抗噬菌体微生物的制作方法

1.本发明提供了对噬菌体感染有抗性的转基因微生物。本发明还提供了一种制备抗噬菌体感染微生物的方法。


背景技术：

2.细菌培养物是生物技术产业的中心。一种工艺是否有利可图取决于适当的增长。因此，采用了许多严格的措施来保持对培养条件的控制。然而，这些培养物容易受到其它微生物的污染，或它们可能被大量称作噬菌体(bacteriophages或phages)的病毒感染。
3.在噬菌体感染期间，噬菌体在裂解周期中识别并攻击它们的宿主细胞，直到宿主被完全破坏，从而释放出数百个病毒颗粒，这些颗粒有可能攻击培养物中剩余的敏感细胞。在本发明之前，噬菌体感染的威胁是影响具有生物技术意义的细菌培养物的最严重的问题之一，从而导致生产过程中的重大损失。这就需要找到产生对噬菌体感染有抗性的增强菌株的方法。
4.us5240841a描述了一种产生对噬菌体qβ有抗性的大肠杆菌(e.coli)菌株的方法。该方法由分离相应病毒复制酶基因的特定区域组成。该区域编码病毒复制酶的肽部分，其功能是以特定序列结合病毒基因组进行复制。被分离后，该部分可以引入大肠杆菌基因组中。当表达为肽时，它与病毒复制酶竞争结合位点，阻止病毒的复制和传播，从而为宿主提供抗性。然而，为了将这种策略应用于所有感染大肠杆菌的噬菌体，必须为大肠杆菌菌株中的每个噬菌体生成肽，但这是不可行的。
5.hong j等人(hong，j.等人，“新测序的t5样噬菌体eps7的宿主受体和受体结合模块的鉴定(identification of host receptor and receptor-binding module of a newly sequenced t5-like phage eps7)”.《fems微生物学快报(fems microbiology letters)》，第289(2)卷，第202-209页，2008)证明，btub蛋白——一种大肠杆菌中参与维生素b12转运的跨膜转运蛋白，充当t5样噬菌体eps7的受体。通过对该btub蛋白的编码基因进行一系列突变，噬菌体感染被阻断，表明该受体在噬菌体的吸附过程中具有重要作用。
6.knirel,ya.等人(knirel,ya.等人，“与大肠杆菌4s中噬菌体敏感性改变相关的o抗原生物合成和o-乙酰化的变化(variations in o-antigen biosynthesis and o-acetylation associated with altered phage sensitivity in escherichia coli 4s)”.《细菌学杂志(journal of bacteriology)》，第197(5)卷，第905-912页，2015)描述了从马粪便物中分离的大肠杆菌4s菌株抗原o的合成和结构的变化。这些突变诱导对噬菌体g7c的抗性，并进一步改变大肠杆菌4s与其它不同噬菌体的相互作用，从而导致对宿主细胞的抗性和敏感性两者。
7.wo1997020917a2描述了一种称作abie的基因的用途，该基因编码中断噬菌体感染的蛋白。该基因以自然态存在于乳酸乳球菌(lactococcus lactis)菌株中。该基因被分离并克隆到质粒psrq800中。乳制品工业中使用的乳酸乳球菌或其它微生物的转化可给予对噬菌体936、c2和p335感染的抗性。
8.wo2001007566a2描述了一种能够赋予噬菌体感染抗性的遗传系统，其由质粒pcrb33和质粒pcrb63组成。在嗜热链球菌(streptococus thermophilus)菌株中转化后，该菌株获得对噬菌体感染的抗性。质粒对称作“s”亚基的1型甲基化限制系统的因子进行编码。两种质粒都具有这些不完整的遗传因子。由于“s”亚基序列的高度同源性，它们在细胞内重组产生第三质粒(pcrb96)。这种重组为“s”亚基产生了完整的orf，从而赋予对噬菌体的抗性。
9.ca2311598a1描述了赋予乳酸乳球菌和乳品工业中使用的其它菌株的噬菌体抗性所必需的方法和因子。该专利描述了使用由质粒psrq900编码的abi900蛋白。通过在目标菌株中被该质粒转化，提供了通过感染中断机制对噬菌体936、c2和p335的抗性。
10.denes等人(denes等人，《应用与环境微生物学(appl environ microbiol)》，81(13)，第4295-4305页(2015))分离了对噬菌体lp-048和噬菌体lp-125有抗性的单核细胞增生李斯特菌菌株。通过测序，他们在噬菌体lp-048和噬菌体lp-125吸附的两个关键位点中发现了突变。
11.适当的噬菌体分离对于证实具有抗噬菌体菌株是必要的。本领域已知的噬菌体分离方案的实例包括：(1)(麻省大学(uc-mass)，augusto.等人“cor基因的直系同源物参与温和λ噬菌体排除，cor使fhua受体功能失活的证据(an orthologue of the cor gene is involved in the exclusion of temperature lambdoid phages.evidence that cor inactivates fhua receptor functions.)”.《病毒学(virology)》，第329卷，第425-433页，2004)和(2)(kameyama,luis.等人，“野生λ噬菌体的表征：广泛分布的噬菌体免疫群的检测和nus依赖的非λ噬菌体群的鉴定(characterization of wild lambdoid bacteriophages:detection of a wide distribution of phageimmunity groups and identification of a nus-dependent,nonlambdoid phage group)”.《病毒学》，第263卷，第100-111页，1999)，或它们可以从微生物资源保藏中心中获取，诸如atcc等。
12.重要的是要注意，在本发明之前，尚未公开涉及tfad和yejo基因中的突变或缺失以赋予对感染大肠杆菌的不同类型的噬菌体的抗性。


技术实现要素：

13.本发明提供了一种产生对不同噬菌体感染有抗性的转基因微生物的方法。
14.本发明还提供了对不同噬菌体科感染有抗性的转基因微生物。
15.进一步地，本发明提供了在不同基因中具有点突变或缺失并且还赋予对各种噬菌体科的抗性的大肠杆菌菌株。
16.本发明提供了对长尾噬菌体(siphoviridae)科和肌尾噬菌体(myoviridae)科的噬菌体有抗性的大肠杆菌菌株。
17.本发明提供了对噬菌体λ、φ80和t4有抗性的大肠杆菌菌株。
18.此外，本发明提供了对噬菌体λ、φ80和t4有抗性并且相对于野生型菌株保留其动力学常数的大肠杆菌菌株。
19.上述目的突出了本发明的某些方面。本发明的其它目的、方面和实施例在本发明的以下详细描述均能找到。
附图说明
20.将容易获得对本发明及其许多附带优点的更完整的理解，因为通过参考以下附图，结合下面的详细描述，本发明将变得更好理解。
21.图1示出了在m9琼脂培养基中被噬菌体λ、φ80和t4感染的野生型大肠杆菌k-12和大肠杆菌lct-bf-01菌株之间的差异。观察到菌株lct-bf-01正常生长，而野生型菌株表现出指示细胞裂解的溶菌斑。
22.图2示出了大肠杆菌lct-bf-01和野生型大肠杆菌k-12菌株在液体m9培养基中被噬菌体λ、φ80和t4感染前后的生长差异。lct-bf-01菌株对噬菌体感染有抗性，而野生型k12菌株被裂解。野生型菌株(x)和lct-bf-01菌株(o)的生长动力学。箭头指示培养物被噬菌体混合物感染的点。
23.图3示出了野生型tfad蛋白(seq id no:2)和突变tfad蛋白(seq id no:4)的蛋白比对。
24.图4示出了野生型tfad基因(seq id no:1)和突变tfad基因(seq id no:3)的蛋白比对。
25.图5示出了野生型yejo蛋白(seq id no:6)和突变yejo蛋白(seq id no:8)的蛋白比对。
26.图6示出了野生型yejo基因(seq id no:5)和突变yejo基因(seq id no:7)的蛋白比对。
具体实施方式
27.除非特别定义，否则本文使用的所有技术和科学术语与酶学、生物化学、细胞生物学、分子生物学和医学科学领域的技术人员通常理解的含义相同。
28.尽管类似或等效于本文所述的方法和材料的方法和材料可以用于实践或测试本发明，但下文描述了合适的方法和材料。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献均通过引用整体并入本文。在冲突的情况下，将以本说明书(包含定义)为准。进一步地，所述材料、方法和实例仅是说明性的并且不旨在进行限制。
29.为了更好地理解本发明的目的，确立以下定义和缩写。
30.术语“基因(gene或genes)”是指由本领域已知的诸如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶等氮化合物或氮碱基构成的生物分子。基因是在细胞中传递信息以用于酶的生物合成的分子。
31.术语“基因座”是指基因在染色体上的固定位置。
32.术语“基因座(loci)”是指“基因座(locus)”的复数形式，即染色体上两个或多个基因的固定位置。
33.术语“底物”是指可用作微生物生长的碳源或用作所期望产物的分子。底物的实例可以是碳水化合物、脂质、蛋白、有机酸、醇、醛、酮、烃等。
34.术语“基因的缺失或去除”是指将基因全部或部分去除、修改阅读框或在该基因的天然终止密码子以外的任何区域添加终止密码子的过程；它还指添加或去除阻止基因转录和/或减少的区域。
35.术语“噬菌斑形成单位”是指被噬菌体感染的细胞或从培养物中感染细胞的噬菌
体的数量。
36.术语“噬菌体(phages或bacteriophage)是指能够感染细菌并且可以在感染周期中引起细菌细胞破裂的病毒。这些噬菌体的实例可以是m13、t4、λ或现有技术中描述的任何其它病毒，其通过溶菌性循环或溶原化循环引起细菌感染。噬菌体的溶菌性循环和溶原化循环是与本发明领域相关的任何人所广泛周知。
37.术语“生物质”是指构成培养物并且对应于单一类型微生物的有机物质的总量，在这种情况下，生产菌株及其指数增长是由发酵过程产生的。生物量通过600nm处的光密度和以g/l表示的热天平中的干重进行分光光度测定。
38.术语“接种物”指与启动发酵过程的目标菌株相对应的初始生物量部分。
39.术语“发酵”是指以氧气为最终电子受体使碳源的氧化完全或不完全的分解代谢，其中产生同时充当电子供体和电子受体的有机化合物，并且其中atp由底物水平的磷酸化产生。
40.术语“培养基”是指含有允许目标菌株生长所必需的营养物质的溶液。现有技术中已知的培养基是m9、lb 2yt和现有技术中报道的可用于目标菌株生长的任何其它培养基。
41.术语“厌氧条件”是指在发酵期间氧气被送入反应罐作为最终的电子受体，并且碳源的氧化完全。
42.术语“表达”是指在发酵期间某些条件下转录的基因或基因组。
43.术语“野生型菌株”是指保留其物种原始遗传物质的生物体，即其遗传信息未经过修改。
44.术语“μ”是指目标菌株的特定生长速率，以h-1
表示，其取决于培养基中营养物质的浓度和操作参数，诸如搅拌和通气。
45.术语“qs”是指特定底物的消耗量，以(g/g*h)表示，即生物质单位在一定时期内消耗的底物质量。
46.术语“减毒噬菌体(attenuated phage或bacteriophage)”是指其基因组能够与其宿主的基因组一起复制并且在称为溶原性的状态下不会导致细胞死亡的病毒。
47.术语“反应器”是指由合适的材料建造的物理空间，其中可以以受控方式发生化学、生化或生物反应或其组合。在现有技术中可以找到不同类型的反应器。例如，描述了诸如连续搅拌釜反应器(cstr)、活塞流反应器、流化床反应器和填充床反应器(pbr)等反应器。反应器的一些特征是：a)它们对由于正在发生的反应引起的腐蚀的抗性；b)它们监测和控制诸如温度、搅拌、ph、溶解气体浓度、压力等操作变量的能力；c)可以是连续的、半连续的或间歇的(现有技术中描述了反应器可以工作的不同操作模式)操作模式；d)使用将进行反应的不同类型催化剂的能力，例如，催化剂可以被溶解或捕获或固定(现有技术中描述了催化剂可在反应器内进行反应的不同模式)。本发明提供了一种方法，该方法让对噬菌体感染敏感的微生物由于遗传变化而获得对噬菌体感染的抗性。
48.更具体地，本发明提供了一种方法，该方法让对噬菌体感染敏感的微生物同时对一种或多种噬菌体的感染有抗性。
49.进一步地，本发明提供了一种方法，该方法让对噬菌体感染敏感的微生物同时对来自同一科的一种或多种噬菌体感染有抗性。
50.进一步地，本发明提供了一种方法，该方法让对噬菌体感染敏感的微生物同时对
来自不同科的一种或多种噬菌体感染有抗性。
51.此外，本发明提供了微生物，这些微生物能够抵抗由于某些基因突变引起的一种或多种类型的噬菌体感染。
52.进一步地，本发明提供了微生物，这些微生物能够抵抗由于遗传变化引起的一种或多种噬菌体科感染。
53.最后，本发明提供了微生物，这些微生物能够抵抗一种或多种噬菌体科感染并且还保留相同动力学常数。
54.在本发明的另一个实施例中，提供了一种产生对噬菌体λ感染有抗性的微生物的方法，其中噬菌体λ在一定时间内与微生物接触以进行感染。随后，让培养物在一定时间内恢复。能够在感染后存活的细菌被分离出来，并进行如下生化、微生物学和遗传表征：
55.i.在含有m9培养基的烧瓶中，让微生物生长到光密度达到0.6至5，更具体地为1至3，更具体地为2至2.5。
56.ii.将噬菌体λ添加到培养基中，其中噬菌体的浓度为至少100个噬菌斑形成单位，更具体地为至少250个噬菌斑形成单位，更具体地为至少500个噬菌斑形成单位。
57.iii.让噬菌体感染在室温下，更优选地在20℃至25℃的温度范围内，进行30分钟至6小时，更具体地为2小时至4小时，更具体地为2.5小时至3.5小时。
58.iv.让培养物在37℃下，更优选地在35℃至39℃的温度范围内，裂解1小时至8小时，更具体地为3小时至6小时，更具体地为4小时至5小时。
59.v.让培养物恢复1小时至24小时，更具体地为6小时至20小时，更具体地为10小时至16小时。恢复可以在室温下进行，更优选地在20℃至25℃的温度范围内进行。
60.vi.用m9培养基或其它适合细胞生长的培养基将菌落分离到平板中。
61.vii.通过重复步骤i至步骤vi至少两次，证实菌落对噬菌体λ有抗性。
62.在本发明的另一个实施例中，提供了一种产生对噬菌体φ80感染有抗性的微生物的方法，其中噬菌体φ80在一定时间内与微生物接触以进行感染。随后，让培养物在一定时间内恢复。能够在感染后存活的细菌被分离出来，并进行如下生化、微生物学和遗传表征：
63.i.在含有m9培养基的烧瓶中，让微生物生长到光密度达到0.6至5，更具体地为1至3，更具体地为2至2.5。
64.ii.将噬菌体φ80添加到培养基中，其中噬菌体的浓度为至少100个噬菌斑形成单位，更具体地为至少250个噬菌斑形成单位，更具体地为至少500个噬菌斑形成单位。
65.iii.让噬菌体感染在室温下，更优选地在20℃至25℃的温度范围内，进行30分钟至6小时，更具体地为2小时至4小时，更具体地为2.5小时至3.5小时。
66.iv.使培养物在37℃下，更优选地在35℃至39℃的温度范围内，裂解1小时至8小时，更具体地为3小时至6小时，更具体地为4小时至5小时。
67.v.让培养物恢复1小时至24小时，更具体地为6小时至20小时，更具体地为10小时至16小时。恢复可以在室温下进行，更优选地在20℃至25℃的温度范围内进行。
68.vi.用m9培养基或其它适合细胞生长的培养基将菌落分离到平板中。
69.vii.通过重复步骤i至步骤vi至少两次，证实菌落对噬菌体φ80有抗性。
70.在本发明的另一个实施例中，提供了一种产生对噬菌体t4感染有抗性的微生物的方法，其中噬菌体t4在一定时间内与微生物接触以进行感染。随后，让培养物在一定时间内
恢复。能够在感染后存活的细菌被分离出来，并进行如下生化、微生物学和遗传表征：
71.i.在含有m9培养基的烧瓶中，让微生物生长到光密度达到0.6至5，更具体地为1至3，更具体地为2至2.5。
72.ii.将噬菌体t4添加到培养基中，其中噬菌体的浓度为至少100个噬菌斑形成单位，更具体地为至少250个噬菌斑形成单位，更具体地为至少500个噬菌斑形成单位。
73.iii.让噬菌体感染在室温下，更优选地在20℃至25℃的温度范围内，进行30分钟至6小时，更具体地为2小时至4小时，更具体地为2.5小时至3.5小时。
74.iv.让培养物在37℃下，更优选地在35℃至39℃的温度范围内，裂解1小时至8小时，更具体地为3小时至6小时，更具体地为4小时至5小时。
75.v.让培养物恢复1小时至24小时，更具体地为6小时至20小时，更具体地为10小时至16小时。恢复可以在室温下进行，更优选地在20℃至25℃的温度范围内进行。
76.vi.用m9培养基或其它适合细胞生长的培养基将菌落分离到平板中。
77.vii.通过重复步骤i至步骤vi至少两次，证实菌落对噬菌体t4有抗性。
78.在本发明的另一个实施例中，提供了一种从大肠杆菌属中产生在tfad和yejo基因中具有突变并且还对噬菌体感染有抗性的细菌的方法，其中噬菌体在一定时间内与微生物接触以进行感染。随后，让培养物在一定时间内恢复。能够在感染后存活的细菌被分离出来，并进行如下生化、微生物学和遗传表征：
79.i.对于大肠杆菌菌株，使tfad和yejo基因发生突变。
80.ii.在含有m9培养基的烧瓶中，使大肠杆菌菌株与tfad和yejo突变一起生长，直到光密度达到0.6至5，更具体地为1至3，更具体地为2至2.5。
81.iii.噬菌体λ、φ80和t4单独或混合添加到培养基中，其中噬菌体的浓度为至少100个噬菌斑形成单位，更具体地为至少250个噬菌斑形成单位，更具体地为至少500个噬菌斑形成单位。
82.iv.让噬菌体感染在室温下，更优选地在20℃至25℃的温度范围内，进行30分钟至6小时，更具体地为2小时至4小时，更具体地为2.5小时至3.5小时。
83.v.让培养物在37℃下，更优选地在35℃至39℃的温度范围内，裂解1小时至8小时，更具体地为3小时至6小时，更具体地为4小时至5小时。
84.vi.让培养物恢复1小时至24小时，更具体地为6小时至20小时，更具体地为10小时至16小时。恢复可以在室温下进行，更优选地在20℃至25℃的温度范围内进行。
85.vii.用m9培养基或其它适合细胞生长的培养基将菌落分离到平板中。
86.viii.通过重复步骤i至步骤vii至少两次，证实单独或混合的菌落对噬菌体λ、φ80和t4有抗性。
87.本发明的上述书面描述提供了一种制造和使用本发明的方式和过程，使得本领域的任何技术人员都能够制造和使用本发明，该许可尤其针对构成原始描述一部分的所附权利要求的主题提供。
88.如本文所用，短语“选自由
……
组成的组”、“挑选自”等包括指定材料的混合物。
89.在本文中说明数值限制或范围的情况下，包括端点。此外，数值限制或范围内的所有值和子范围都被特别包括在内，就像明确写出一样。
90.前述说明旨在使本领域的任何技术人员能够制作和使用本公开，并且在特别应用
及其要求的上下文中提供。对优选实施例的各种修改对于本领域技术人员来说将是显而易见的，并且本文中定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神和范围的情况下应用于其它实施例和应用。因此，本公开不旨在局限于所示的实施例，而是被赋予与本文公开的原理和特征一致的最宽范围。
91.实例
92.以下实例旨在阐明本发明的新颖性。应当理解，以下实例并不限制本发明的范围。根据本发明的公开内容以及以下实例，本发明领域的技术人员可以做出一些修改，这些修改无论如何都在本发明保护的框架内。
93.实例1.对噬菌体λ、φ80和t4有抗性的菌株的产生。
94.就本发明而言，分离了感染不同微生物的不同环境噬菌体，但为了举例说明本发明的方法，使用了大肠杆菌。
95.使用不同的培养基使细菌与噬菌体接触。一些培养基是lb琼脂培养基和m9琼脂培养基(sambrook,j.,和green,m.(2012).《分子克隆：实验室手册(molecular cloning:a laboratory manual)》，第四版本.纽约冷泉港的冷泉港实验室)。
96.制备野生型大肠杆菌k-12在液体m9培养基中的培养物，使其生长6小时至24小时，然后添加噬菌体λ、φ80和t4的混合物。在室温下让感染循环30分钟至6小时。此后，将培养物在30℃下培养1小时至8小时使培养物澄清，此时大部分细胞已死亡。随后，继续培养以允许抗噬菌体细胞的繁殖。经过1小时至24小时，观察到培养物再次开始生长，并将其作为接种物以分离出抗性菌落。
97.通过延伸将平板接种在m9琼脂中。在37℃下培养16小时后，观察到抗噬菌体菌落并选择再次感染。
98.所选择的候选菌落通过稀释倒平板法对抗噬菌体。首先，让培养物在来自目标菌株的液体中生长6小时，随后，其用噬菌体感染，使感染循环在室温下发生1小时。此后，将所感染的细胞在软m9琼脂培养基中混合，并在37℃下培养16小时。在这个培养期结束时，观察到抗性菌株没有表现出溶菌斑，而敏感菌株有(图1)。
99.所分离的菌落至少经历5次感染和分离循环。在感染和分离循环之后，对菌株进行生化、微生物学和基因检查，以证实最初进行的基因转变是产生抗性的原因。抵抗被检测噬菌体感染的菌株被命名为lct-bf-01。
100.为了证明lct-bf-01菌株对噬菌体λ、φ80和t4有抗性并在液体培养基中生长，使用m9培养基在不同的操作条件下制备14l反应器中的培养物。操作条件如表1所示。
101.表1：反应器的操作条件
102.条件值ph6.8-8温度20℃-40℃溶解氧0.1-8mg/l
103.准备反应器，在121℃和15psig的压力下灭菌，在灭菌条件下用来自lct-bf-01菌株的菌落接种，并让其生长6小时。随后，它被噬菌体λ、φ80和t4的混合物感染，并在反应器中进一步监测其生长、ph、温度和氧气。生长16小时后，观察到培养物在发酵期间任何时候都没有澄清(图2)。用野生型大肠杆菌k-12菌株进行相同的实验，该菌株在感染后没有表现
出生长(图2)。通过该实例，证明菌株lct-bf-01对噬菌体λ、φ80和t4有抗性。
104.随后，使用细菌测序试剂盒并按照制造商的说明(依诺米那股份有限公司(illumina inc.)在illumina miniseq系统测序仪中对菌株lct-bf-01进行测序，以证实所生成的突变。在表2中，示出了在相应感染过程中发生突变的基因。
105.表2：不同大肠杆菌基因中鉴定出的突变
106.基因蛋白突变的位置经改变的氨基酸tfad69a-》tyejo23w-》r
107.tfad野生型基因示为seq id no:1，野生型tfad蛋白示为seq id no:2。突变tfad基因示为seq id no:3，相应的突变tfad蛋白示为seq id no:4。
108.yejo野生型基因示为seq id no:5，野生型yejo蛋白示为seq id no:6。突变yejo基因示为seq id no:7，相应的突变yejo蛋白示为seq id no:8。
109.实例2.菌株lct-bf-01和野生型大肠杆菌k-12菌株的动力学参数比较
110.菌株lct-bf-01和野生型大肠杆菌k-12在14l反应器中的m9培养基中培养，以确定有氧条件下的动力学参数。培养需要24小时，操作条件如表3所示。
111.表3：反应器的操作条件
112.条件值ph7温度37℃溶解氧2mg/l
113.在发酵期间中，使用带折射率检测器的hplc ultimate 3000设备(thermo)并使用使用rezex-roa有机酸h
+
柱监测葡萄糖和有机酸的浓度。发酵结果如表4所示。
114.表4：菌株lct-bf-01和野生型的动力学常数
115.变量菌株lct-bf-01野生型(wt)μ0.440.45qs0.880.89
116.这些结果表明，尽管具有tfad和yejo基因的突变，本发明开发的菌株对来自不同科的噬菌体有抗性并具有与wt相同的动力学常数。
117.鉴于上述教导，本发明的许多修改和变化是可能的。因此，应当理解，在所附权利要求的范围内，本发明可以以不同于本文具体描述的方式实施。
118.参考文献
[0119]-denes，t.等人，2015.《应用与环境微生物学》,81(13)，第4295-4305页。
[0120]-hong,j.等人“新测序的t5样噬菌体eps7的宿主受体和受体结合模块的鉴定”.《fems微生物学快报》，第289(2)卷，第202-209页，2008。
[0121]-kameyama，luis.等人“野生λ噬菌体的表征：广泛分布的噬菌体免疫群的检测和nus依赖的非λ噬菌体群的鉴定”.《病毒学》，第263卷，第100-111页，1999。
[0122]-knirel,ya.等人“与大肠杆菌4s中噬菌体敏感性改变相关的o抗原生物合成和o-乙酰化的变化”.《细菌学杂志》，第197(5)卷.第905-912页，2015。
[0123]-sambrook,j.,and green,m.(2012).《分子克隆：实验室手册》，第四版本.纽约冷泉港的冷泉港实验室。
[0124]-麻省大学，augusto.等人“cor基因的直系同源物参与温和λ噬菌体排除，cor使fhua受体功能失活的证据”.《病毒学》，第329卷，第425-433页，2004。
[0125]-wang,x.,kim,y.,ma,q.,hong,s.h.,pokusaeva,k.,sturino,j.m.和wood,t.k.(2010).“神秘的噬菌体帮助细菌应对不利环境(cryptic prophages help bacteria cope with adverse environments)”.《自然通讯(nature communications)》，1,147)。
[0126]-专利：ca2311598a1
[0127]-专利：ep2534252b1
[0128]-专利：wo1997020917a2
[0129]-专利：wo2001007566a2