Alda-1溶液及其制备方法和应用与流程

本发明涉及医药领域，具体涉及alda-1溶液及其制备方法和应用。
背景技术：
：公开该
背景技术：
部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。乙醛脱氢酶2(aldh2)基因位于染色体12q24上，包括13个外显子和12个内含子，43437个碱基对组成，可以编码517个氨基酸，aldh2定位于线粒体，是含有三个结构域的四聚体酶，代谢各种内源性与外源性醛类物质；主要分布在肝脏、心脏、脑等组织中。野生型aldh2基因记为aldh2*1，单碱基突变的基因aldh2*2。aldh2*2突变位点是487位的谷氨酸变为赖氨酸，突变杂合型酶活性降低60％-80％。aldh2具有脱氢酶活性，代谢各种醛类物质；具有还原酶活性，代谢硝酸甘油，全球有6％的人群携带此突变位点，东亚有30％-40％的人携带此突变位点。alda-1即n-(1,3-苯并二氧杂环戊烯-5-基甲基)-2,6-二氯苯甲酰胺，cas号为349438-38-6，是通过高通量筛选的方法筛选出的aldh2的小分子激活剂，可通过变构激活提高aldh2的活性，可以使野生型aldh2的活性增加2倍，使突变型aldh2的活性增加11倍，nad+存在的条件下，alda-1可以使突变型aldh2的活性增加100倍。alda-1大鼠缺血前给药可以减少约60％的梗死面积，改善急性心梗后心室功能和减轻线粒体功能障碍，促进乙醛的代谢，减少乙醛在体内的积累，并且能降低4-hne对aldh2的失活作用(science2008sep12；321(5895))。急性心肌梗死和心脏骤停是两种临床上常见且危害极大的心血管危重疾病，常造成严重的心肌损伤、心功能障碍甚至死亡，目前缺乏保护心肌的有效手段。alda-1减轻急性缺血再灌注损伤和慢性心力衰竭，减少约60％心肌梗死的面积，具备临床转化价值和成药潜力，但目前临床转化面临困难，alda-1不溶于水，在大多数有机溶剂中溶解度也不佳，无法作为注射液使用，发明人发现现在的溶解alda-1的溶剂是dmso(二甲基亚砜)，peg400(聚乙二醇400)，也有使用dmf(n,n-二甲基甲酰胺)的，但是，dmso、dmf均具有毒性，根据2015版《中国药典》是无法应用到注射剂中并应用于人体的，而peg400中alda-1溶解度欠佳，在临床上无法应用；而且，alda-1的理化性质目前文献中报道的很少，所以理化性质也需要进一步摸索。技术实现要素：因此，本发明的目的在于解决alda-1溶解度低以及现有溶解方法无法在临床应用的问题，提供了一种alda-1溶液及其制备方法和应用，该溶液可作为alda-1注射剂，溶解度好、稳定性高，无刺激，能够用于静脉注射，用于预防和/或治疗急性心肌梗死、心脏骤停、急性缺血再灌注损伤和/或慢性心力衰竭。具体地，本发明的技术方案如下所述：在本发明的第一方面，本发明提供了一种alda-1溶液，其以alda-1为活性成分，以乙醇、聚乙二醇400、生理盐水为溶剂。本发明所述的alda-1溶液无色透明，常温保存24小时内无沉淀，有一定挥发性，4天内不会出现结晶。在本发明的实施方式中，本发明所述alda-1溶液的ph为5-6.8。在本发明的一些实施方式中，本发明所述peg400，其聚合度n为8.2-9.1，分子量为380-420，粘度为(6.8-8.0)×10-2帕·秒(116.6k)。在本发明的实施方式中，本发明所述alda-1溶液中溶剂的体积比为乙醇：聚乙二醇400：生理盐水＝(3-5)：(3-5)：(2-4)，优选为5：(3-5)：(2-4)，进一步优选为5：3：(2-4)。在较为优选的实施方式中，所述alda-1溶液中溶剂的体积比为乙醇：聚乙二醇400：生理盐水＝5:3:2，当溶剂以此体积比配制时，溶液具有更高的稳定性，溶液可在更长时间内保持澄明无沉淀，稳定时间可延长至少3小时。此外，在一些实施方式中，发明人发现，当乙醇、聚乙二醇400和生理盐水的用量过高或过低均会影响alda-1的溶解度，以及所形成的溶液的稳定性。在一些实施方式中，本发明也验证了其他溶剂种类组合及配制比例，但是其稳定性均不及本发明的溶液。在本发明的实施方式中，所述alda-1的浓度为4-10mg/ml。在较为优选的实施方式中，所述alda-1的浓度为10mg/ml，在该浓度下，配合本发明的溶剂配比，尤其当乙醇：聚乙二醇400：生理盐水的体积比以5:3:2配制时，溶液具有相对更高的稳定性，溶液可在更长时间内保持澄明无沉淀，稳定时间可延长至少3小时，且产生结晶的时间也会推迟，至少在5天内不出现结晶，但是超过5天会出现部分结晶。在本发明的第二方面，本发明提供了一种制备上述第一方面中所述的alda-1溶液的方法，其包括将乙醇加入alda-1进行超声，然后加入聚乙二醇400和生理盐水，混匀即得。在本发明的实施方式中，溶剂的依次加入顺序为乙醇、聚乙二醇400和生理盐水。在本发明的实施方式中，聚乙二醇400和生理盐水可同时加入或者先加入生理盐水再加入聚乙二醇，然而这样的顺序得到的溶液的稳定性不如依次使用乙醇、聚乙二醇400和生理盐水的顺序。在本发明的实施方式中，所述alda-1溶液中溶剂的体积比为乙醇：聚乙二醇400：生理盐水＝(3-5)：(3-5)：(2-4)，优选为5:3:2；所述alda-1的浓度为4-10mg/ml，优选为10mg/ml。在本发明的实施方式中，溶剂的种类、配制方式、加入顺序以及活性成分的用量是影响溶液澄明以及稳定的关键因素，据此配制得到的溶液溶解性较好，稳定性较高。在本发明的实施方式中，所述超声可采用超声震荡的方式，比如超声震荡3-5分钟；在本发明的实施方式中，加入聚乙二醇400和生理盐水混合，其混合的方式可采用本领域常规的混合方式，能够实现均匀混合即可，比如。在本发明的第三方面，本发明提供了一种药物组合物，其含有上述第一方面中所述的alda-1溶液。以及，在本发明的第四方面，本发明提供了一种药物制剂，其含有上述第一方面中所述的alda-1溶液。在本发明的实施方式中，所述药物制剂为溶液制剂，优选为注射液，注射液可用于静脉注射或肌肉注射。在本发明的实施方式中，所述注射液由上述第一方面中所述的alda-1溶液组成，使用时将其进行1:1稀释(生理盐水稀释)，对血管及肌肉无刺激，无溶血现象发生，可安全使用。本领域技术人员在本发明的公开下，为了实现进一步的效果，可在本发明注射液的基础上在不影响药物疗效、不引起毒性或过度刺激的情况下通过常规实验选择性添加注射液常用的附加剂，比如抑菌剂等。以及，根据本发明所述的注射液，本领域可联想到将其尝试制备成冻干剂，以进一步提高其稳定性。在本发明的第五方面，本发明还提供了上述第一方面中所述的alda-1溶液或含有该溶液的药物组合物或药物制剂在制备用于预防和/或治疗急性心肌梗死、心脏骤停、急性缺血再灌注损伤和/或慢性心力衰竭的药物中的应用。以及，本发明还提供了上述第一方面中所述的alda-1溶液或含有该溶液的药物组合物或药物制剂在制备用于上调心脏中bcl2的表达，和/或减少心脏中bax的表达，和/或减少心脏中4-hne的表达的药物或试剂中的应用。在本发明的优选的实施方式中，所述用于预防和/或治疗急性心肌梗死、心脏骤停、急性缺血再灌注损伤和/或慢性心力衰竭的药物为alda-1注射液。在本发明的实施方式中，本发明通过超声检测心功能、ttc染色以及westernblot验证了本发明所述alda-1注射液对于心脏功能的改善作用，并且alda-1注射液能够上调心脏中bcl2的表达并能够减少心脏中4-hne的表达。本发明的alda-1注射液具有以下优势：1、alda-1注射液所有溶剂都是可以用来静脉注射的。2、根据本发明的实验例，小鼠在心肌梗死后注射alda-1注射液，超声检测小鼠心功能可以改善约15％的心功能。3、根据实验数据，小鼠在心肌梗死后注射液alda-1注射液，减少约15％的心肌梗死面积。4、根据本发明的实验例，注射液的安全性具有保证，进行的注射液溶血性实验结果表明注射液不会导致明显的溶血；进行的血管刺激性试验中，在1:1稀释下(生理盐水稀释)注射液对血管无明显的刺激性。附图说明构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：图1为实验例1中he染色光镜观察结果图。图2为实验例1中he染色肉眼观察结果图。图3为实验例2中溶血实验肉眼观察结果图，其中纯化水组的离心管中呈现红色，其他组中未出现红色。图4为实验例2中溶血实验的镜下观察(200μm)图。图5为实验例3中超声检测心功能结果分析图(*p<0.05)。图6为实验例3中超声检测心功能图。图7为实验例3中ttc染色结果图。图8为实验例3中ttc染色结果(梗死面积)统计分析图。图9为实验例3中westernblot实验结果(bcl2、bax、β-actin)图及分析图。图10为实验例3中westernblot实验结果(4-hne、β-actin)图及分析图。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。本发明所使用的试剂或原料均可通过常规途径购买获得，如无特殊说明，本发明所使用的试剂或原料均按照本领域常规方式使用或者按照产品说明书使用。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。实施例1alda-1注射液的制备溶剂：乙醇、聚乙二醇400、生理盐水精确称量20mgalda-1，加入洁净的5ml的ep管中，将乙醇加入ep管中，利用超声波震荡3分钟；加入peg400、生理盐水，使其混匀、灭菌，即得。其中，溶剂的用量情况如表1所示。表1溶剂用量情况溶剂乙醇聚乙二醇400生理盐水制备例11ml600μl400μl制备例21ml600μl800μl制备例31ml1ml400μl制备例41ml1ml800μl制备例51ml1ml600μl制备例1-5制备得到的注射液均为无色透明液体，其ph均在5-6.8范围内，将上述制备例1-5中制备得到的注射液常温保存，观察其性状变化，结果如表2所示。表2变化制备例1常温保存30小时内未见沉淀，5天内未出现结晶。制备例2常温保存27小时内未见沉淀，4.5天内未出现结晶。制备例3常温保存24小时内未见沉淀，4天内未出现结晶。制备例4常温保存24小时内未见沉淀，4天内未出现结晶。制备例5常温保存24小时内未见沉淀，4天内未出现结晶。安全性验证和效果验证实验实验例1、alda-1注射液血管刺激性实验实验方法：取健康家兔3只，左侧侧耳缘静脉分别以iv(静脉)注射alda-1注射液原液(取自制备例1)(原液组)、alda-1注射液原液(制备例1)生理盐水1:1稀释液(1:1稀释液组)、0.9％氯化钠注射液(ns组)，注射量为1ml/kg，每只均采用自身对照，右侧耳缘iv给予等体积0.9％氯化钠注射液，1次/d，连续给药3d。末次给药后48h，肉眼观察注射部位有无红肿、充血等刺激现象，然后处死动物，以耳缘静脉注射点至向心方向，连续取3段1cm血管连同周围组织，4％中性甲醛溶液固定，常规脱水，石蜡包埋，切6μm薄片，he染色，光镜下做病理组织学检查，另一侧阴性对照血管也同法处理。评级标准如表3所示：表3血管刺激性试验评分标准注：血管刺激结果判断标准：≤0.5无刺激性，≤2.5轻微刺激性，≤4.5中刺激性，≤6.0重刺激性。结果分析：实验结果如图1和图2所示。(1)ns组和1:1稀释液组可见针刺部位有注射时留下的“针疤”，“针疤”周围偶有血管轻度扩张现象，而针刺部位的近心端静脉未见明显的充血水肿或血栓形成，光镜下病理组织学检查，注射部位血管结构完整，血管内皮细胞无明显变性、坏死，管腔内无血栓形成。结果表明在1:1稀释下静脉注射alda-1注射液对血管无明显的刺激性。(2)注射液原液组静脉注射部位除有“针疤”外，还可见静脉内有血栓现象，针刺部位的近心端静脉明显的充血，光镜下注射部位血管结构断裂，血管内皮细胞出现变性、坏死，管腔内有血栓形成。实验例2、alda-1注射液溶血性实验实验方法：取健康家兔1只，心脏取血约20ml，置含玻璃珠的三角瓶中振摇5min，除去纤维蛋白，使成脱纤血液。将脱纤血液移入离心管内，加入生理盐水轻轻摇匀后1500r/min离心15min，弃去上清液，再加生理盐水混匀离心，重复2～3次，至上清液不显红色为止，取所得红细胞按其容积用生理盐水稀释成2％混悬液备用。取洁净离心管，依次加入不同体积的alda-1注射液原液(制备例1)，即注射液组，每个浓度平行2管，同时设阴性对照(生理盐水)、阳性对照(纯化水)。全部加好后，混匀，立即置于37℃温箱中进行温育。观察指标分为全溶血、部分溶血、无溶血和凝集四种，如下所述：全溶血：溶液澄明呈红色，管底无细胞残留；部分溶血：溶液澄明呈红色或棕色，管底有少量红细胞残留；无溶血：红细胞全部下沉，上层液体无色澄明；凝集：虽不溶血，但出现红细胞凝集，振摇后不能分散。其中，肉眼观察结果如图3中所示，37℃温箱中温育3h后，0.1ml注射液组、0.2ml注射液组、0.3ml注射液组、0.4ml注射液组、0.5ml注射液组，未出现明显溶血，未见明显凝集反应，上层液体澄明。纯化水组(阳性对照组)15分钟时便出现了全溶血。其中，镜下观察(200μm)结果如图4中所示，37℃温箱中温育3h后，生理盐水组、0.1ml注射液组、0.2ml注射液组、0.3ml注射液组、0.4ml注射液组、0.5ml注射液组，未见明显的红细胞破裂；纯化水组(阳性对照组)红细胞15分钟时便能观察到红细胞大量破裂，3h后只能观察到红细胞残渣。结果表明alda-1注射液无溶血发生。实验例3、动物疗效验证实验动物种类：c57野生型小鼠测试方法：超声检测心功能、ttc染色检测心肌梗死面积、血清ntpro-bnp、westernblot实验。实验方案：缺血40min，再灌注4h，连续尾静脉注射给药3天，7天后取材。如无特殊说明，本实施例中所述注射均指尾静脉注射。实验分为6组，各组注射用量相同均按照小鼠体重20mg/kg给药，其中，每组情况如下：第1组：sham(假手术组)；第2组：i/r(心肌缺血再灌注组)第3组：i/r+dmso(心肌缺血再灌注组+注射dmso)第4组：i/r+dmso+alda-1(心肌缺血再灌注组+腹腔注射用dmso溶解的alda-1)第5组：i/r+alc+peg+ns(心肌缺血再灌注组+注射不含alda-1的注射液)第6组：i/r+alc+peg+ns+alda-1(心肌缺血再灌注组+注射alda-1注射液组)其中，sham表示假手术组，i/r表示缺血再灌注，dmso表示注射二甲基亚砜，dmso+alda-1表示注射用dmso溶解alda-1(5mgalda-1溶解在1mldmso中)，alc+peg+ns表示不含alda-1的纯溶剂组即乙醇、聚乙二醇400和生理盐水(溶剂用量同制备例1)，alc+peg+ns+alda-1表示alda-1注射液组(其组成同制备例1)的分别如下：超声检测心功能结果如图5、图6所示，其中，fs表示短轴缩短率，主要反映心脏的收缩功能。ef表示射血分数，反映心脏的射血供能。两个参数增高均表示改善。alda-1注射液尾静脉注射(第6组)和(dmso+alda-1，第4组)腹腔注射都可以改善心脏功能，并且alda-1注射液尾静脉注射(第6组)和腹腔注射dmso+alda-1(第4组)的结果相当。根据图5实验数据，小鼠在心肌梗死后注射alda-1注射液(第6组)相较于第2组未注射药物组，超声检测小鼠心功能可以改善至少15％的心功能。ttc染色结果及结果分析如图7和图8所示，图8是图7的统计图，ttc染色，染的是心脏的梗死区，苍白区域(在图7中显示为浅色区域)为梗死区，鲜红区域(在图7中显示为深色区域)为非梗死区。根据实验统计数据，小鼠在心肌梗死后注射液alda-1注射液(第6组)相较于第2组未注射药物组，能够减少至少15％的心肌梗死面积。其中，westernblot实验结果如图9和图10所示，alda-1注射液尾静脉注射(第6组)和(dmso+alda-1，第4组)腹腔注射均可以上调心脏中bcl2的表达，alda-1注射液尾静脉注射(第6组)和(dmso+alda-1，第4组)腹腔注射均可以减少心脏中bax的表达，alda-1注射液尾静脉注射(第6组)和(dmso+alda-1，第4组)腹腔注射均可以减少心脏中4-hne的表达，，且本发明的alda-1注射液(第6组)对于上调心脏中bcl2的表达、减少心脏中bax的表达以及减少心脏中4-hne的表达的效果相较于腹腔注射dmso+alda-1(第4组)效果更优。以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12