艾托莫德用于防治特发性肺纤维化的药物中的用途

1.本发明涉及艾托莫德在制备用于防治特发性肺纤维化的药物中的用途，属于医药技术领域。


背景技术：

2.特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis,ipf)是一种原因不明的弥漫性肺病，进展迅速，中位生存期短，死亡率高，且无特效治疗药物。长久以来，慢性炎症一直被认为是ipf发病的最基本因素，而随着人们对ipf发病机制的了解深入，近年来越来越多的研究指出，肺泡毛细血管内皮屏障完整性破坏导致的肺组织不可逆损伤，以及屏障重要组成细胞肺泡上皮细胞的间质转化过程，对ipf的发病发展起着极其重要的作用，且贯穿疾病始终。因此，在抗炎的同时寻找能够靶向肺泡毛细血管内皮屏障功能保护的药物，可能为ipf的治疗提供一个全新的切入点。
3.鞘氨醇-1-磷酸(sphingosine-1-phosphate,s1p)是一种具有生物活性的鞘酯类物质，通过与5种高亲和力受体(sphingosine-1-phosphate receptors,s1p1-5)，即s1p1、s1p2、s1p3、s1p4和s1p5结合在细胞迁移、血管屏障、免疫细胞运输等过程中发挥重要作用。不同亚型受体在不同组织器官的分布和生理功能都不尽相同。肺组织分布的受体亚型为s1p1，s1p2，s1p3和s1p4，而目前的研究热点主要集中在s1p1，s1p2和s1p3。
4.芬戈莫德(fingolimod，fty720)是首个已上市的s1p1受体调节剂，其也同时作用于s1p3，s1p4，s1p5亚型，研究显示fty720对ipf不但没有治疗作用，反而促进模型动物血管内皮屏障损伤而导致疾病加重(gendron,d.r.,et al.,fty720 promotes pulmonary fibrosis when administered during the remodelling phase following a bleomycin-induced lung injury.pulmpharmacolther,2017.44:p.50-56；oo,m.l.,et al.,engagement of s1p(1)-degradative mechanisms leads to vascular leak in mice.the journal of clinical investigation,2011.121(6):p.2290-2300)，该研究使得基于s1p1调节剂治疗ipf的研究止步于此。发明人认为，由于s1p1/s1p3对肺泡毛细血管屏障功能具有不同的调节作用，fty720所导致的屏障破坏，很可能源于其缺乏对s1p1和s1p3的选择性，不能因此而否认s1p1成为ipf治疗靶点的可能性。
5.艾托莫德(syl927，immh002)是中国医学科学院药物研究所自主合成的全新结果小分子s1p1调节剂(中国发明专利授权号：zl201280032727.7)，还同时作用于s1p4和s1p5亚型(jing jin,et al.,a novel s1p1 modulator immh002 ameliorates psoriasis in multiple animal models.acta pharmaceuticasinica b,doi:10.1016/j.apsb.2019.11.006.)。
6.(艾托莫德，syl927，immh002)
7.艾托莫德较已上市的芬戈莫德具有更好的受体选择性及安全性，已于2016年被国家食品药品监督管理局cfda批准用于银屑病的治疗(艾托莫德及片剂批件号2016l09349/2016l09350)，目前正在北京大学第一附属医院进行ⅰ期临床研究。
8.我们的前期研究表明，艾托莫德和fty720同为s1p1调节剂，同样可以降低炎症反应，但存在一个受体亚型(s1p3)选择性的差别，该受体选择性的差异可能导致两者对于ipf有不同的药理活性。基于此，发明人利用博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化模型探讨了艾托莫德对ipf的作用，并较深入了研究了s1p1和s1p3在ipf发生发展中的生物学作用，从而完成了本发明，为ipf提供了新的治疗选择，为以s1p1为靶点治疗ipf提供了理论依据。


技术实现要素：

9.本发明要解决的技术问题是提供艾托莫德在制备用于防治特发性肺纤维化的药物中的用途。
10.为解决本发明的上述技术问题，本发明提供如下技术方案：
11.第一方面，本发明提供了艾托莫德或其药学上可接受的盐在制备用于防治特发性肺纤维化的药物中的用途，其中所述的艾托莫德为式(i)所示的化合物：
[0012][0013]
第二方面，本发明提供了药物组合物在制备用于防治特发性肺纤维化的药物中的用途，所述药物组合物含有治疗有效量的艾托莫德或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体，其中艾托莫德为式(i)所示的化合物。
[0014]
本发明的艾托莫德可根据本领域公知的方法制备。可通过将本发明式(i)所示的艾托莫德或其药学上可接受的盐与一种或多种药学上可接受的固体或液体赋形剂和/或辅剂结合，制成适于人或动物使用的任何剂型。本发明式(i)所示的艾托莫德在其药物组合物中的含量通常为0.1-95重量％。
[0015]
本发明式(i)所示的艾托莫德或含有它的药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、鼻腔、口腔粘膜、眼、肺和呼吸道、皮肤、阴道、直肠等。给药剂型可以是液体剂型、固体剂型或半固体剂型。液体剂
型可以是溶液剂(包括真溶液和胶体溶液)、乳剂(包括o/w型、w/o型和复乳)、混悬剂、注射剂(包括水针剂、粉针剂和输液)、滴眼剂、滴鼻剂、洗剂和搽剂等；固体剂型可以是片剂(包括普通片、肠溶片、含片、分散片、咀嚼片、泡腾片、口腔崩解片)、胶囊剂(包括硬胶囊、软胶囊、肠溶胶囊)、颗粒剂、散剂、微丸、滴丸、栓剂、膜剂、贴片、气(粉)雾剂、喷雾剂等；半固体剂型可以是软膏剂、凝胶剂、糊剂等。本发明的胺基丙二醇类衍生物可以制成普通制剂、缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及各种微粒给药系统。
[0016]
本发明式(i)所示的艾托莫德的给药剂量依照所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的个体情况，给药途径和剂型等可以有大范围的变化。一般来讲，本发明艾托莫德的每天的合适剂量范围为0.01-150mg/kg体重，优选为0.1-100mg/kg体重，更优选为0.1-60mg/kg体重，最优选为0.3-60mg/kg体重。上述剂量可以一个剂量单位或分成几个剂量单位给药，这取决于医生的临床经验以及包括运用其它治疗手段的给药方案。
[0017]
本发明式(i)所示的的艾托莫德或含有它的药物组合物可单独服用，或与其他治疗药物或对症药物合并使用。当本发明式(i)所示的的艾托莫德与其它治疗药物存在协同作用时，应根据实际情况调整它的剂量。
[0018]
有益效果：本发明的式(i)所示的艾托莫德对博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化模型具有显著疗效，能够显著延长模型动物生存期，改善各项肺功能，降低肺部炎症，减缓病理损伤和纤维化程度，安全无毒，为特发性肺纤维化的临床治疗提供了新的药物选择。
附图说明
[0019]
图1.艾托莫德(syl927)对博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化的治疗作用。a：艾托莫德(syl927)对模型动物生存期的影响；b：艾托莫德(syl927)对模型动物肺指数的影响；
[0020]
图2.艾托莫德(syl927)对模型动物肺功能的影响；
[0021]
图3.艾托莫德(syl927)对模型动物病理学改变的影响(he染色)；
[0022]
图4.艾托莫德(syl927)对模型动物肺病理学改变的影响(masson染色)；
[0023]
图5.艾托莫德(syl927)对博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化模型支气管肺泡灌洗液中炎症细胞数量的影响。
[0024]
图6.艾托莫德(syl927)对毛细血管内皮屏障功能的影响。a：艾托莫德(syl927)对肺纤维化动物模型肺部紧密连接蛋白zo-1表达的影响；b：艾托莫德(syl927)对人脐静脉内皮细胞的细胞间紧密连接的影响；c：艾托莫德(syl927)对小鼠腹腔毛细血管渗漏的影响。
[0025]
图7.艾托莫德(syl927)对博莱霉素诱导的肺纤维化小鼠肺泡上皮细胞间质转化的影响。
具体实施方式
[0026]
为了使本领域技术人员充分了解本发明，以下通过具体的实施例进一步说明本发明，但本领域技术人员应该知晓，本发明实施例并不以任何方式限制本发明。
[0027]
实验例1：s1p1调节剂对s1p1-5亚型的激动活性
[0028]
实验方法：采用β-arrestin法测定s1p1调节剂(s1p：鞘氨醇-1-磷酸；艾托莫德-p：艾托莫德的活性磷酸脂)对不同亚型s1p受体的激动活性，实验结果以半数有效浓度ec
50
(nm)表示。其中所述的艾托莫德-p为式(ⅱ)所示的化合物：
[0029][0030]
艾托莫德-p用dmso配制为5mm的储存液，s1p用0.2n naoh配制为2.5mm的储存液。将pathhunter cho-k1 edg1β-arrestin细胞重悬于细胞铺板液11号中，以5000个细胞/孔的密度铺于384孔板，每板20μl。37℃，5％co2培养过夜后，加入5μl不同浓度的待测化合物，37℃，5％co2孵育1.5小时，同时做标准曲线。孵育结束后，每孔加入12.5μlpathhunter检测试剂，室温孵育1小时。envision检测荧光信号。将各孔信号值与对应化合物浓度的log值，进行4参数非线性回归(log agonist vs.response
–
variable slope)，得到ec
50
值)。注：s1p(鞘氨醇-1-磷酸)为s1p1-5的生理性配体；艾托莫德属于前药类s1p1调节剂，体内须代谢成磷酸酯艾托莫德-p发挥作用。
[0031]
实验结果：如表1所示，艾托莫德-p对s1p1、s1p4、s1p5有较强的激动活性，而根据以往报道，已上市药物fty720活性磷酸酯除了对s1p1、s1p4和s1p5有较强的激动活性外，对s1p3亦有很强的激动活性(stephen hanessian,et al.,constrained azacyclic analogues of the immunomodulatory agent fty720 as molecular probes for sphingosine 1-phosphate receptors,bioorganic&medicinal chemistry let-ters.2007,17(2),491-494.persistent signaling induced by fty720-phosphate is me-diated by internalized s1p1 receptors.florian mullershausen,et al.,nature chemical biology.2009(5)428-434)。
[0032]
表1.s1p1调节剂对s1p1-5亚型的激动活性
[0033][0034]
实验例2：s1p1调节剂对ipf的药效学研究
[0035]
实验方法：以博莱霉素诱导的肺纤维化动物模型评价s1p1调节剂对ipf的药效学作用。通过给c57bl/6小鼠气管内单次注射博莱霉素(3mg/kg/)，建立博莱霉素诱导的肺纤维化动物模型。在造模后第10天(疾病高峰期)开始分组给药，分为假手术组(sham)、博莱霉素组(bleomycin)、博莱霉素+fty720组(bleomycin+1mg/kg fty720)、博莱霉素+艾托莫德低剂量组(bleomycin+0.3mg/kg艾托莫德)、博莱霉素+艾托莫德高剂量组(bleomycin+1mg/kg艾托莫德)，每组动物15-25只，其中假手术组和博莱霉素组给予等体积溶剂对照—双蒸水。造模后第28天结束实验，按照本领域公知的方法评价生存率、肺重指数(肺重/体重*1000)、肺功能，进行he染色以及masson染色对肺部炎症和纤维化情况进行病理学评价，应用全自动血细胞分析仪测定动物支气管肺泡灌洗液中淋巴细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细
胞等炎症细胞数量。
[0036]
实验结果：造模后第28天结束实验时，模型组动物死亡率已高达66％；而艾托莫德能够显著延长动物生存期，0.3mg/kg组中16只动物仅出现一只死亡，生存率显著提高。fty720虽然能够一定程度提高动物生存率，但与模型相比无统计学意义(见图1a)。肺重指数可以从一定程度上反应动物肺部的纤维化程度，研究表明，艾托莫德能够显著降低模型动物的肺重指数，几乎接近假手术组动物水平，而fty720组动物的肺重指数较模型组没有任何改善(见图1b)。肺功能的各项指标也显示，艾托莫德几乎对各项肺功能指标都有明显改善，很多指标均已恢复到了正常动物水平，而fty720仅对8项指标中的3项有一定的改善作用，甚至有增加动态阻力的趋势(见图2)。病理学检测检测进一步证实，艾托莫德可以显著降低模型动物肺部的炎症损伤以及纤维化程度(见图3-4)。上述研究结果提示，靶向调节s1p1能够对肺纤维化产生明确且显著的治疗作用，s1p1很有希望成为治疗ipf的靶点。
[0037]
动物支气管肺泡灌洗液的检测结果显示，同为s1p1调节剂，艾托莫德和fty720均能够显著降低肺部浸润的淋巴细胞、嗜酸性粒细胞等炎症细胞含量(见图5)。根据发明人研究团队以往的实验研究，单纯应用免疫抑制类药物及激素多不能够显著改善动物的生存期，而艾托莫德改善生存期的作用非常显著，与以往研究中应用的已上市阳性药物吡非尼酮作用相当或更优。吡非尼酮作为ipf的现有临床治疗药物虽然作用机制不明，但研究发现它能够同时起到抗炎、抑制成纤维细胞增殖、抑制基质沉积的作用，达到了不错的疗效。因此提示，艾托莫德在抑制炎症的同时，必然调控了其他更为重要的途径才能发挥如此显著疗效。
[0038]
实验例3：s1p1调节剂对肺泡毛细血管内皮屏障功能的影响
[0039]
3.1s1p1调节剂对肺纤维化动物模型肺部紧密连接蛋白zo-1表达的影响
[0040]
实验方法：按照实施例2中所述方法构建博莱霉素诱导的肺纤维化动物模型，并采用相同的分组、给药方法。western blot法检测各组动物肺部紧密连接蛋白zo-1的表达情况。小鼠处死并剥离肺组织，置冰上称取50mg左右同一位置组织样本于2ml圆底epp管。每个样品加入500μl ripa裂解液(含1％蛋白酶抑制剂cocktail)并放入小钢珠，置于组织匀浆机50hz匀浆60秒。之后置冰上30min,并每隔10分钟涡旋振荡。12000rpm，4℃离心20min，取上清进行bca法蛋白定量并加入上样缓冲液煮沸变性。使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(sds-page)进行蛋白电泳，并用湿转法进行转膜。5％脱脂牛奶室温封闭1h，zo-1一抗(1：1000)4℃孵育过夜。相应山羊抗兔辣根过氧化物酶标二抗(1：2000)室温孵育1h,使用化学发光成像仪(天能，上海)进行蛋白条带成像。
[0041]
实验结果：体内动物实验研究表明，肺纤维化动物肺部的紧密连接蛋白zo-1表达出现了大幅度降低，大部分模型动物已很难检测到该蛋白的表达。艾托莫德可以显著提高zo-1的表达量，恢复至正常动物水平。而fty720对已降低的zo-1作用不明显(见图6a)。该结果首次证明，选择性激动s1p1，能够促进血管内皮紧密连接。
[0042]
3.2s1p1调节剂对人脐静脉内皮细胞的细胞间紧密连接的影响
[0043]
实验方法：confocal检测鬼笔环肽标记的血管内皮细胞骨架。艾托莫德-p/fty720-p用dmso配置为2mm的储存液。将人脐静脉血管内皮细胞ea.hy926(4万个细胞/孔/200ul)接种于预涂纤维粘连蛋白涂层的8孔细胞培养载玻片上，置于37℃，5％co2细胞培养箱孵育过夜。将2mm艾托莫德p/fty720-p储存液用ea.hy926细胞培养基稀释为1μm。弃去需
药物处理3h的细胞内培养基，加入200μl相应艾托莫德-p/fty720-p及含0.1％dmso的空白对照，于细胞培养箱孵育2h。之后在需药物处理1h的细胞内按上述操作加入相应药物，于细胞培养箱继续孵育1h。参照罗丹明-鬼笔环肽使用说明4％多聚甲醛固定细胞10分钟，随后用0.1％triton x-100打孔。罗丹明-鬼笔环肽避光孵育15min后用dapi染细胞核。使用共聚焦显微镜(600
×
)选取代表性视野进行图像采集。
[0044]
实验结果：在体外培养的人脐静脉内皮细胞ea.hy926中观察到，单纯给予艾托莫德能够显著增加细胞间的紧密连接，而fty720对此无明显影响。在体外水平说明，艾托莫德能够促进血管内皮细胞间的紧密连接(见图6b)。
[0045]
3.3s1p1调节剂对小鼠腹腔毛细血管渗漏的影响
[0046]
实验方法：地塞米松/fty720/艾托莫德均用0.5％cmc-na配制。在实验第0天将雄性昆明小鼠(22-25g)随机分为对照组，地塞米松(0.5mg/kg)组，fty720(0.3/3mg/kg)组以及艾托莫德(0.3/3mg/kg)组并开始给药。每组7-9只。各组均连续灌胃给药7天，每日一次。给药第七天造模并处理动物。在动物处理前90分钟，按0.3ml/20g尾静脉注射1％伊文思蓝并随后立即腹腔注射1％醋酸(0.1ml/10g)。之后麻醉动物并腹腔灌注4ml生理盐水。收集腹腔灌洗液并在590nm波长处读取吸光度值。
[0047]
实验结果：预防性给予艾托莫德能够显著抑制醋酸诱导的小鼠腹腔毛细血管渗漏，作用强度与阳性药地塞米松相当，而fty720对此无显著影响(图6c)。
[0048]
该实施例的研究结果进一步提示，靶向调节s1p1可以在体内水平增加血管内皮紧密连接，防止血管渗漏，而如若同时激动s1p3，这种保护作用会被抵消。实验例4：艾托莫德对肺泡上皮细胞间质转化的影响
[0049]
实验方法：按照实施例2中所述方法构建博莱霉素诱导的肺纤维化动物模型，并采用相同的分组、给药方法。western blot法检测各组动物肺部上皮标志物血管内皮跨膜钙粘蛋白(e-ecadherin)、间质标志物波形蛋白(vimentin)、转化生长因子(tgf-β)的蛋白表达。实验方法参照实验例3。
[0050]
实验结果：艾托莫德可以显著上调模型动物肺部上皮标志物e-ecadherin的表达，下调间质标志物vimentin的表达，并能够显著抑制tgf-β的水平(见图7)。上述研究结果提示，靶向s1p1可能通过逆转肺泡上皮的间质转化过程改善ipf。
[0051]
综上所述，实验研究表明本发明式(i)所示的艾托莫德对ipf有显著的治疗作用，为临床治疗提供了新的药物选择。发明人通过深入研究，首次提出s1p1可能是治疗ipf潜在的药物作用靶点，不但拓宽了s1p1调节剂的治疗领域，更为ipf的治疗提供了新策略与新思路，通过深入阐明s1p1基于促进内皮细胞紧密连接、抑制上皮细胞间质转化，从而保护毛细血管屏障(毛细血管屏障主要由内皮细胞、上皮细胞和各自基底膜构成)功能，治疗ipf的作用机制，为其后期的研究及临床应用提供了科学有力的理论依据和实验基础。