连续多层次地从文冠果鲜果壳中提取氨基酸、黄酮、皂苷、色素中至少两种成分的方法与流程

本发明涉及农林固体废物资源化利用和农业生态环境技术领域。

名词界定

(1)鲜果壳：文冠果成熟后，果壳颜色变成棕褐色之前为黄绿色，为了有别于干果壳，故称为新鲜果壳，简称鲜果壳。

(2)主要有效成分：所谓有效成分是指对人体有益或可作为医药、食品、工业原料的化合物成分，主要有效成分是指文冠果鲜果壳中含量相对较多的成分，包括色素、皂苷、黄酮、游离氨基酸，可溶性糖微量，无提取价值，列入其他成分中。

(3)高剪切设备：是指高速剪切(例如速度可达25000r/min)的设备，该设备是国家“十五”863纳米生物技术专项课题“纳米肥料关键技术(2001aa218041)”研制的设备。该设备主要由以下部件组成：

1)电机：江苏星轮高速电机设备制造公司生产。

2)刀轴与高剪切刀：采用高铬高镍奥氏体不锈钢材料加工制造，剪切刀为锯齿状，刀轴通过三爪夹头与电机输出轴连接。

3)不锈钢罐体：直径500mm，高700mm。

4)导流筒：内衬于罐体中部起到导流作用，使物料呈湍流状态循环高剪切，筒体直径200mm，高350mm。

5)封盖：不锈钢封盖周边及轴接触部分均黏有密封圈，起到密闭的作用。

6)进出料口：进料口位于罐体上部，出料口位于罐体下部。

详见张夫道等：纳米-亚微米级酸化磷矿粉混合物生产方法(zl200410101498.7)。

背景技术：

文冠果(xanthocerassorbifoliabunge)系无患子科文冠果属的木本油料植物，是我国特有种，亦称之为文官果、文灯果等。文冠果适应性强，耐寒耐旱耐瘠薄，可在我国辽宁至新疆的北方荒山丘陵和内陆盐碱地地带广泛种植。开发文冠果资源既可以绿化荒山防风固沙又可以创造经济价值。

目前，文冠果的主要用途是用于通过传统压榨法和浸提法制取植物油。但文冠果果壳占文冠果总质量的50％-55％，如果仅仅用于制备植物油，文冠果果壳则成为生物垃圾，污染环境。文冠果果壳中含有丰富的有益成分，例如氨基酸、皂苷、黄酮等主要有效成分，具有极高的利用价值。目前已经有一些科研单位和院校对文冠果果壳中的皂苷和黄酮类化合物等有效成分进行提取。

但是现有的文冠果果壳的利用通常仅仅提取单一的或两个有益成分后，仍然会产生很多的生物垃圾，对环境造成不利影响。例如cn108704030a涉及皂苷的提取工艺，其主要涉及如下的步骤：通过乙醇萃取破碎的文冠果果壳后浓缩，然后依次用石油醚+乙酸乙酯+正丁醇萃取，其中乙酸乙酯萃取液用树脂富集；cn102813214a涉及皂苷提取工艺，其包括脱脂后用乙醇和甲醇溶液萃取，浓缩，然后柱层析；cn104473157a涉及黄酮的提取工艺，其涉及使用干燥后的文冠果果壳，用石油醚脱脂后，滤渣用乙醇萃取，然后用大孔树脂富集，得到的黄酮纯度约60％。

上述专利共同特点是：其一，所选择的原材料均为干燥的文冠果果壳，而氨基酸、皂苷、黄酮等有效成分均分布于细胞液中，果壳干燥后，这些有效成分将随着细胞液的消失转化为其他化合物，或者消失。例如皂苷和黄酮类化合物，在果壳干燥前总含量为25％左右，果壳干燥后仅剩下5％-7％。其二，研究者们仅提取文冠果果壳中的一种或二种化合物成分，剩下90％以上的果壳残渣未被利用，作为固体废物丢弃，不仅会造成原料资源的极大浪费，也会给环境带来巨大的压力。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明致力于提供一种从文冠果果壳中提取游离氨基酸、黄酮、皂苷、色素中的两种或更多种成分的方法，统筹了氨基酸、黄酮、皂苷、色素各成分的提取流程顺序，且兼顾了各成分提取工艺之间的匹配性和兼容性，提高了文冠果鲜果壳综合利用率。

文冠果成熟后，果壳颜色变成棕褐色之前为黄绿色，为了有别于干果壳，故称为新鲜果壳，简称鲜果壳。文冠果成熟果实从含水量12％-15％的鲜果壳至含水量5％-8％棕褐色的干果壳大约为15-20天，在此期间收集文冠果，得到鲜果壳，出于时间和经济成本考虑，剥壳可采用剥壳机处理。

本发明提供了一种从文冠果鲜果壳中提取游离氨基酸、黄酮、皂苷、色素中的两种或多种成分的方法，包括以下步骤：

(a)鲜果壳预处理：鲜果壳与第一溶剂共混后破碎，固液分离后得到第一滤液，任选地，将所述第一滤液浓缩得到第一浓缩液；

(b)提取游离氨基酸：步骤(a)得到的第一滤液(优选第一浓缩液)用第一树脂富集游离氨基酸后，第一树脂先经洗涤得到第二洗涤液，再被洗脱得到第一洗脱液，第一洗脱液干燥后得到氨基酸；

(c)提取黄酮：步骤(b)得到的第二洗涤液浓缩得到第二浓缩液，用第二溶剂萃取，固液分离后得到第二滤液和第二滤渣，第二滤液干燥后得到黄酮；

(d)任选地，提取皂苷：步骤(c)得到的第二滤渣用第三溶剂萃取，固液分离后得到第三滤液和第三滤渣，第三滤液用第二树脂富集皂苷化合物，再经洗脱和干燥后得到皂苷；

(e)进一步任选地，提取色素：步骤(d)得到的第三滤渣用第四溶剂溶解后，用第三树脂富集色素，再经洗脱和干燥后得到色素；优选地，所述步骤(e)中，第四溶剂为水(优选为去离子水)，进一步优选地，第三滤渣与水(例如去离子水)的质量比为1:5-10，再进一步优选地，第三树脂选用ab-8大孔径树脂，进一步优选ab-8大孔径树脂的树脂柱内直径与高度比为1:6-8；最优选地，所述步骤(e)包括以下步骤：(i)第三滤渣与去离子水混合(例如在60-80℃下搅拌溶解1h)，用ab-8大孔径树脂柱吸附富集色素；(ii)用乙醇【色素质量5-6倍的50％(v/v)乙醇】洗脱ab-8大孔径树脂柱，得到第三洗脱液；和(iii)第三洗脱液减压浓缩(例如在80℃下)回收乙醇，干燥(例如真空干燥)后得到色素。

需要说明的是，文中“第一溶剂”、“第二溶剂”、“第三溶剂”等中的第一、第二、第三等标记仅是为了区分每个处理步骤中使用的溶剂，对于溶剂的具体种类没有实质限定，其中顺序不同的溶剂的种类可以相同，也可以不同。其它的关于滤液、滤渣、洗涤液、洗脱液、混合液、浓缩液、干涸物等的标记限定也是相同的意义。

步骤(a)鲜果壳预处理

将鲜果壳与第一溶剂共混后破碎，使鲜果壳中所有细胞壁均被打破，游离氨基酸、黄酮、皂苷、色素等均溶于第一溶剂中，再经固液分离获得第一滤液，对第一滤液进行浓缩以进行后续的加工提取有效成分。

此处，第一溶剂为浸提游离氨基酸、黄酮、皂苷、色素等有效成分的共用溶剂，对第一溶剂的具体种类不作具体限定，能够满足溶解上述有效成分即可。

进一步，第一溶剂优选为c1-c4低碳醇，其中包括甲醇、乙醇、丙醇或正丁醇。

进一步，第一溶剂优选为乙醇。优选使用最为广泛的有机溶剂乙醇作为第一溶剂，不仅溶解游离氨基酸、黄酮、皂苷、色素等有效成分的效果好，而且乙醇价格低廉，环境污染程度小。

进一步，果壳(干基计，下同)与乙醇的质量比为1:8-12。果壳与乙醇的质量比典型但非限定性的为1:8、1:9、1:10、1:11或1:12。

进一步，第一浓缩液的固形物含量为0.5-2.0wt％。

第一浓缩液的固形物含量可以为但不限于0.5wt％、0.8wt％、1wt％、1.2wt％、1.5wt％、1.8wt％或2.0wt％。

在本发明的一种实施方式中，步骤(a)包括以下步骤：

(i)鲜果壳与70-75％(v/v)乙醇共混后，剪切破碎，其中剪切速度为18000r/min以上(优选为18000-25000r/min)，优选剪切破碎时环境温度是20-30℃，且进一步优选地，剪切时间为3-5min；和/或

(ii)剪切完成后，真空抽滤得到第一滤液和第一滤渣，第一滤渣用乙醇【优选50-55％(v/v)乙醇】和去离子水分别洗涤(例如2-3次)，合并得到第一洗涤液，合并第一滤液和第一洗涤液，得到第一混合液；和/或

(iii)减压浓缩第一混合液(优选在70-80℃下)回收乙醇，浓缩至固形物含量为0.5-2.0wt％，得到第一浓缩液。

上述鲜果壳预处理限定的具体工艺和工艺条件，通过剪切破碎果壳，使果壳中的有效成分溶解于乙醇中；用乙醇洗涤第一滤渣避免引入其他有机杂质，还可以收集第一洗涤液继续利用，减少有效成分的流失；对于使用的乙醇进行了回收以循环利用，减少资源浪费和环境污染。上述工艺操作简单、处理果壳的效率高、安全环保。

步骤(b)提取游离氨基酸

将第一浓缩液用树脂富集游离氨基酸，经过洗涤去除第一树脂吸附的杂质和其它有效成分，再进行洗脱使游离氨基酸溶解于第一洗脱液中，提高游离氨基酸的纯度。

进一步，第一树脂优选强酸型阳离子交换树脂，优选732强酸型阳离子交换树脂。

进一步，所述强酸型阳离子交换树脂的树脂柱内直径与高度比为1:6-8，优选第一树脂的直径和高度比，可以提高树脂的富集效果。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(b)包括以下步骤：

(i)步骤(a)得到的第一浓缩液通过强酸型阳离子交换树脂柱富集游离氨基酸，用乙醇【优选50％-60％(v/v)的乙醇】和去离子水分别洗涤(例如2-3次)，合并得到第二洗涤液；

(ii)用nh4oh溶液(如2mol/l)洗脱强酸型阳离子交换树脂，得到第一洗脱液；

(iii)第一洗脱液在70-80℃减压蒸发至干涸，得到第一干涸物，回收nh3和h2o；再用nh4oh溶液(优选2mol/l)溶解第一干涸物，70-80℃下真空干燥，反复溶解和干燥(例如3次)，得到纯度99％以上氨基酸。

步骤(c)提取黄酮

文冠果的鲜果壳中含有大量的黄酮类化合物，包括黄烷醇、黄酮醇、二氢黄酮醇等。

进一步，所述第二溶剂为氯仿、乙酸乙酯或正己烷中的一种或多种的组合，优选为氯仿。优选氯仿萃取第二浓缩液中的黄酮类有效成分，提高萃取率，进而增加黄酮提取量。

进一步，第二浓缩液的固形物含量为85-95wt％。第二浓缩液的固形物含量可以为但不限于85wt％、88wt％、90wt％、92wt％、94wt％或95wt％。

进一步，第二浓缩液与氯仿的质量比为1:2-2.5。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(c)包括以下步骤：

(i)第二洗涤液浓缩得第二浓缩液，第二浓缩液和氯仿混合，搅拌条件下萃取(例如萃取1-1.5h)，过滤(例如真空过滤，过滤次数为3-4次)后得到第二滤液和第二滤渣，第二滤渣用氯仿洗涤(例如2-3次)后得到第三洗涤液，合并第二滤液和第三洗涤液，得到第二混合液；

(ii)蒸发(例如在65-70℃下)第二混合液回收氯仿，且真空干燥至干涸，得到第二干涸物；

(iii)用乙醇【例如70％(v/v)的乙醇】溶解第二干涸物后过滤(如真空过滤)，再经减压回收乙醇(例如在70-80℃下减压)，任选地进一步经过冷冻干燥(-40℃)，得到黄酮，纯度85％以上。

第二干涸物与70％(v/v)乙醇的质量比为1:3-5。

进一步，在本发明提供的技术方案的基础上，减压回收乙醇和冷冻干燥之间还包括溶液脱色的步骤。优选采用活性白土脱色。

步骤(d)提取皂苷

文冠果的皂苷的分子量较大，极性大，不易结晶而且易吸潮，在乙酸乙酯、乙醇、正丁醇中都有较好的溶解度，具有多数皂苷具有的性质。皂苷的提取所用的原料来自于提取完氨基酸和黄酮后剩余的第二滤渣。

进一步，所述第三溶剂为乙酸乙酯、乙醇、正丁醇中的一种或多种的组合，优选乙酸乙酯。

进一步，第二滤渣与乙酸乙酯的质量比为1:4-6；第二滤渣与乙酸乙酯的质量比典型但非限定性的为1:4、1:4.5、1:4.8、1:5、1:5.5、1:5.8或1:6。优选该质量比，使第二滤渣中包含的皂苷类化合物更好地溶解于乙酸乙酯中，提高萃取后的第三滤液中皂苷的含量，减少皂苷的损失。

进一步，第二树脂采用大孔径树脂，优选为d101聚苯乙烯型大孔径树脂。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(d)包括以下步骤：

(i)第二滤渣与乙酸乙酯混合，搅拌条件下萃取1h，真空抽滤得到第三滤液和第三滤渣，第三滤渣用乙酸乙酯洗涤(例如洗涤2-3次)后得到第四洗涤液，合并第三滤液和第四洗涤液，得到第三混合液；

(ii)第三混合液用d101聚苯乙烯型大孔径树脂柱富集皂苷化合物，用乙醇洗脱【例如用皂苷质量5-6倍的50％(v/v)乙醇】，任选地重复洗脱3-4次，合并洗脱液得到第二洗脱液；

(iii)从第二洗脱液中回收乙酸乙酯(例如在80℃下回收)，然后抽真空回收乙醇(例如在75℃以下)，干燥后得到皂苷，优选地，所述干燥是通过脱水至含水量30-40％后、在-40℃冷冻干燥完成。

进一步，在本发明提供的技术方案的基础上，所述步骤(iii)中停止脱水和冷冻干燥之间还包括溶液脱色的步骤。优选采用活性白土脱色，且优选脱色温度小于40℃。

步骤(e)提取色素

鲜果壳呈黄绿色，提取完氨基酸、黄酮和皂苷的第三滤渣中富含色素，第三滤渣用来提取色素，为天然色素提供新的来源途径，为文冠果资源综合开发利用提供了新的研究思路与方法。

进一步，第四溶剂选用水；优选为去离子水。

进一步，第三滤渣与去离子水的质量比为1:5-10。第三滤渣与去离子水的质量比典型但非限制性的例如为1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或1:10。

进一步，第三树脂选用ab-8大孔径树脂，进一步优选ab-8大孔径树脂的树脂柱内直径与高度比为1:6-8。

在本发明的一种优选实施方式中，所述步骤(e)包括以下步骤：

(i)第三滤渣与去离子水混合(例如在60-80℃搅拌溶解1h)，用ab-8大孔径树脂柱吸附富集色素；

(ii)用乙醇【色素质量5-6倍的50％(v/v)乙醇】洗脱ab-8大孔径树脂柱，重复洗脱3-4次，合并洗脱液得到第三洗脱液；

(iii)第三洗脱液减压浓缩(例如在80℃下)回收乙醇，干燥(例如真空干燥)后得到色素，纯度95％以上。

其中，步骤(a)、(b)、(c)、(d)、(e)可以连续的单独操作，从而提取文冠果鲜果壳中游离氨基酸、黄酮、皂苷、色素中的两种或多种成分，统筹了各成分的提取流程顺序，且兼顾了各成分提取工艺之间的匹配性、兼容性和连续性，提高了文冠果鲜果壳综合利用率。

本发明另一方面提供了一种处理文冠果鲜果壳的方法，其包括上述从文冠果鲜果壳中提取游离氨基酸、黄酮、皂苷、色素中的两种或多种成分的的步骤或方法。

本发明采用上述技术方案具有以下有益效果：

1、本发明的提取方法，统筹了游离氨基酸、黄酮、皂苷、色素各成分的提取流程顺序，且兼顾了各成分提取工艺之间的匹配性、兼容性和连续性，达到了综合利用文冠果果壳，将文冠果鲜果壳中的主要有效成分提取出来，成为食品、医药和工业原料，提高了文冠果鲜果壳综合利用率；

2、本发明的提取方法，所有溶剂均回收，水经过处理后循环使用，沉淀和过滤的剩余物用于生态修复功能材料原料，殆尽消纳，环境友好。

附图说明

图1所示为工艺流程图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

文冠果鲜果壳的收集和检测

河北省张家口市是我国文冠果原产地之一，在涿鹿县境内发现树龄1300多年的文冠果树，生长茂盛。每年七月底八月初收获文冠果，文冠果从果实成熟到果壳变干、变棕褐色大约为15-20天。2017年7月20日采集文冠果果实，颜色为黄绿色，用手轻捏，果壳即破裂，种子散出。

对采集鲜果壳中的主要有效成分进行检测，检测结果：含水量12.3±1.63％，色素20.0±1.15％，皂苷15.0±0.78％，黄酮10.0±0.44％，游离氨基酸4.6±0.35％。

实施例一

一种从文冠果鲜果壳中提取游离氨基酸、黄酮、皂苷、色素四种成分的方法，工艺流程如图1所示，包括以下步骤：

1、果壳预处理

(1.1)称取文冠果鲜果壳20.0kg、70％(v/v)乙醇200kg，放入高剪切设备中进行剪切破碎，剪切速度20000r/min，温度25℃，剪切时间5min；

(1.2)剪切完成后，真空抽滤得到第一滤液和第一滤渣，第一滤渣用50％(v/v)乙醇洗涤2次，每次40kg；再用去离子水洗涤2次，每次40kg，合并得到第一洗涤液，合并第一滤液和第一洗涤液，得到第一混合液；

(1.3)第一混合液在75℃减压浓缩，回收乙醇，浓缩至固形物含量1.0wt％左右，得到第一浓缩液。

2、提取游离氨基酸

(2.1)第一浓缩液通过732强酸型阳离子交换树脂(直径与高度比为1:8)柱富集游离氨基酸，用50％(v/v)乙醇，洗涤2次，每次20kg；再用去离子水洗涤2次，每次20kg，合并得到第二洗涤液；

(2.2)用2mol/lnh4oh溶液80kg洗脱732强酸型阳离子交换树脂，每次20kg，分4次洗脱，汇总得到第一洗脱液；

(2.3)第一洗脱液在80℃减压蒸发至干涸，得到第一干涸物，回收nh3和h2o；再用20kg2mol/lnh4oh溶液溶解第一干涸物，80℃真空干燥，反复溶解和干燥3次，得到氨基酸。

3、提取黄酮

(3.1)第二洗涤液在80℃减压蒸发，回收乙醇，浓缩至固形物含量90％左右的第二浓缩液，加入20.0kg氯仿，在150l萃取罐中提取1h，搅拌速度80r/min，萃取液真空抽滤，反复3次，得到第二滤液和第二滤渣，第二滤渣用氯仿洗涤2次，每次10kg，得到第三洗涤液，合并第二滤液和第三洗涤液，得到第二混合液；

(3.2)第二混合液在70℃下蒸发回收氯仿，真空干燥至干涸，得到第二干涸物；

(3.3)第二干涸物用30.0kg70％(v/v)乙醇溶解后真空过滤，再用60.0kg70％(v/v)乙醇分3次洗涤，合并滤液和洗涤液，再经80℃减压回收乙醇，水溶液用活性白土脱色，-40℃冷冻干燥，得到黄酮。

4、提取皂苷

(4.1)第二滤渣加入其5倍质量即35.0kg乙酸乙酯溶解皂苷，在150l萃取罐中提取1h，搅拌速度80r/min，真空抽滤得到第三滤液和第三滤渣，第三滤渣每次加7.0kg乙酸乙酯洗涤2次，得到第四洗涤液，合并第三滤液和第四洗涤液，得到第三混合液；

(4.2)第三混合液用d101聚苯乙烯型大孔径树脂柱富集皂苷化合物，用50％(v/v)乙醇洗脱，每次15.0kg，洗脱三次，合并洗脱液得到第二洗脱液；

(4.3)将第二洗脱液先在80℃温度下回收乙酸乙酯，再在75℃以下抽真空回收乙醇和脱水，脱水至含水量30wt％后停止，降至40℃以下时用活性白土脱色，-40℃冷冻干燥，得到皂苷。

5、提取色素

(5.1)第三滤渣和40.0kg去离子水混合放进150l提取罐中，温度70℃，搅拌速度80r/min，提取时间1h，冷却后用ab-8大孔径树脂柱吸附富集色素；

(5.2)用50％(v/v)乙醇洗脱ab-8大孔径树脂柱(内直径与高度比为1:7)，每次20kg，洗脱3次，合并洗脱液得到第三洗脱液；

(5.3)第三洗脱液在80℃下减压浓缩回收乙醇，真空干燥后得到色素。

实施例二

一种从文冠果鲜果壳中提取游离氨基酸、黄酮、皂苷、色素四种成分的方法，与实施例一的区别在于，加入70％(v/v)乙醇140kg，使果壳与乙醇的质量比为1:7。

实施例三

一种从文冠果鲜果壳中提取游离氨基酸、黄酮、皂苷、色素四种成分的方法，与实施例一的区别在于，加入70％(v/v)乙醇280kg，使果壳与乙醇的质量比为1:14。

实施例四

一种从文冠果鲜果壳中提取游离氨基酸、黄酮、皂苷、色素四种成分的方法，与实施例一的区别在于，第一浓缩液的固形物含量为0.2wt％。

实施例五

一种从文冠果鲜果壳中提取游离氨基酸、黄酮、皂苷、色素四种成分的方法，与实施例一的区别在于，第一浓缩液的固形物含量为4.0wt％。

对实施例一至实施例五提取得到的氨基酸、黄酮、皂苷、色素四种成分进行检测，检测结果如表1所示：

表1

由表1的结果可以看出，实施例一至五中提取得到的氨基酸的回收率均在86％以上，纯度均在99％以上；黄酮的回收率均在95％以上，纯度均在87％以上；皂苷的回收率均在95％以上，纯度均在89％以上；色素的回收率均在96％以上，纯度均在98％以上。

与实施例一相比，实施例二中果壳与第一溶剂乙醇的质量比较低，不在优选的范围之内，质量比较低会影响有效成分的溶解。实施例三中果壳与第一溶剂乙醇的质量比较高，不在优选的范围之内，质量比过高会造成乙醇的浪费。

与实施例一相比，实施例四中第一浓缩液的固形物含量较低，不在优选的范围之内；实施例五中第一浓缩液的固形物含量较高，不在优选的范围之内；第一浓缩液的固形物含量较低，会使其中的一些杂质无法以沉淀物的形式排除，影响后续提取过程中产品的纯度；第一浓缩液的固形物含量较高，可能会造成一些有效成分以沉淀物的形式损失，会影响提取的有效成分的回收率。

比较上述结果，认为实施例一的工艺参数较合理。