
‑
1/cd31抗体染色而将血管(绿)可视化而得的的显微镜照片，和用cy3αsma抗体染色而将周细胞(红)可视化而得的显微镜照片。
52.图7的左图为显示胶原凝胶浓度与在具有各浓度的胶原凝胶内培养后的血管内皮细胞中的apj的mrna表达量的关系的图，用将凝胶浓度为0mg/ml(
‑
)的情况下的表达量设为100的相对值(％)表示。图中，＊、＊＊表示通过学生t检验而具有显著性差异(＊p<0.05，＊＊p<0.01)。右图为显示在胶原凝胶中形成的3d血管形成真皮模型中的用抗pecam
‑
1/cd31抗体染色了的血管(绿)、用hoechst染色了的细胞核(蓝)、和用抗apj抗体染色了的apj(红)的局部存在的显微镜照片。
53.图8的左图显示转染了apj高表达载体而高表达apj的3d血管形成真皮模型制作的概略。右图为显示对照和高表达apj的3d血管形成真皮模型中的用抗pecam
‑
1/cd31抗体染色了的血管结构(红)的显微镜照片。
54.图9为显示由本技术导出的皮肤的弹性与apj的表达以及与此相伴的血管稳定化的关系的概念的示意图。
55.图10将使用了蕺菜提取物、樱叶提取物、和印楝叶提取物的情况下的apj的表达，作为将对照(control)设为100的情况下的相对值(％)而显示。图中，＊、＊＊表示通过学生t检验而相对于对照具有显著性差异(＊p<0.05，＊＊p<0.01)。
具体实施方式
56.apj(别名agtrl1：angiotensin receptor like 1，血管紧张素1型受体相关蛋白)是被报导在血管系统、神经系统、脂肪细胞等中广泛表达的7次跨膜型的g蛋白质共轭型的受体。显示出apj的表达在心脏中参与心肌收缩作用，在神经系统中参与加压素的表达的控制、血管、淋巴管的稳定、体液的调节机制等。在血管系统中，报导了在血管内皮细胞、壁细胞等中表达，可以认为在心血管系统、外周血管等的血管形成中发挥重要的作用。报导了在血管中，爱帕琳肽(apj内源性配体)结合于apj受体，从而参与血压下降、血管新生、动脉硬化、缺血的恢复等。此外，也研究了各种apj激动剂的探索、使用了apj激动剂的心血管衰竭、血管病、心境障碍等各种疾病的治疗(专利文献1～7、非专利文献1～5)。
57.然而，在迄今为止的认识中，关于皮肤弹力与apj表达的相关，是未知的。令人惊讶的是，本发明者们发现，通过促进apj的表达而引发血管的稳定化，在血管周围合成胶原，即皮肤弹力改善。进一步也发现了，根据较大参与皮肤弹力的基质弹性这样的周围环境的物
性而apj的表达变化。即发现了下述机理：血管中的apj表达与由胶原合成等带来的皮肤弹力这样的物性密切地相互作用，在生物体内apj根据周围的基质环境的物性而表达增强，其结果将血管结构稳定化，在周围促进胶原合成，皮肤维持适当的弹性。
58.本发明基于这样的发明者们的认识，涉及用于改善皮肤弹力的apj表达促进剂。在1实施方式中，本发明的apj表达促进剂由选自蕺菜提取物、樱叶提取物、和印楝叶提取物中的1种或多种生药组成，或包含选自蕺菜提取物、樱叶提取物、和印楝叶提取物中的1种或多种生药。然而，只要是能够促进apj的表达的物质，就不限定于这些，例如，可以使用专利文献3、4、7、非专利文献4等所记载那样的apj激活剂。
59.蕺菜(
ジュウヤク
)(houttuynia cordata)别名也被称为鱼腥草(
ドクダミ
)，是在日本各地、中国、越南等亚洲地区广泛分布的三白草科蕺菜属的多年生草本植物。叶、茎、花、根等植物体作为利尿作用、高血压、动脉硬化等的药用而使用。蕺菜提取物是指将蕺菜的植物体、特别是地上部分进行提取而得的提取物。
60.樱叶是指属于李属(prunus)的植物的叶，所述属于李属(prunus)的植物例如，日本晚樱(prunus yedoensis matsum.)、大岛樱(prunus lannesiana var.speciosa.)、细齿樱桃(prunus serrulata)这样的植物。李属是在日本各地、东亚、北美等各地发现的蔷薇科的落叶阔叶树。已知樱叶具有保湿作用、美白作用、抗炎作用等。樱叶提取物是指将李属的叶进行提取而得的提取物。
61.所谓印楝(
ニーム
)(azadirachta indica)，是别名也被称为印度楝(
インドセンダン
)的印度原产的楝科的树木。印楝在印度、斯里兰卡等，以杀菌作用、保湿作用等效果作为目的而用于印度草医学(ayurveda)等。印楝叶提取物是指将印楝的叶进行提取而得的提取物。
62.上述植物的提取物可以使用作为化妆品原料、健康食品材料而市售的商品，可以通过常规方法获得。提取方法没有特别限定，但优选为使用了溶剂的提取法。在进行提取时，可以将原料植物与提取溶剂一起在常温或加热而进行了浸渍或加热回流后，过滤、浓缩而获得。也可以将植物体直接使用，但粉碎成颗粒状、粉末状而供于提取时可以在温和的条件下短时间以高提取效率进行有效成分的提取。提取温度没有特别限定，只要根据粉碎物的粒径、溶剂的种类等来适当设定即可。通常，在从室温到溶剂的沸点的范围内设定。此外，提取时间也没有特别限定，只要根据粉碎物的粒径、溶剂的种类、提取温度等来适当设定即可。进而在提取时，可以进行搅拌，也可以不搅拌地静置，也可以施加超声波。
63.作为提取溶剂，只要是通常用于提取的溶剂，就可以任意使用，例如，可以将水性溶剂例如水、生理盐水、磷酸缓冲液、硼酸缓冲液，或有机溶剂例如乙醇、丙二醇、1,3
‑
丁二醇、甘油等醇类、含水醇类、氯仿、二氯乙烷、四氯化碳、丙酮、乙酸乙酯、己烷等分别单独使用或组合使用。
64.通过这样的提取操作，有效成分被提取，溶解于溶剂中。包含提取物的溶剂可以直接使用，但也可以施加灭菌、洗涤、过滤、脱色、脱臭等惯用的精制处理后使用。此外，可以根据需要通过冷冻干燥等进行浓缩或用任意的溶剂稀释后使用。进而，可以使溶剂全部挥发而制成固体状(干燥物)后使用，也可以将该干燥物再溶解于任意的溶剂后使用。
65.此外，在通过将原料植物进行压榨而获得的压榨液中也包含与提取物同样的有效成分，因此也可以代替提取物而使用压榨液。
66.本发明的apj表达促进剂可以由选自蕺菜提取物、樱叶提取物、和印楝叶提取物中的1种或多种生药组成，或可以包含选自蕺菜提取物、樱叶提取物、和印楝叶提取物中的1种或多种生药作为有效成分。此外，本发明的皮肤弹力改善剂含有本发明的apj表达促进剂。例如，本发明的皮肤弹力改善剂通过促进apj表达，表达被促进了的apj作用于血管而稳定化，从而可以在血管周围促进胶原合成，改善皮肤弹力。
67.所谓皮肤弹力的改善，是指使皮肤的状态为不过度软、且不过度硬的最佳状态。例如，考虑在过度软的情况下可能为水肿、浮肿那样的状态，在过硬的情况下可能为板结、疣、肿瘤这样的状态，因此虽然没有限定，但可以是以实施例所记载那样的人面颊的接触力的平均值即约17.5mn作为中心的接触力，例如约10.0mn～22.0mn、约12.0mn～20.0mn这样的范围的接触力；或与以这样的范围的接触力所对应的胶原浓度作为中心并且apj的表达量高的约0.5～1.00mg/ml、约0.6～0.9mg/ml的胶原凝胶浓度相对应的弹性模量，例如约5.0～30.0pa、约5.0～20.0pa这样的范围的储能弹性模量。此外，已知随着衰老，皮肤失去弹力而变软。因此，所谓皮肤弹力的改善，例如，可以是使其从由于衰老、水肿等而变低的弹力例如小于5.0mn、小于6.0mn、小于7.0mn、小于8.0mn、小于9.0mn、小于10.0mn、小于11.0mn、小于12.0mn、小于13.0mn、小于14.0mn、小于15.0mn、小于16.0mn、小于17.0mn这样的接触力上升；或者可以是使在约10.0mn～22.0mn、约12.0mn～20.0mn这样的适当值的范围内的现在的弹力在上述适当值的范围内进一步上升。上升例如可以是使接触力或储能弹性模量具有显著性水平为5％的统计学上的显著性差异(例如学生t检验)地上升，和/或，例如可以是10％以上、20％以上、30％以上、40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、100％以上的上升。或者，可以是将皮肤的接触力或储能弹性模量维持在上述适当值的范围内。
68.apj表达的促进例如可以是指如果添加本发明的apj表达促进剂，则与不添加的情况下相比，生物体试样中的apj的mrna量或蛋白质的量增加。增加例如可以是具有显著性水平为5％的统计学上的显著性差异(例如学生的t检验)的增加，和/或，例如可以是10％以上、20％以上、30％以上、40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、100％以上的增加。
69.本发明的apj表达促进剂和皮肤弹力改善剂(以下有时将它们总称为“本发明的制剂”)可以单独含有上述有效成分中的任1种，也可以以任意的组合和比率含有2种以上。
70.本发明的制剂也可以是将上述有效成分与1种或2种以上其它成分例如赋形剂、载体和/或稀释剂等组合而成的组合物。组合物的组成、形态是任意的，只要根据有效成分、用途等条件来适当选择即可。该组合物可以根据其剂型，以与赋形剂、载体和/或稀释剂等以及其它成分适当组合了的处方，使用常规方法来制造。
71.本发明的制剂经口或非经口(经皮施与、静脉施与、腹腔内施与等)地适当使用，可以以任意的途径施与，但优选以作用于皮肤的血管的方式经皮施与。
72.本发明的制剂可以混配于化妆品、药品、准药品等而使用于人和动物，也可以混配于各种饮食品、例如补充剂等营养辅助食品而使人和动物摄取，或也可以作为医药制剂而施与人和动物。
73.在将本发明应用于化妆品、药品、准药品等皮肤外用剂的情况下，上述提取物这样的有效成分的混配量(干燥质量)可以根据它们的种类、目的、形态、利用方法等来适当确
定。例如，在化妆料总量中，可以将蕺菜提取物、樱叶提取物、和印楝叶提取物分别混配约0.000001％～50.0％(干燥质量换算)，特别是可以以成为约0.0001％～10.0％(干燥质量换算)的方式添加。
74.除了上述成分以外，进一步根据需要，在不损害本发明的效果的范围内，可以根据需要适当混配通常化妆品、药品、准药品等等皮肤外用剂所使用的成分，例如抗氧化剂、油分、紫外线防御剂、表面活性剂、增稠剂、醇类、粉末成分、色料、水性成分、水、各种皮肤营养剂等。
75.进而，也可以适当混配乙二胺四乙酸二钠、乙二胺四乙酸三钠、柠檬酸钠、多聚磷酸钠、偏磷酸钠、葡糖酸等金属离子螯合剂、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丁酯等防腐剂、咖啡因、丹宁、维拉帕米、凝血酸及其衍生物、甘草提取物、光甘草定、木瓜果实的热水提取物、各种生药、生育酚乙酸酯、甘草酸及其衍生物或其盐等药剂、维生素c、抗坏血酸磷酸镁、抗坏血酸葡糖苷、熊果苷、曲酸等美白剂、葡萄糖、果糖、甘露糖、蔗糖、海藻糖等糖类等。
76.本发明的皮肤外用剂能够作为被应用于表皮的化妆料、准药品等、特别适合作为化妆料而应用，其剂型也只要可以应用于皮肤，就没有限定，可应用溶液系、增溶系、乳化系、粉末分散系、水
‑
油二层系、水
‑
油
‑
粉末三层系、软膏、化妆水、凝胶、气雾剂等任意的制剂型。
77.在使用本发明的制剂作为化妆品的情况下，例如，可以作为面霜、按摩霜、润体霜、乳液、洗剂(
ローション
)、美容液、凝胶、面膜、清洁霜、护手霜、化妆水(化粧水)、粉底、口红、唇膏、洗手粉、沐浴液、浴用化妆品等形态而使用。
78.在将本发明的制剂混配于饮食品等的情况下，植物体或其提取物的混配量(干燥质量)可以根据它们的种类、目的、形态、利用方法等来适当确定。例如，可以以成人每一天植物或其提取物的摄取量成为约0.00001mg～10.0g(干燥残余成分)、约0.001mg～5.0g(干燥残余成分)左右的方式混配。
79.作为饮食品、饲料的形态，可以为任意的形态，例如，可以为颗粒状、粒状、糊状、凝胶状、固体状、或液体状。在这些形态中，可以适当含有被批准含有于饮食品等的公知的各种物质，例如，粘结剂、崩解剂、增稠剂、分散剂、再吸收促进剂、矫味剂、缓冲剂、表面活性剂、助溶剂、保存剂、乳化剂、等渗剂、稳定剂、ph调制剂等赋形剂。
80.剂型也是任意的，例如片剂、颗粒剂、散剂、胶囊剂等经口用固体制剂、内服液剂、糖浆剂等经口用液体制剂、或注射剂等非经口用液体制剂等任一形态都可以通过公知的方法来适当调制。如果是外用制剂，则可以作为洗剂、悬浮剂/乳剂、液剂、软膏剂、贴附剂等各种形态而使用。在这些制剂中，可以适当使用通常使用的粘结剂、崩解剂、增稠剂、分散剂、再吸收促进剂、矫味剂、缓冲剂、表面活性剂、助溶剂、保存剂、乳化剂、等渗剂、稳定剂、ph调节剂等赋形剂。
81.然而，本发明的制剂的能够采用的形态不限定于上述形态。
82.此外，本发明涉及以生物体试样中的apj表达作为指标的皮肤弹力改善剂的筛选方法。本发明的筛选方法包括例如以下工序：用包含候选药剂的培养基将生物体试样进行培养；测定生物体试样中的apj表达；以及在apj表达与对照相比增加了的情况下，将候选药剂确定为具有皮肤弹力改善作用的物质。这里，对照是在用不包含候选药剂的培养基进行
培养方面不同的情况下的apj表达。关于对照的实验可以与本发明的筛选方法同时并行地进行，也可以预先进行。
83.作为在本发明的筛选方法中使用的生物体试样，是血管内皮细胞、脂肪细胞等任意的，只要能够测定apj表达，就没有限定。例如，既可以为如实施例所记载那样从人等动物的皮下脂肪组织诱导血管形成而制成的血管模型中的血管内皮细胞、周细胞这样的血管构成细胞，也可以为由生物体取得的血管内皮细胞、周细胞、或它们的传代细胞，也可以为株化细胞，也可以使用huvec、haec、hmvec等。或者，可以如专利文献3、专利文献4所记载那样，使用apj表达细胞。
84.此外，在用包含候选药剂的培养基将生物体试样进行培养的工序之前，可以包括将上述那样的生物体试样进行培养的预培养工序。在预培养工序中，可以从皮下脂肪组织诱导血管形成而制成血管模型。此外，在用包含候选药剂的培养基将生物体试样培养的工序之后，可以包括用不包含候选药剂的培养基进一步培养的后培养工序。用包含候选药剂的培养基将生物体试样进行培养的工序可以对预培养工序中获得的培养物直接添加候选药剂或其稀释液而进行培养，也可以置换成包含候选药剂的培养基而进行培养。
85.apj表达的测定可以通过测定生物体试样中的apj的mrna量或蛋白质的量来确定。作为mrna量的测定，可以使用定量pcr、rna印迹法等在本技术领域中已知的方法进行。例如，可以如实施例所记载地那样，使用针对apj mrna的探针。关于蛋白质的量，可以使用蛋白质印迹、免疫染色、facs等在本技术领域中已知的任意的方法进行测定。例如，可以使用与apj特异性地结合的抗体。或者，例如可以确立专利文献3、专利文献4所记载那样的使用了apj表达细胞的筛选系统而使用。此外，本发明也提供用于实施本发明的筛选方法的试剂盒，其包含用于确定apj表达的上述试剂。
86.通过本发明的筛选方法而筛选出的、具有apj表达促进剂作用的物质只要能够促进apj的表达，就可以为任意的物质。本发明的筛选方法的1方案是以血管内皮细胞等生物体试样中的apj表达作为指标，使用化妆品原材料、食品原材料、药品原材料等任意的库进行筛选。作为这样操作而确定的具有apj表达促进作用的物质，可举出选自蕺菜提取物、樱叶提取物、和印楝叶提取物中的1种或多种生药。
87.如以上说明的那样，发现了apj表达的促进改善皮肤弹力。因此本发明也涉及改善皮肤弹力的方法，其包括应用apj表达促进剂的步骤。如果皮肤弹力被改善，则可期待皱纹、松弛的改善。本说明书的改善皮肤弹力的方法涉及以美容作为目的的美容方法，区别于通过医生、医疗相关人员进行的治疗。这样的美容方法可以个人进行，也可以在美容室、化妆品的销售店、美容沙龙等进行。
88.在本说明书中提及的全部文献的整体通过引用而被合并到到本说明书中。
89.以下说明的本发明的实施例以仅例示为目的，不限定本发明的技术范围。本发明的技术范围仅受权利要求书的记载限定。以不超出本发明的宗旨作为条件，可以进行本发明的变更，例如，本发明的构成要件的追加、删除和置换。
90.实施例
91.实验1：3d血管形成真皮模型的制成和血管结构/产生胶原的可视化
92.使用胶原凝胶培养试剂盒(新田
ゼラチン
)制作了i型胶原凝胶溶液。具体而言，在冰上在15ml管内，相对于3mg/ml的cellmatrix胶原溶液2ml，用1mm稀盐酸2ml悬浮，在其中
一边搅拌一边加入进行了10倍浓缩的mem 500μl、和用于中和的胶原凝胶培养试剂盒附属的c buffer 500μl。在35mm玻璃基培养皿(iwaki)上载置本溶液100μl，在37度孵育30分钟，从而使其凝胶化。
93.将人正常皮下脂肪组织在含有10％fbs的pbs中切细为1mm见方，在凝胶化了的胶原凝胶上载置4片。然后，以覆盖组织片的方式添加在冰上制作的剩下的i型胶原凝胶溶液100μl，在37度孵育30分钟从而使其凝胶化。本组织片使用在加入了生长因子等添加因子的ebm
‑
2(cambrex；verviers，belgium)中进一步加入了最终浓度50ng/ml的vegfa的培养液，进行了7天～21天培养。此外，每隔2天～3天进行了培养基交换。在i型胶原的可视化、apj的表达局部存在分析中，本模型使用具有0.9mg/ml的浓度的胶原凝胶来制作。
94.在培养后，加入4％低聚甲醛溶液1ml在4度固定30分钟，实施了免疫染色。一抗针对血管内皮细胞使用了羊抗pecam
‑
1/cd31抗体(af806，r&d systems，mn)，针对周细胞使用了cy3αsma抗体(c
‑
6198，sigma，mo)，针对apj使用兔抗apj抗体，针对i型胶原使用了兔抗i型胶原抗体(ab34710，abcam，uk)，二抗使用了alexa fluor488驴抗羊抗体(a11015，molecular probes，eugene，or)和alexa fluor594驴抗兔抗体(r37119，molecular probes，eugene，or)。此外，核染色使用了hoechst33342(h3570，invitrogen，ca)。在染色后，使用共聚焦显微镜lsm880(carlzeiss，germany)检测3d的血管结构，进行了图像化。
95.图1显示用抗pecam
‑
1/cd31抗体染色了的3d血管形成真皮模型制成的情形。如在图1中所见那样，确认了血管内皮细胞形成内腔，形成了3d的血管结构。图2显示用抗pecam
‑
1/cd31抗体和抗i型胶原抗体染色了的血管形成模型。如在图2中所见那样，可知在血管周围合成胶原。特别是，在右图中如箭头所示那样，在血管周围看到胶原，特别是在被认为是血管要从这里伸长的支架的部分大量形成了胶原。因此，提示血管结构的存在有助于胶原合成、进而有助于皮肤弹力。
96.实验2：衰老中的血管的减少和周围的硬度降低
97.通过上述实验，当然显示出血管结构的存在有助于皮肤弹力，但已知在衰老皮肤中血管减少(非专利文献6)。因此，以抑制由衰老引起的血管的减少作为目的，着眼于血管结构如何被维持、与周围的硬度物性的相互作用而进行了分析。
98.使用从年轻人(10～20岁)和中老年人(50～70岁)的人受检者获得的眼睑皮肤，将存在于表皮下200um范围的毛细血管周围区域的硬度通过超声波声学扫描显微镜(医用超声波显微镜，ams
‑
50si，本田电子株式会社)进行了观察。具体而言，制作皮肤的冷冻切片，用超声波声学扫描显微镜通过以往的方法测定皮肤截面的声速，获得了声速分布图像(专利文献8)。进一步使用测定后的该切片，实施免疫染色，将血管结构可视化。一抗使用羊抗pecam
‑
1抗体(af806，r&d systems，mn)将血管内皮细胞染色，使用兔抗ng2抗体(milipore)将周细胞染色。二抗使用了alexa fluor 594驴抗羊抗体(a
‑
11016，molecular probes，eugene，or)、alexa fluor488驴抗兔抗体(a
‑
21206，molecular probes，eugene，or)。然后，使声速分布图像与免疫染色图像重叠，将血管周围50μm范围的声速值进行了定量化。在定量分析中，使用10个样本，对于每1组织将15处血管周围进行了定量化。
99.将结果示于图3中。通过图3可知在衰老皮肤中随着血管的减少，血管周围区域的声速值显著降低。即，提示衰老中的皮肤弹力的减少与血管的减少相关。
100.实验3：胶原凝胶的硬度测定
101.通过与实验1同样的方法，在冰上制作出具有各浓度(0.24、0.6、0.9、1.2、1.8mg/ml)的i型胶原凝胶溶液。然后，在24孔板内在37度使其凝胶化30分钟，制作出胶原凝胶。将制作的胶原凝胶使用physica mcr 300modular compact rheometer(anton paar，germany)测定储能弹性模量(pa)，规定了凝胶的硬度。
102.将结果示于图4中。由图4可知，胶原凝胶浓度与储能弹性模量处于对应关系。
103.实验4：胶原凝胶的硬度与皮肤的物性的关系
104.为了调查胶原凝胶的胶原浓度与实际的皮肤的物性的关系，通过与非专利文献7同样的方法使用皮肤柔软感传感器(非专利文献7)测定了具有各浓度(0.24、0.6、1.2、1.8mg/ml)的i型胶原凝胶的接触力。
105.将结果示于图5中。如图5所示那样，可知胶原浓度与接触力基本上处于比例关系直到约2.0mg/ml。此外，使用该装置确认了健康的人(20
‑
50几岁，n＝168)的面颊的皮肤的接触力的平均值为约17.5mn，因此以与17.5mn对应的胶原浓度为中心使浓度波动进行了以下实验。
106.实验5：响应胶原凝胶的硬度的血管结构变化的分析
107.通过与实验1同样的方法使胶原凝胶的浓度变化，从而制作出各浓度的i型胶原凝胶(0.24、0.9、1.8mg/ml)。这些各浓度的凝胶分别具有2.6
±
0.8、14.0
±
5.4、48.1
±
17.0(pa)的储能弹性模量。使用这些各浓度的凝胶，通过与实验1同样的方法，从人正常皮下脂肪组织诱导了3d的血管形成。在培养13天后，与实验1同样地实施免疫染色法，将血管内皮细胞和周细胞可视化。
108.将结果示于图6中。根据图6，在弹性模量为2.6
±
0.8pa的低浓度凝胶(0.24mg/ml)的情况下，形成了细且不稳定的血管，但在更高浓度(0.9mg/m)且具有高的弹性模量(14.0
±
5.4pa)的凝胶的情况下，形成了粗且稳定的血管。然而，在进一步高浓度(1.8mg/ml)且具有高的弹性模量(48.1
±
17.0pa)的凝胶的情况下，相反大量观察到细且不稳定的血管。由图6的结果可知，形成的血管的结构响应基质的弹性这样的周围环境的物性而变化。进一步，也提示了最适合将血管稳定化的周围环境的物性。与图3的结果一并考察也可以认为，虽然血管感知周围的硬度而稳定地维持其结构，但在衰老皮肤中由于周围的硬度降低，因此引起血管的不稳定化，血管向减少方向发展。
109.实验6：响应胶原凝胶的硬度的血管细胞表达因子(apj)的分析
110.通过与实验1同样的方法，在冰上制作出具有各浓度(0、0.12、0.6、0.9、1.2、1.8mg/ml)的i型胶原凝胶溶液。在12孔板中将以105个细胞/孔接种了的人脐带血静脉内皮细胞(huvec)进行培养至汇合后，添加各i型胶原凝胶溶液300μl/孔，在37度孵育从而使其凝胶化，进一步进行了培养。在培养6小时后，在各孔中添加trizol，进行了细胞破碎。从所得的溶液进行氯仿提取，从而获得了总rna。将所得的总rna通过nanodrop进行浓度测定，用无rnase水调整为35ng/ml。然后，使用taqman
tm
rna
‑
to
‑
c
ttm1‑
step kit(applied biosystems，ca)和针对人apj mrna的taqman探针(hs00270873，applied biosystems，ca)，将apj的mrna表达量进行了比较。
111.将结果示于图7中。左图为显示胶原凝胶浓度与apj的mrna表达量的关系的图。明确了在apj mrna表达量为0.9mg/ml的胶原凝胶条件下最能获得峰值，在低浓度、高浓度的胶原凝胶内确认到表达减少的情形。即，可知apj的表达响应基质的弹性这样的周围环境的
物性而变化。另外，这样的物性与表达的关系在tie2这样的其它血管稳定化因子中未见(未显示数据)，是apj特异性的。此外，在本实验中导出的胶原凝胶的弹性与对应于正常的人皮肤弹力的凝胶浓度基本上一致。因此，可以认为apj的表达根据基质的弹性而变化，有助于血管的稳定性，提示其弹性过低和过高都不好，具有适当的范围。图7右图为显示在0.9mg/ml的浓度的胶原凝胶中形成的血管模型中的apj的局部存在的显微镜照片。可知apj在从血管内皮细胞朝向周围而伸长的像线状伪足(filopodia)那样的细胞突起部位局部存在，提示apj可能直接感知周围的基质环境，将血管稳定化。
112.实验7：apj高表达3d血管形成真皮模型的制作和结构分析
113.将人apj基因序列插入到pegfp
‑
n1载体(clontech，ca)而获得了慢病毒导入用apj高表达载体。然后，以本载体为基础，制作出apj高表达慢病毒(
オリエンタル
酵母)。通过与实验1同样的方法制作出3d血管形成真皮模型。然后，将本模型在培养开始第21天进行由慢病毒感染引起的apj表达载体的转染，培养了5天。对照将除了不进行转染以外在相同条件下制作的血管模型进行了培养。在培养后，加入4％低聚甲醛溶液在4度固定30分钟，实施了免疫染色。一抗针对血管细胞使用了羊抗pecam
‑
1抗体(af806，r&d systems，mn)，二抗使用了alexa fluor 594驴抗羊抗体(a
‑
11016，molecular probes，eugene，or)。在染色后，使用共聚焦显微镜lsm880(carlzeiss，germany)检测3d的血管结构，进行了图像化。
114.将结果示于图8中。由图8显示出，如果使apj的表达增强则血管粗而稳定化，形成与现有报导(非专利文献5)一致的结果。
115.根据以上结果，考虑例如作为示意图而如图9所示那样，可能皮肤的弹性与apj的表达相互作用，apj作为皮肤的弹性的传感器起作用，从而具有将血管稳定化、在血管周围促进胶原合成、向皮肤弹力反馈这样的循环。因此，考虑即使是由于衰老等而弹力减少了的皮肤，也能够通过使apj表达增强而将循环强化从而改善皮肤弹力。因此，在以下实验中，进行了具有apj表达促进作用的物质的筛选。
116.实验8：具有促进apj表达的皮肤弹力改善作用的物质的筛选方法
117.使用包含被认为具有抗衰老作用的植物提取物在内的合计49种原料作为候选药剂进行了筛选。使用了香荣兴业社制的蕺菜提取物(蕺菜提取液et
‑
50)、一丸
ファルコス
社制的樱叶提取物(
ファルコレックス
樱叶b)、和一丸
ファルコス
社制的印楝叶提取物(印楝叶液b)。将这些提取物用二甲亚砜(dmso)溶解而以最终浓度0.1％(w/w)调制成试样。作为对照，使用了不包含这些提取物的dmso溶液。在12孔板中将以105个细胞/孔接种了的huvec进行了培养至汇合后，将上述试样以成为最终浓度0.1％的方式添加，在37度孵育而进行4小时培养，通过与实验6同样的方法，将apj的mrna表达量进行了比较。
118.将结果示于图10中。根据图10，在使用了蕺菜提取物、樱叶提取物、和印楝叶提取物作为候选药剂的情况下，apj的表达与对照相比显著增加了。选择这些提取物作为具有apj的表达促进作用的物质。