一种药物组合物及其应用

1.本发明属于药物领域，以土木香内酯和parp抑制剂为有效成分的药物组合物在制备抗癌、辅助抗癌的药物中的应用。


背景技术：

2.恶性肿瘤是严重威胁人类健康的疾病，但是目前的抗癌治疗效果还远不理想，急需研发疗效更好、特异性更高的治疗方法。癌症细胞有dna复制压力和dna损伤，因而癌细胞的存活高度依赖于dna损伤反应(dna damage response,ddr)。因此，dna修复和/或ddr是非常有前途的治疗癌症的靶标(pilie et al.nature reviews clinical oncology.2019；16:81-104)。poly(adp-ribose)polymerase-1和2(多聚腺苷二膦酸-核糖聚合酶-1和-2)(parp1和parp2)在主要dna修复通路和维持基因组稳定性中发挥重要的作用。作为第一种成功利用合成致死(synthetic lethality)概念的抗癌药物，parp抑制剂如奥拉帕尼(olaparib)等对于brca-1或brca-2突变的癌细胞有特异的致死毒性，因而获准在临床上用于对此类癌的治疗(lord,cj,ashworth,a.science.2017；355:1152-58)。但是绝大多数种类癌的brca-1和-2基因是正常的，因而对parp抑制剂不敏感。很多研究表明，parp抑制剂使癌细胞对dna损伤更敏感，因而可以与传统放、化疗起到合成致死效应。但是，由于parp抑制剂与放、化疗的组合疗法对健康细胞的毒副作用太大，因而难以实际应用(yap et al.american society of clinical oncology educational book.2019:185-95)。
3.土木香内酯(alantolactone,atl)是传统中草药土木香的活性物质，为倍半萜类化合物，具有多种生物活性和药理作用，包括抗炎、抗菌、抗癌等。过去的研究发现atl在细胞内与硫氧还蛋白还原酶(thioredoxin reductase,trxr)结合并抑制其活性，导致细胞内活性氧自由基(reactive oxygen species,ros)水平升高(zhang et al.biochemical pharmacology.2016；102:34-44)。由于癌细胞的内在ros产生量和氧化压力比正常细胞高，其抗氧化能力已经处于接近饱和状态，atl处理可以选择性地使癌细胞内ros升高至毒性水平，导致dna的氧化损伤，而正常细胞因为内在氧化压力低而不会产生dna氧化损伤。因此，atl与parp抑制剂有望对癌细胞而非正常细胞产生合成致死效应。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供以土木香内酯(atl)和parp抑制剂为有效成分的药物组合物在制备抗癌、辅助抗癌的药物中的应用。在一种可能的情况下一种药物可能发挥增加癌细胞对药物组合物的其它药物的敏感性。在另一情况下，抗癌剂的组合可具有增效甚至合成致死的治疗效果。土木香内酯特异性引起ros在肿瘤细胞中迅速上调，使得dna氧化损伤快速积累并激活了parp。而parp抑制使得急剧或过量dna单链断裂转为肿瘤致死性的dna双链断裂。本发明发现土木香内酯显著提高parp抑制剂的抗肿瘤效果并且与parp抑制剂具有合成致死性，且对正常细胞无毒性作用，因此具有治疗癌症的作用。
5.本发明通过实验验证10μm的土木香内酯对肿瘤细胞以及正常细胞增殖无抑制作
用，然而特异性引起肿瘤细胞中dna氧化损伤的快速累积并激活了parp，进而显著增强肿瘤细胞对parr抑制剂的敏感性。通过chou-talalay法(药物联合作用的定量方法)计算两药物的联合作用指数(ci值)发现具有强合成致死作用。此外明确合成致死作用机制并非土木香内酯通过诱导肿瘤细胞同源重组(hr)缺陷，而是由于parp抑制剂引起dna-parp复合物捕获，导致dna损伤修复受阻，最终诱导细胞凋亡。肿瘤异体移植实验证实两药物组合在体内具有显著抗肿瘤作用。这为土木香内酯作为药物化合物和组合物应用于人类癌症治疗提供了证据。
6.有鉴于此，本申请提供了非毒性剂量的atl通过引起癌细胞的dna氧化损伤而与具有捕获特性的parp抑制剂如奥拉帕尼(olaparib)形成合成致死作用，并且本申请还提供了亚致死剂量的atl和奥拉帕尼的药物组合可以起到有效减小体内异体移植的肿瘤的疗效。
7.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
8.根据本发明的一个方面，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含土木香内酯和parp抑制剂。
9.根据本发明的某些实施方式，所述土木香内酯和parp抑制剂的摩尔浓度比为10:4-10:256。
10.根据本发明的某些实施方式，所述土木香内酯和parp抑制剂的摩尔浓度比为10:8-10:128。
11.根据本发明的某些实施方式，所述药物组合物用于治疗癌症。
12.根据本发明的某些实施方式，所述癌症包括前列腺癌、结肠癌、肺癌和乳腺癌。
13.根据本发明的某些实施方式，所述parp抑制剂是parp捕获剂。
14.根据本发明的某些实施方式，所述parp捕获剂包括奥拉帕尼(olaparib)、瑞卡帕布(rucaparib)、尼拉帕尼(niraparib)和他啦唑帕尼(talazoparib)。
15.根据本发明的一个方面，本发明提供了一种制备所述药物组合物的方法，其特征在于，所述方法将土木香内酯和parp抑制剂与药学上可接受的赋形剂混合。
16.根据本发明的一个方面，本发明提供了一种药盒，所述药盒包含所述土木香内酯和parp抑制剂。
17.根据本发明的一个方面，本发明提供了所述药物组合物用于制备治疗癌症的药物中的用途。
附图说明：
18.图1显示了非细胞毒性剂量的土木香内酯特异并迅速的引起肿瘤细胞中ros上调；图1a为0.3125μm、0.625μm、1.25μm、2.5μm、5μm、10μm、20μm土木香内酯处理pc-3人前列腺癌细胞、sw480人结肠癌细胞和a549人肺癌细胞以及ncm-460人正常结肠上皮细胞30分钟，检测细胞内ros的变化；图1b为10μm土木香内酯处理如图所示肿瘤细胞系以及正常细胞系(ncm-460、beas-2b、hek293)30分钟，检测细胞内ros变化；图1c为细胞集落形成实验检测到10μm土木香内酯对如图所示肿瘤细胞系与正常细胞系(ncm-460、beas-2b、hek293)是非毒性的；与对照相比，n.s.为无显著差异，*为p<0.05,**为p<0.01,***为p<0.001,****为p<0.0001；
19.图2显示了不同浓度4μm、8μm、16μm、32μm、64μm、128μm、256μm奥拉帕尼和维利帕尼
(veliparib)分别对pc-3、a549、sw480肿瘤细胞的抑制作用；此两药物单独使用时对这三种癌细胞的半数有效剂量(ic50)都在35μm以上，甚至100μm以上；
20.图3显示了集落形成实验检测10μm土木香内酯和/或10μm parp抑制剂对肿瘤细胞pc-3、sw480、a549和正常细胞beas-2b、ncm460的抑制作用；10μm土木香内酯、10μm奥拉帕尼或10μm维利帕尼对以上细胞均无抑制作用，但10μm土木香内酯和10μm奥拉帕尼展现出联合抑制肿瘤细胞增殖作用，在正常细胞中不存在联合抑制，而10μm土木香内酯和10μm维利帕尼没有联合抗肿瘤作用，提示土木香内酯与parp抑制剂的有效组合与parp捕获在dna损伤位点密切相关；
21.图4显示了土木香内酯显著增加pc-3前列腺癌、sw480结肠癌、a549肺癌和mda-mb-436乳腺癌细胞对奥拉帕尼的敏感性；10μm atl显著提高了奥拉帕尼在以上癌细胞中的毒性。
22.图5显示了土木香内酯与奥拉帕尼在体内具有抗癌活性；土木香内酯和奥拉帕尼单独使用对裸鼠体内异体接种的肿瘤无治疗效果，而两者联合使用则显著抑制肿瘤的重量(图5a)和体积(图5b)。
23.发明详述
24.聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(parp)及其抑制剂
25.聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(parp)是参与dna单链断裂修复的酶，由于其在肿瘤细胞内过表达并在肿瘤细胞dna损伤修复过程中发挥着重要作用，被认为是肿瘤靶向治疗领域的重要靶点。
26.parp抑制剂主要依赖两种不同的机制：第一类通过抑制parp酶活性起作用的酶催化抑制；和第二类阻断parp酶活性，并将parp蛋白捕获在dna损伤位点上并阻止其从dna损伤位点释放的结合抑制，或者称为双重抑制，相对于酶催化抑制剂而言结合抑制剂造成细胞的毒性更大。
27.目前已知维利帕尼(veliparib)可以是第一类，而奥拉帕尼(olaparib)、瑞卡帕布(rucaparib)、尼拉帕尼(niraparib)和他啦唑帕尼(talazoparib)属于第二类。
28.parp捕获剂
29.parp抑制剂能够结合到parpl(和/或parp2)的nad
+
结合口袋，引起构象异构，造成dna-parp的不可解离的结合，使parp保持对dna的结合，这个过程被称为dna-parp复合物的“捕获(trapping)”，这将导致dna-parp复合物长期存在，无法进行后续的修复。
30.parp捕获剂包括奥拉帕尼(olaparib)、瑞卡帕布(rucaparib)、尼拉帕尼(niraparib)和他啦唑帕尼(talazoparib)。
31.虽然parp抑制剂单一疗法在临床上显示有巨大疗效，但是其限于特定的肿瘤类型，并不能用于治疗任何癌症，并且在治疗中许多肿瘤由于同源重组功能的补偿突变而复发，出现肿瘤耐药。
32.土木香内酯
33.天然化合物土木香内酯(alantolactone，atl)能通过抑制硫氧还蛋白还原酶(thioredoxin reductase，trxr)来增加细胞内ros含量。
34.快速无限制的增殖、高水平新陈代谢、myc和ras等癌基因的激活以及线粒体的异常等，使得绝大多数癌细胞中活性氧(ros)等自由基的含量远高于正常细胞。与致癌性转化
相关的另一个重要特征是快速产生活性氧自由基(ros)，这使得癌症细胞容易产生进一步的氧化损伤。因此癌症细胞对进一步的氧化打击更加敏感，抑制细胞内的主要抗氧化分子谷胱甘肽(glutathione)和硫氧化还原蛋白(thioredoxin)会诱发癌细胞凋亡。
35.研究证实atl特异性抑制硫氧化还原蛋白还原酶，升高细胞内的ros水平，通过提高细胞内硫氧还原蛋白表达可以削弱atl引起的ros积累以及dna损伤。最近的一项研究表明，atl通过诱导活性氧(ros)上调和ros介导的细胞凋亡来抑制结肠癌以及乳腺癌细胞的生长。
36.协同作用
37.药物协同作用：当两种以上的药物合用时，倘若它们的作用方向是一致的，达到彼此增强的效果称为协同作用，其总的效应超过各药单用时效应的总和。换言之，两种药物联合应用其效应大于任何一种药物单独应用的疗效，大于两种药物的相加作用。
38.合成致死(synthetic lethality):两个药物单独使用时各自阻断一条非致死性的细胞存活通路，因而各自都是非致死性或无毒性的，但同时使用时导致两条非致死性细胞存活通路被同时阻断，而引起细胞死亡，这种特殊的药物协同作用方式为合成致死。
39.chou-talalay又称中位药效法，联合指数法，是抗肿瘤药物联合研究中应用最为广泛的方法之一。compusyn软件根据chou-talalay建立的数学模型计算得出半数有效量(dm)，反应动力学级数(m)和联合指数(ci)值。根据ci值可以判定药物间的相互作用的强度以及性质。
40.其中两药联合的指数公式：
[0041][0042]
其中(d)1和(d)2是药物1和药物2联合作用抑制率为x％时的作用浓度，(d
x
)1和(d
x
)2是药物1和药物2单独作用抑制率为x％时的作用，结果抑制率-联合指数(fa-ci)表示。其中0<ci<0.3强协同作用，0.3<ci<0.7协同作用，0.7<ci<0.9中度协同作用，0.9<ci<1.1相加作用，1.1<ci<10拮抗作用。
[0043]
药物组合物
[0044]
术语“药物组合物”表示含有治疗有效量的一种或多种所述化合物及其药学上可接受的互变异构体、溶剂合物、水合物或盐，与其他药学上可接受的载体的混合物。将所述化合物制备成药物组合物的目的是为了更方便地向治疗对象给药。
[0045]
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含土木香内酯和parp抑制剂。
[0046]
根据本发明的某些实施方式，所述土木香内酯和parp抑制剂的摩尔浓度比为10:4-10:256，例如10:4-10:128、10:4-10:64、10:4-10:32、10:4-10:16、10:4-10:8、10:8-10:256、10:8-10:128、10:8-10:64、10:8-10:32、10:8-10:16、10:16-10:256、10:16-10:128、10:16-10:64、10:16-10:32、10:32-10:256、10:32-10:128、10:32-10:64、10:64-10:256、10:64-10:128或10:128-10:256。
[0047]
根据本发明的某些实施方式，所述土木香内酯和parp抑制剂的摩尔浓度比为10:4、10:5、10:6、10:7、10:8、10:9、10:10、10:11、10:12、10:13、10:14、10:15、10:16、10:17、10:18、10:19、10:20、10:21、10:22、10:23、10:24、10:25、10:26、10:27、10:28、10:29、10:
30、10:31、10:32、10:33、10:34、10:35、10:36、10:37、10:38、10:39、10:40、10:41、10:42、10:43、10:44、10:45、10:46、10:47、10:48、10:49、10:50、10:51、10:52、10:53、10:54、10:55、10:56、10:57、10:58、10:59、10:60、10:61、10:62、10:63、10:64、10:65、10:66、10:67、10:68、10:69、10:70、10:71、10:72、10:73、10:74、10:75、10:76、10:77、10:78、10:79、10:80、10:81、10:82、10:83、10:84、10:85、10:86、10:87、10:88、10:89、10:90、10:91、10:92、10:93、10:94、10:95、10:96、10:97、10:98、10:99、10:100、10:101、10:102、10:103、10:104、10:105、10:106、10:107、10:108、10:109、10:110、10:111、10:112、10:113、10:114、10:115、10:116、10:117、10:118、10:119、10:120、10:121、10:122、10:123、10:124、10:125、10:126、10:127、10:128、10:129、10:130、10:131、10:132、10:133、10:134、10:135、10:136、10:137、10:138、10:139、10:140、10:141、10:142、10:143、10:144、10:145、10:146、10:147、10:148、10:149、10:150、10:151、10:152、10:153、10:154、10:155、10:156、10:157、10:158、10:159、10:160、10:161、10:162、10:163、10:164、10:165、10:166、10:167、10:168、10:169、10:170、10:171、10:172、10:173、10:174、10:175、10:176、10:177、10:178、10:179、10:180、10:181、10:182、10:183、10:184、10:185、10:186、10:187、10:188、10:189、10:190、10:191、10:192、10:193、10:194、10:195、10:196、10:197、10:198、10:199、10:200、10:201、10:202、10:203、10:204、10:205、10:206、10:207、10:208、10:209、10:210、10:211、10:212、10:213、10:214、10:215、10:216、10:217、10:218、10:219、10:220、10:221、10:222、10:223、10:224、10:225、10:226、10:227、10:228、10:229、10:230、10:231、10:232、10:233、10:234、10:235、10:236、10:237、10:238、10:239、10:240、10:241、10:242、10:243、10:244、10:245、10:246、10:247、10:248、10:249、10:250、10:251、10:252、10:253、10:254、10:255或10:256。
[0048]
根据本发明的某些实施方式，所述土木香内酯和parp抑制剂的摩尔浓度比为10:8-10:128。
[0049]
根据本发明的某些实施方式，所述药物组合物用于治疗癌症。
[0050]
根据本发明的某些实施方式，所述癌症包括前列腺癌、结肠癌、肺癌和乳腺癌。
[0051]
根据本发明的某些实施方式，所述parp抑制剂是parp捕获剂。
[0052]
根据本发明的某些实施方式，所述parp捕获剂包括奥拉帕尼(olaparib)、瑞卡帕布(rucaparib)、尼拉帕尼(niraparib)和他啦唑帕尼(talazoparib)。
[0053]
根据本发明的某些实施方式，所述土木香内酯和parp抑制剂的含量占所述药物组合物的1～100％，例如1～99.5％、1～99％、1～90％、1～80％、1～70％、1～60％、1～50％、1～40％、1～30％、1～20％、1～10％、10～100％、10～99.5％、10～99％、10～90％、10～80％、10～70％、10～60％、10～50％、10～40％、10～30％、10～20％、20～100％、20～99.5％、20～99％、20～90％、20～80％、20～70％、20～60％、20～50％、20～40％、20～30％、30～100％、30～99.5％、30～99％、30～90％、30～80％、30～70％、30～60％、30～50％、30～40％、40～100％、40～99.5％、40～99％、40～90％、40～80％、40～70％、40～60％、40～50％、50～100％、50～99.5％、50～99％、50～90％、50～80％、50～70％、50～60％、60～100％、60～99.5％、60～99％、60～90％、60～80％、60～70％、70～100％、70～99.5％、70～99％、70～90％、70～80％、80～100％、80～99.5％、80～99％、80～90％、90～100％、90～99.5％、或90～99％。根据本申请的某些实施方式，所述土木香内酯和parp抑制剂含量占所述药物组合物的1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、
13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％。
[0054]
制备所述药物组合物的方法
[0055]
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种制备所述药物组合物的方法，其特征在于，所述方法将土木香内酯和parp抑制剂与药学上可接受的赋形剂混合来制备。
[0056]
术语“赋形剂”表示指的是通常用于制备颗粒和/或固体口服剂型和/或液体注射剂型制剂的制药技术的不具有任何药理学作用的可药用成分。赋形剂可以起到载体、稀释剂、或溶解改性剂、吸收促进剂、稳定剂或制备的助剂以及其它的作用。在制备药物组合物中有用的赋形剂通常是安全、无毒并且是医学使用以及药物使用中可接受的。在本说明书中使用的"赋形剂"或"药学上可接受的赋形剂"包括一种和多种这样的赋形剂。
[0057]
药盒
[0058]
本申请中术语“药盒”或“试剂盒”可互换使用。本申请公开了包含治疗有效量的所述治疗剂或药物组合物的药盒。根据本申请的某些实施方式，所述药盒还包含一种或多种其他的治疗剂。根据本申请的某些实施方式，所述药盒还包含使用说明书。根据本申请的某些实施方式，所述药盒还包含用于相应给药方式的装置，例如但不限于针头。
[0059]
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种药盒，所述药盒包含所述土木香内酯和parp抑制剂。
[0060]
根据本发明的某些实施方式，所述土木香内酯和parp抑制剂的摩尔浓度比为10:4-10:256，例如10:4-10:128、10:4-10:64、10:4-10:32、10:4-10:16、10:4-10:8、10:8-10:256、10:8-10:128、10:8-10:64、10:8-10:32、10:8-10:16、10:16-10:256、10:16-10:128、10:16-10:64、10:16-10:32、10:32-10:256、10:32-10:128、10:32-10:64、10:64-10:256、10:64-10:128或10:128-10:256。
[0061]
根据本发明的某些实施方式，所述土木香内酯和parp抑制剂的摩尔浓度比为10:4、10:5、10:6、10:7、10:8、10:9、10:10、10:11、10:12、10:13、10:14、10:15、10:16、10:17、10:18、10:19、10:20、10:21、10:22、10:23、10:24、10:25、10:26、10:27、10:28、10:29、10:30、10:31、10:32、10:33、10:34、10:35、10:36、10:37、10:38、10:39、10:40、10:41、10:42、10:43、10:44、10:45、10:46、10:47、10:48、10:49、10:50、10:51、10:52、10:53、10:54、10:55、10:56、10:57、10:58、10:59、10:60、10:61、10:62、10:63、10:64、10:65、10:66、10:67、10:68、10:69、10:70、10:71、10:72、10:73、10:74、10:75、10:76、10:77、10:78、10:79、10:80、10:81、10:82、10:83、10:84、10:85、10:86、10:87、10:88、10:89、10:90、10:91、10:92、10:93、10:94、10:95、10:96、10:97、10:98、10:99、10:100、10:101、10:102、10:103、10:104、10:105、10:106、10:107、10:108、10:109、10:110、10:111、10:112、10:113、10:114、10:115、10:116、10:117、10:118、10:119、10:120、10:121、10:122、10:123、10:124、10:125、10:126、10:127、10:128、10:129、10:130、10:131、10:132、10:133、10:134、10:135、10:136、10:137、10:138、10:139、10:140、10:141、10:142、10:143、10:144、10:145、10:146、10:147、10:148、
10:149、10:150、10:151、10:152、10:153、10:154、10:155、10:156、10:157、10:158、10:159、10:160、10:161、10:162、10:163、10:164、10:165、10:166、10:167、10:168、10:169、10:170、10:171、10:172、10:173、10:174、10:175、10:176、10:177、10:178、10:179、10:180、10:181、10:182、10:183、10:184、10:185、10:186、10:187、10:188、10:189、10:190、10:191、10:192、10:193、10:194、10:195、10:196、10:197、10:198、10:199、10:200、10:201、10:202、10:203、10:204、10:205、10:206、10:207、10:208、10:209、10:210、10:211、10:212、10:213、10:214、10:215、10:216、10:217、10:218、10:219、10:220、10:221、10:222、10:223、10:224、10:225、10:226、10:227、10:228、10:229、10:230、10:231、10:232、10:233、10:234、10:235、10:236、10:237、10:238、10:239、10:240、10:241、10:242、10:243、10:244、10:245、10:246、10:247、10:248、10:249、10:250、10:251、10:252、10:253、10:254、10:255或10:256。
[0062]
根据本发明的某些实施方式，所述土木香内酯和parp抑制剂的摩尔浓度比为10:8-10:128。
[0063]
根据本发明的某些实施方式，所述药物组合物用于治疗癌症。
[0064]
根据本发明的某些实施方式，所述癌症包括前列腺癌、结肠癌、肺癌和乳腺癌。
[0065]
根据本发明的某些实施方式，所述parp抑制剂是parp捕获剂。
[0066]
根据本发明的某些实施方式，所述parp捕获剂包括奥拉帕尼(olaparib)、瑞卡帕布(rucaparib)、尼拉帕尼(niraparib)和他啦唑帕尼(talazoparib)。
[0067]
根据本发明的某些实施方式，所述土木香内酯和parp抑制剂的含量占所述药盒的1～100％，例如1～99.5％、1～99％、1～90％、1～80％、1～70％、1～60％、1～50％、1～40％、1～30％、1～20％、1～10％、10～100％、10～99.5％、10～99％、10～90％、10～80％、10～70％、10～60％、10～50％、10～40％、10～30％、10～20％、20～100％、20～99.5％、20～99％、20～90％、20～80％、20～70％、20～60％、20～50％、20～40％、20～30％、30～100％、30～99.5％、30～99％、30～90％、30～80％、30～70％、30～60％、30～50％、30～40％、40～100％、40～99.5％、40～99％、40～90％、40～80％、40～70％、40～60％、40～50％、50～100％、50～99.5％、50～99％、50～90％、50～80％、50～70％、50～60％、60～100％、60～99.5％、60～99％、60～90％、60～80％、60～70％、70～100％、70～99.5％、70～99％、70～90％、70～80％、80～100％、80～99.5％、80～99％、80～90％、90～100％、90～99.5％、或90～99％。根据本申请的某些实施方式，所述土木香内酯和parp抑制剂含量占所述药盒的1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％。
[0068]
治病方法
[0069]
根据本发明的一个方面，本发明提供了所述药物组合物治疗癌症的方法。
[0070]
根据本发明的某些实施方式，所述药物组合物包含土木香内酯和parp抑制剂。
[0071]
根据本发明的某些实施方式，所述土木香内酯和parp抑制剂的摩尔浓度比为10:
4-10:256，例如10:4-10:128、10:4-10:64、10:4-10:32、10:4-10:16、10:4-10:8、10:8-10:256、10:8-10:128、10:8-10:64、10:8-10:32、10:8-10:16、10:16-10:256、10:16-10:128、10:16-10:64、10:16-10:32、10:32-10:256、10:32-10:128、10:32-10:64、10:64-10:256、10:64-10:128或10:128-10:256。
[0072]
根据本发明的某些实施方式，所述土木香内酯和parp抑制剂的摩尔浓度比为10:4、10:5、10:6、10:7、10:8、10:9、10:10、10:11、10:12、10:13、10:14、10:15、10:16、10:17、10:18、10:19、10:20、10:21、10:22、10:23、10:24、10:25、10:26、10:27、10:28、10:29、10:30、10:31、10:32、10:33、10:34、10:35、10:36、10:37、10:38、10:39、10:40、10:41、10:42、10:43、10:44、10:45、10:46、10:47、10:48、10:49、10:50、10:51、10:52、10:53、10:54、10:55、10:56、10:57、10:58、10:59、10:60、10:61、10:62、10:63、10:64、10:65、10:66、10:67、10:68、10:69、10:70、10:71、10:72、10:73、10:74、10:75、10:76、10:77、10:78、10:79、10:80、10:81、10:82、10:83、10:84、10:85、10:86、10:87、10:88、10:89、10:90、10:91、10:92、10:93、10:94、10:95、10:96、10:97、10:98、10:99、10:100、10:101、10:102、10:103、10:104、10:105、10:106、10:107、10:108、10:109、10:110、10:111、10:112、10:113、10:114、10:115、10:116、10:117、10:118、10:119、10:120、10:121、10:122、10:123、10:124、10:125、10:126、10:127、10:128、10:129、10:130、10:131、10:132、10:133、10:134、10:135、10:136、10:137、10:138、10:139、10:140、10:141、10:142、10:143、10:144、10:145、10:146、10:147、10:148、10:149、10:150、10:151、10:152、10:153、10:154、10:155、10:156、10:157、10:158、10:159、10:160、10:161、10:162、10:163、10:164、10:165、10:166、10:167、10:168、10:169、10:170、10:171、10:172、10:173、10:174、10:175、10:176、10:177、10:178、10:179、10:180、10:181、10:182、10:183、10:184、10:185、10:186、10:187、10:188、10:189、10:190、10:191、10:192、10:193、10:194、10:195、10:196、10:197、10:198、10:199、10:200、10:201、10:202、10:203、10:204、10:205、10:206、10:207、10:208、10:209、10:210、10:211、10:212、10:213、10:214、10:215、10:216、10:217、10:218、10:219、10:220、10:221、10:222、10:223、10:224、10:225、10:226、10:227、10:228、10:229、10:230、10:231、10:232、10:233、10:234、10:235、10:236、10:237、10:238、10:239、10:240、10:241、10:242、10:243、10:244、10:245、10:246、10:247、10:248、10:249、10:250、10:251、10:252、10:253、10:254、10:255或10:256。
[0073]
根据本发明的某些实施方式，所述土木香内酯和parp抑制剂的摩尔浓度比为10:8-10:128。
[0074]
根据本发明的某些实施方式，所述癌症包括前列腺癌、结肠癌、肺癌和乳腺癌。
[0075]
根据本发明的某些实施方式，所述parp抑制剂是parp捕获剂。
[0076]
根据本发明的某些实施方式，所述parp捕获剂包括奥拉帕尼(olaparib)、瑞卡帕布(rucaparib)、尼拉帕尼(niraparib)和他啦唑帕尼(talazoparib)。
[0077]
根据本发明的某些实施方式，所述土木香内酯和parp抑制剂的含量占所述药物组合物的1～100％，例如1～99.5％、1～99％、1～90％、1～80％、1～70％、1～60％、1～50％、1～40％、1～30％、1～20％、1～10％、10～100％、10～99.5％、10～99％、10～90％、10～80％、10～70％、10～60％、10～50％、10～40％、10～30％、10～20％、20～100％、20～99.5％、20～99％、20～90％、20～80％、20～70％、20～60％、20～50％、20～40％、20～30％、30～100％、30～99.5％、30～99％、30～90％、30～80％、30～70％、30～60％、30～
50％、30～40％、40～100％、40～99.5％、40～99％、40～90％、40～80％、40～70％、40～60％、40～50％、50～100％、50～99.5％、50～99％、50～90％、50～80％、50～70％、50～60％、60～100％、60～99.5％、60～99％、60～90％、60～80％、60～70％、70～100％、70～99.5％、70～99％、70～90％、70～80％、80～100％、80～99.5％、80～99％、80～90％、90～100％、90～99.5％、或90～99％。根据本申请的某些实施方式，所述土木香内酯和parp抑制剂含量占所述药物组合物的1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％。
[0078]
制药用途
[0079]
根据本发明的一个方面，本发明提供了所述药物组合物用于制备治疗癌症的药物中的用途。
[0080]
根据本发明的某些实施方式，所述药物组合物包含土木香内酯和parp抑制剂。
[0081]
根据本发明的某些实施方式，所述土木香内酯和parp抑制剂的摩尔浓度比为10:4-10:256，例如10:4-10:128、10:4-10:64、10:4-10:32、10:4-10:16、10:4-10:8、10:8-10:256、10:8-10:128、10:8-10:64、10:8-10:32、10:8-10:16、10:16-10:256、10:16-10:128、10:16-10:64、10:16-10:32、10:32-10:256、10:32-10:128、10:32-10:64、10:64-10:256、10:64-10:128或10:128-10:256。
[0082]
根据本发明的某些实施方式，所述土木香内酯和parp抑制剂的摩尔浓度比为10:4、10:5、10:6、10:7、10:8、10:9、10:10、10:11、10:12、10:13、10:14、10:15、10:16、10:17、10:18、10:19、10:20、10:21、10:22、10:23、10:24、10:25、10:26、10:27、10:28、10:29、10:30、10:31、10:32、10:33、10:34、10:35、10:36、10:37、10:38、10:39、10:40、10:41、10:42、10:43、10:44、10:45、10:46、10:47、10:48、10:49、10:50、10:51、10:52、10:53、10:54、10:55、10:56、10:57、10:58、10:59、10:60、10:61、10:62、10:63、10:64、10:65、10:66、10:67、10:68、10:69、10:70、10:71、10:72、10:73、10:74、10:75、10:76、10:77、10:78、10:79、10:80、10:81、10:82、10:83、10:84、10:85、10:86、10:87、10:88、10:89、10:90、10:91、10:92、10:93、10:94、10:95、10:96、10:97、10:98、10:99、10:100、10:101、10:102、10:103、10:104、10:105、10:106、10:107、10:108、10:109、10:110、10:111、10:112、10:113、10:114、10:115、10:116、10:117、10:118、10:119、10:120、10:121、10:122、10:123、10:124、10:125、10:126、10:127、10:128、10:129、10:130、10:131、10:132、10:133、10:134、10:135、10:136、10:137、10:138、10:139、10:140、10:141、10:142、10:143、10:144、10:145、10:146、10:147、10:148、10:149、10:150、10:151、10:152、10:153、10:154、10:155、10:156、10:157、10:158、10:159、10:160、10:161、10:162、10:163、10:164、10:165、10:166、10:167、10:168、10:169、10:170、10:171、10:172、10:173、10:174、10:175、10:176、10:177、10:178、10:179、10:180、10:181、10:182、10:183、10:184、10:185、10:186、10:187、10:188、10:189、10:190、10:191、10:192、10:193、10:194、10:195、10:196、10:197、10:198、10:199、10:200、10:201、10:202、10:203、
10:204、10:205、10:206、10:207、10:208、10:209、10:210、10:211、10:212、10:213、10:214、10:215、10:216、10:217、10:218、10:219、10:220、10:221、10:222、10:223、10:224、10:225、10:226、10:227、10:228、10:229、10:230、10:231、10:232、10:233、10:234、10:235、10:236、10:237、10:238、10:239、10:240、10:241、10:242、10:243、10:244、10:245、10:246、10:247、10:248、10:249、10:250、10:251、10:252、10:253、10:254、10:255或10:256。
[0083]
根据本发明的某些实施方式，所述土木香内酯和parp抑制剂的摩尔浓度比为10:8-10:128。
[0084]
根据本发明的某些实施方式，所述癌症包括前列腺癌、结肠癌、肺癌和乳腺癌。
[0085]
根据本发明的某些实施方式，所述parp抑制剂是parp捕获剂。
[0086]
根据本发明的某些实施方式，所述parp捕获剂包括奥拉帕尼(olaparib)、瑞卡帕布(rucaparib)、尼拉帕尼(niraparib)和他啦唑帕尼(talazoparib)。
[0087]
根据本发明的某些实施方式，所述土木香内酯和parp抑制剂的含量占所述药物组合物的1～100％，例如1～99.5％、1～99％、1～90％、1～80％、1～70％、1～60％、1～50％、1～40％、1～30％、1～20％、1～10％、10～100％、10～99.5％、10～99％、10～90％、10～80％、10～70％、10～60％、10～50％、10～40％、10～30％、10～20％、20～100％、20～99.5％、20～99％、20～90％、20～80％、20～70％、20～60％、20～50％、20～40％、20～30％、30～100％、30～99.5％、30～99％、30～90％、30～80％、30～70％、30～60％、30～50％、30～40％、40～100％、40～99.5％、40～99％、40～90％、40～80％、40～70％、40～60％、40～50％、50～100％、50～99.5％、50～99％、50～90％、50～80％、50～70％、50～60％、60～100％、60～99.5％、60～99％、60～90％、60～80％、60～70％、70～100％、70～99.5％、70～99％、70～90％、70～80％、80～100％、80～99.5％、80～99％、80～90％、90～100％、90～99.5％、或90～99％。根据本申请的某些实施方式，所述土木香内酯和parp抑制剂含量占所述药物组合物的1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或100％。
[0088]
本发明中土木香内酯可将其制备成药学上允许的任意一种剂型，包括但不限于片剂、口服剂、冲剂、注射剂、脂质体、靶向给药注射剂丸剂、胶囊剂、颗粒剂、粉剂、栓剂、散剂、膏剂、贴剂、注射液、溶液、混悬液、喷雾剂、洗剂、滴剂、擦剂等。所述药物组合物可制成干粉形式，并且在给药前与无菌水或缓冲液混合以制成溶液形式。所述缓冲液的ph通常为3-11，优选5-9，更优选7-8。
[0089]
术语“给药”、“给予”或“施予”是指将一定剂量的化合物或药物组合物通过合适的给药方式给予对象。
[0090]
所述“给药方式”包括但不限于口服给药、静脉内给药、呼吸道内给药、舌下给药、局部给药、肌肉内给药、眼内给药、透皮吸收、胃肠外给药、腹膜内给药、阴道给药、颊部给药、经直肠给药等本领域已知的任何给药方式。本领域技术人员应该了解对象的给药方式
取决于多个因素，所述因素包括疾病的位置、对象的年龄、疾病的严重程度、以及药物组合物的成分等。
[0091]
在本申请中当“约”用于修饰数值时，是指所述数值可以上下浮动
±
10％、
±
9％、
±
8％、
±
7％、
±
6％、
±
5％、
±
4％、
±
3％、
±
2％或
±
1％的范围内。
[0092]
除非在本申请中另有说明或与上下文明显矛盾，在描述本申请的上下文中(包括权利要求的上下文中)使用的术语“一种”、“一个”、“所述”、“该”以及“至少一个”和类似指代被解释为覆盖单数和复数。除非在本申请中另有说明或与上下文明显矛盾，本申请中所使用的术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”被解释为开放式术语(即“包括但不限于”)。除非在本申请中另有说明或与上下文明显矛盾，本申请所述的所有方法可以根据本领域技术人员的理解，以任何合适的顺序进行。
[0093]
本申请中引用的所有专利、专利申请和参考文献均通过引用的方式全文并入本申请，其并入程度就如同每一篇文献单独引用作为参考。如果本申请和本文提供的文献之间存在冲突，应以本申请中的内容为准。
实施例
[0094]
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
[0095]
实施例1：癌细胞和正常细胞的培养
[0096]
用如下细胞进行细胞培养：人前列腺癌细胞系pc-3、du145、lncap；结肠癌细胞系sw480、sw620、caco-2、sw1116、hct116；肺癌细胞系a549、hcc827、h446；乳腺癌细胞系t47d、mcf-7、hcc1937、mda-mb-231、mda-mb-436；子宫内膜癌细胞系ishikawa；宫颈癌细胞系siha、hela；纤维肉瘤细胞系ht1080；骨肉瘤细胞系mg-63；肝癌细胞系hepg2；黑色素瘤细胞系m21以及人正常结肠上皮细胞系ncm-460、人正常肺上皮细胞系beas-2b和人胚肾上皮细胞系hek293。
[0097]
使上述人类细胞系生长在补充有10％胎牛血清(gibco)、链霉素(100mg/ml)和青霉素(100mg/ml)(invitrogen,carlsbad,ca,usa)的完全dmem(gibco)培养基中，将细胞维持在37℃、5％co2培养条件下。
[0098]
实施例2：土木香内酯与细胞内ros水平的变化
[0099]
研究证实土木香内酯特异性抑制硫氧化还原蛋白还原酶(thioredoxin reductase,trxr)，为此我们检测土木香内酯对细胞内ros水平的影响。
[0100]
活性氧检测试验(reactive oxygen species assay)原理:由于探针dcfh-da本身没有荧光，并且可以自由穿过细胞膜，当其进入细胞内后，可以被细胞内的酯酶水解生成dcfh。而dcfh不能通透细胞膜，从而使探针很容易被装载到细胞内。细胞内产生的活性氧可以氧化无荧光的dcfh生成有荧光的dcf，因此通过流式细胞仪检测dcf的荧光就可以知道细胞内活性氧的水平。
[0101]
配制土木香内酯的dmso(二甲基亚砜)溶液，贮存浓度10mm。用完全培养基稀释成0.3125μm、0.625μm、1.25μm、2.5μm、5μm、10μm、20μm浓度，然后分别用于处理pc-3人前列腺
癌细胞、sw480人结肠癌细胞和a549人肺癌细胞以及ncm460人正常结肠上皮细胞30分钟。
[0102]
按照1:1000用无血清培养液稀释dcfh-da探针(s0033,beyotime biotechnology公司)，终浓度为10μm，加入上述处理后的细胞样品中，在37℃、5％co2培养条件下孵育30分钟，流式细胞术检测dcf的荧光强度，分析细胞内ros水平变化。结果均以检测到的细胞荧光强度表示，并与未进行药物处理(对照组)细胞进行对比统计分析。
[0103]
所有分析均采用双尾学生t检验(student’s t-test)进行。n.s.:无统计学意义，*:p<0.05，**:p<0.01，***:p<0.001，****:p<0.0001。
[0104]
ros测定结果如图1a所示。在pc-3、sw480和a549肿瘤细胞中发现ros水平以土木香内酯剂量依赖的方式上调，在0.625μm浓度下开始显著上调，在20μm时ros水平达到最高。但是在正常的ncm 460细胞中，未检测到ros水平变化。
[0105]
实施例3：10μm土木香内酯引起多种肿瘤细胞中ros上调
[0106]
使用10μm土木香内酯的dmso(二甲基亚砜)溶液处理人前列腺癌细胞pc-3；人结肠癌细胞sw480、caco2、sw1116、hct116、sw620；人肺癌细胞a549、hcc827；人乳腺癌细胞t47d、mcf-7、hcc1937、mda-mb 231；人黑色素瘤m21；人胰腺癌细胞panc-1；人纤维肉瘤细胞ht1080；子宫内膜癌细胞ishikawa；宫颈癌细胞siha、hela；骨肉瘤细胞系mg-63；人正常结肠上皮细胞ncm-460、人正常肺上皮细胞beas-2b和人胚肾细胞hek293 30分钟，使用实施例2的方法检测ros水平。
[0107]
ros测定结果如图1b所示。10μm土木香内酯处理30分钟特异性引起如图所示肿瘤细胞中ros显著上调。
[0108]
实施例4：10μm土木香内酯对癌细胞和正常细胞的作用
[0109]
本实施例将实施例1中所述人前列腺癌细胞pc-3；人结肠癌细胞sw480、caco2、sw1116、hct116；人肺癌细胞a549、hcc827；人乳腺癌细胞t47d；人黑色素瘤m21；人胰腺癌细胞panc-1；人正常结肠上皮细胞ncm-460、人正常肺上皮细胞beas-2b和人胚肾细胞hek293接种于12孔板中，500个每孔。细胞贴壁后加入10μm土木香内酯的dmso溶液处理7天。去除培养液，加入冷甲醇固定5分钟，吸弃冷甲醇后加入0.5％结晶紫(溶于25％甲醇)染色液染色30分钟；去除染色液，pbs清洗3-5次，自然风干后拍照。
[0110]
细胞集落形成实验如图1c所示，10μm土木香内酯处理肿瘤细胞pc-3、sw480、caco2、sw1116、hct116、a549、hcc827、t47d、m21和panc-1与未处理相比，细胞密度一致，增殖未受到影响；正常细胞ncm-460、beas-2b、hek293细胞增殖也未受到10μm土木香内酯抑制。
[0111]
本实施例表明10μm土木香内酯对肿瘤细胞和正常细胞不具有抑制作用，是非毒性的。
[0112]
以上实施例表明10μm土木香内酯是非细胞毒性的，但可以显著并迅速上调肿瘤细胞中的ros。
[0113]
实施例5：parp抑制剂对肿瘤细胞的作用
[0114]
本实施例检测肿瘤细胞pc-3、sw480、a549对parp抑制剂奥拉帕尼(olaparib)和维利帕尼(veliparib)的敏感性。
[0115]
奥拉帕尼和维利帕尼分别溶解于dmso(二甲基亚砜)，贮存浓度10mm。用dmem完全培养基将奥拉帕尼和维利帕尼稀释成以下浓度：4μm、8μm、16μm、32μm、64μm、128μm、256μm。
将处于生长对数期的肿瘤细胞pc-3、sw480、a549，均匀的接种在96孔板中，每孔5x102个细胞。接种后第二天，加入倍增浓度的奥拉帕尼或维利帕尼(4μm、8μm、16μm、32μm、64μm、128μm、256μm)作用72小时，药物处理结束后吸弃培养液，用培养基稀释配制好的mtt(5mg/ml)1:4稀释，加入到96孔板中每孔100μl，37℃孵育4h；取出培养板，弃掉mtt溶液，每孔加入150μl dmso，震板2～3min充分混匀后，酶标仪595nm处，读取每孔吸光值度o.d.值(一般o.d.大约为0.8～0.9)；三次独立重复试验，excel数据统计分析，graphpad prism 7作图。细胞存活以未处理对照的％表示。
[0116]
结果如图2a-2b所示。图2a表明维利帕尼在肿瘤细胞pc-3、sw480、a549中的半数抑制浓度ic50分别47.87μm、64.92μm、100.09μm。
[0117]
图2b表明奥拉帕尼在pc-3、sw480、a549细胞中的半数抑制浓度ic50分别为46.07μm、35.69μm、91.06μm。
[0118]
本实施例表明肿瘤细胞，特别是前列腺癌细胞、结肠癌细胞和肺癌细胞，对奥拉帕尼和维利帕尼没有展现出敏感性。
[0119]
实施例6：土木香内酯与奥拉帕尼在癌细胞内产生合成致死效果
[0120]
接种于12孔板中的肿瘤细胞pc-3、sw480、a549和正常细胞ncm 460、beas-2b加入dmem完全培养基稀释的终浓度为10μm土木香内酯和/或终浓度10μm parp抑制剂处理7天，将细胞维持在37℃、5％co2培养条件下，药物处理结束后，如前所述结晶紫染色观察细胞增殖情况。
[0121]
parp抑制剂属于至少两类：第一类抑制parp酶活性的催化抑制剂和第二类阻断parp酶活性并将parp蛋白捕获在dna损伤位点上的双重抑制剂。奥拉帕尼属于双重抑制剂而维利帕尼仅为催化抑制剂。
[0122]
集落形成实验具体的结果如图3所示，检测到10μm土木香内酯与10μm奥拉帕尼联合组而非单一药物作用组，在三种肿瘤细胞系pc-3、sw480、a549中表现出显著的抗肿瘤作用，细胞存活率降至为10％，但是这种作用在非肿瘤细胞ncm460、beas-2b中不存在，细胞存活率均为100％。加入抗氧化剂10mm nac抵消了两个药物的联合抑制作用，表明土木香内酯引起的氧化损伤是联合作用前提条件。然而10μm维利帕尼与10μm土木香内酯则未展现出对上述三种癌细胞的联合抑制作用。
[0123]
本实施例表明土木香内酯与parp抑制剂的有效组合与parp酶活性抑制无关，而与parp蛋白被捕获在dna损伤位点密切相关。
[0124]
实施例7：土木香内酯增加parp抑制剂在肿瘤细胞中的疗效
[0125]
将pc-3、sw480、a549肿瘤细胞暴露于0μm、1μm、2μm、4μm、8μm、16μm的奥拉帕尼单独或与10μm土木香内酯联合作用72小时，如实施例4所述mtt检测细胞存活率，数据以未处理对照的％表示。
[0126]
结果如图4所示，奥拉帕尼独立作用时，在0μm、1μm、2μm、4μm、8μm、16μm每个浓度下细胞存活率接近100％，加入10μm土木香内酯组合处理产生的细胞存活率明显低于单独奥拉帕尼处理，并表明在每个剂量下的奥拉帕尼都和土木香内有联合抗肿瘤作用。
[0127]
实施例8：土木香内酯和parp抑制剂奥拉帕尼的协同作用指数(ci值)
[0128]
10μm土木香内酯与不同剂量奥拉帕尼(4μm、8μm、16μm、32μm、64μm、128μm、256μm)分别组合作用pc-3、a549、sw480肿瘤细胞72小时，根据mtt结果计算单药和联合作用抑制
率。
[0129]
利用根据chou-talalay数学模型建立的compusyn软件计算协同作用指数(ci值)。
[0130]
ci计算公式如下：
[0131]
(d)1和(d)2是药物1和药物2联合作用抑制率为x％时的作用浓度，(d
x
)1和(d
x
)2是药物1和药物2单独作用抑制率为x％时的作用，结果以抑制率(fa)-联合指数(ci)表示。其中0<ci<0.3强协同作用，0.3<ci<0.7协同作用，0.7<ci<0.9中度协同作用，0.9<ci<1.1相加作用，1.1<ci<10拮抗作用。
[0132]
在三种细胞系观察到10μm土木香内酯与每个剂量下的奥拉帕尼都有合成致死(synthetic lethality)作用(表1)。其中以fa 0.5，fa 0.75，fa 0.9具有显著的强效协同作用(表2)。
[0133]
具体的如下所述：
[0134]
在pc-3、a549、sw480三种肿瘤细胞中检测到10μm土木香内酯与每个剂量浓度的奥拉帕尼(4μm、8μm、16μm、32μm、64μm、128μm、256μm)组合全部具有协同作用。
[0135]
其中10μm土木香内酯与8μm奥拉帕尼组合在pc-3前列腺癌肿瘤中fa 0.5对应ci值0.19，具有强效协同作用。在a549肺癌细胞中fa 0.5对应ci值0.35，具有协同作用。在sw480结肠癌细胞中fa 0.5对应ci值0.3，具有强协同作用。
[0136]
此外fa 0.75在pc-3前列腺癌细胞、a549肺癌细胞、sw480结肠癌细胞对应的ci值分别为0.21，0.26，0.28具有强协同作用，对应的奥拉帕尼组合浓度分别为32μm、64μm、64μm；fa 0.9在pc-3前列腺癌细胞、a549肺癌细胞、sw480结肠癌细胞对应的ci值分别为0.17，0.21，0.26，具有强协同作用，对应的奥拉帕尼组合浓度分别为128μm、128μm、128μm。
[0137]
表1：10μm atl与浓度倍增奥拉帕尼联合作用计算联合作用指数(ci)值
[0138][0139]
表2：10μm atl与奥拉帕尼联合作用计算生长抑制率fa(fraction affected)以及相应联合作用指数(ci)值
[0140][0141]
本实施例表明土木香内酯与parp抑制剂奥拉帕尼在治疗前列腺癌、结肠癌和肺癌中展现出合成致死作用。三种类型的肿瘤细胞中10μm土木香内酯与4μm、8μm、16μm、32μm、64μm、128μm、256μm奥拉帕尼组合ci值全部小于1，都具有合成致死作用。
[0142]
实施例9：土木香内酯和parp抑制剂奥拉帕尼的组合在体内的抗癌作用
[0143]
本实施例通过肿瘤异体移植实验测试土木香内酯和parp抑制剂奥拉帕尼的组合在小鼠体内对肿瘤的抑制作用。
[0144]
接种4x106个pc-3前列腺癌细胞于每只balb/c nude雄性裸鼠背部皮下。待肿瘤体积达到120mm3时，将它们分为四组(介质对照组、土木香内酯单药组、奥拉帕尼单药组、以及土木香内酯和奥拉帕尼联合用药组)，每组6只动物，进行给药治疗。地方动物实验伦理委员会批准了所有实验。
[0145]
使用肿瘤体积计算公式(v＝长径
×
短径x短径/2)计算肿瘤体积。
[0146]
土木香内酯单药组：土木香内酯(配制方式：土木香内酯溶于1％dmso+40％peg 300的溶剂)以50mg/kg剂量每天一次口服治疗，连续治疗15天；olaparib单药组：olaparib(配制方式：olaparib溶于4％dmso+30％peg 300的溶剂)以50mg/kg剂量每天一次腹腔注射治疗，连续治疗15天；联合用药组：上述两种药物联合给药，连续治疗15天，每天用游标卡尺测量肿瘤体积并称量动物体重，统计分析。未发现局部皮肤毒性或全身毒性。治疗结束后，剥离肿瘤组织。
[0147]
如图5所示，土木香内酯和parp抑制剂奥拉帕尼单药使用时，肿瘤的重量与体积与未用药的对照组相比没有差异，而土木香内酯和parp抑制剂奥拉帕尼联合使用组的肿瘤重量(图5a)和体积(图5b)均有显著下降。
[0148]
本实施例表明在土木香内酯单药和parp抑制剂奥拉帕尼在体内具有协同抑制肿瘤作用。
[0149]
本申请表明土木香内酯与parp抑制剂组合对癌细胞具有合成致死作用。