本发明涉及一种用于预防sars-cov-2感染的腺病毒载体疫苗。
背景技术：
从2019年12月武汉市公布多例新型冠状病毒肺炎病例后，疫情发展迅速，全国31个省区出现确诊病例，其他28个国家也发现确诊病例。新型冠状病毒sars-cov-2的潜伏期可长达24天，传染性强，与引发非典的sars病毒不同，部分病例潜伏期具有传染性，另有一些病毒携带者没有表现出任何明显症状。这对疫情的防控增加了难度。因此，快速研制出能够提升群体免疫水平并阻断病毒传播的预防疫苗已成为我国当前最为紧迫的重大需求。
针对新型冠状病毒，目前国内外尚无明确验证的特效抗病毒药物和预防性疫苗。因此做好预防，阻断病毒的传播是控制疫情的关键。而疫苗的应用已在消除多种传染病中发挥了不可替代的作用。已公布的十几个sars-cov-2病毒基因组比对的结果显示病毒之间的差异非常小，目前还没发现发生变异。因此，如果sars-cov-2疫苗研发成功，必将能在很大程度上抑制新疫情的暴发。
腺病毒是疫苗研发与基因治疗中常用的载体，被广泛应用于生物医学领域。与其它载体(如细菌或其它病毒)相比，腺病毒的毒性低，感染腺病毒只引起轻微的感冒症状。ad5空载体病毒为缺失e1和e3区基因的复制缺陷型ad5载体，不携带任何外源基因。以ad5为载体的基因治疗产品已在多个临床试验上证实了其安全性。
sars-cov-2的全序列如nc_045512.2所示，该序列的21563..25384核酸为刺突蛋白(spikeprotein，s)的编码序列。s蛋白是病毒粒子的一种主要结构蛋白，在介导病毒粒子与宿主细胞受体的结合以及诱导中和抗体中起重要作用。因此，以s蛋白为抗原的疫苗，包括核酸疫苗，亚单位疫苗和病毒载体疫苗，其s蛋白的表达水平、蛋白结构决定了疫苗的有效性。
然而实验表面，天然的sars-cov-2的刺突蛋白s基因在人体内的表达量较低，如果以原始的s密码子来表达为抗原，不足以产生足够的抗原，其疫苗可能无效或是效价很低，不足以抵抗病毒的感染。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种优化的s蛋白核酸序列。该核酸序列在1)dna质粒；2）整合到腺病毒载体之后，转染人细胞株后可以表达生产更多的s蛋白，有望作为核酸疫苗或重组病毒疫苗的抗原基因，用于预防sars-cov-2感染。
本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供：
一种用于预防sars-cov-2感染的疫苗，所述疫苗包括：
a)如seqidno：1所示的核酸序列；或
b)具有与seqidno：1至少85％，优选90%、95%、98%序列相同性的核酸序列。
在一些实例中，所述核酸序列可在人源细胞或人体内表达蛋白。
在一些实例中，所述蛋白可在人体内：
诱导免疫应答；或
产生生物报告分子；或
用于检测的追踪分子；或
调节基因功能；或
作为治疗性分子。
所述诱导免疫应答包括抗体与细胞介导的免疫应答；
在一些实例中，所述疫苗还包括药学上可接受的佐剂、载体、稀释剂或赋形剂。
在一些实例中，所述疫苗还包括至少一种对covid-19有治疗作用的药物。
本发明的第二个方面，提供：
一种表达载体，所述的载体含有本发明第一方面所述的核酸序列。
在一些实例中，本发明第一方面所述的核酸序列转录方向与所述载体其它基因的转录方向相反。这样可以进一步保证表达得到的蛋白具有更高的纯度。
在一些实例中，所述的载体为dna质粒或rna表达质粒或病毒载体。
在一些实例中，所述的病毒载体为腺病毒载体。特别的，所述腺病毒载体为复制缺陷型ad5载体。
本发明的第三个方面，提供：
本发明第一方面所述的疫苗的应用，所述应用包括：
制备covid-19检测试剂；
制备基因功能调节剂。
本发明的有益效果是：
本发明一些实例的疫苗，其含有的s蛋白核酸序列易于在人体细胞表达，可以诱导产生更多的s蛋白，有望作为一种重组病毒疫苗，用于预防sars-cov-2感染。
本发明的一些实例，具有较好的安全性。
附图说明
图1是含有密码子优化的s基因核酸序列的质粒转染人源细胞后表达s蛋白的检测结果。
图2是动物免疫原性评价的实验结果，表明ad5-nb2能够诱异小鼠产生抗体。
具体实施方式
sars-cov-2的刺突蛋白(spikeprotein，s)的氨基酸序列如yp_009724390.1所示，记为nb1。
真核细胞转录的mrna前体能够通过不同剪接方式（选择不同的剪接位点组合）产生不同的mrna剪接异构体的过程，最终导致同一个基因序列产生的不同的蛋白质。这对蛋白的表达是非常不利的。发明人通过对野生型的天然核酸序列进行密码子优化，同时基于自有技术去除潜在的可变剪切位点，保证了蛋白表达的唯一性，减少了蛋白后续纯化的难度。优化得到的核酸序列记为nb2，其具体序列如seqidno：1所示：
atgttcgtgtttctggtgctgctgcctctggtgagctcccagtgcgtgaacctgaccacaaggacccagctgccacctgcctataccaatagcttcacacggggcgtgtactatcccgacaaggtgtttagatctagcgtgctgcactccacccaggatctgtttctgcctttcttttctaacgtgacatggttccacgccatccacgtgtccggcaccaatggcacaaagcggttcgacaatccagtgctgccctttaacgatggcgtgtacttcgcctccaccgagaagtctaacatcatcagaggctggatctttggcaccacactggacagcaagacccagtccctgctgatcgtgaacaatgccacaaacgtggtcatcaaggtgtgcgagttccagttttgtaatgatcccttcctgggcgtgtactatcacaagaacaataagtcttggatggagagcgagtttagggtgtattcctctgccaacaattgcacctttgagtacgtgagccagcctttcctgatggacctggagggcaagcagggcaatttcaagaacctgagggagttcgtgtttaagaatatcgatggctacttcaagatctactccaagcacacaccaatcaacctggtgcgcgacctgccacagggcttctctgccctggagccactggtggatctgcccatcggcatcaacatcacccggtttcagacactgctggccctgcacagaagctacctgaccccaggcgacagctcctctggatggacagcaggagctgccgcctactatgtgggctatctgcagccccgcaccttcctgctgaagtacaacgagaatggcaccatcacagacgcagtggattgcgccctggaccccctgtctgagaccaagtgtacactgaagagctttacagtggagaagggcatctaccagaccagcaacttcagggtgcagccaacagagtccatcgtgcgctttcccaatatcaccaacctgtgcccttttggcgaggtgttcaatgccacacgcttcgccagcgtgtacgcctggaataggaagcgcatctccaactgcgtggccgactattctgtgctgtacaacagcgcctccttctctacctttaagtgttatggcgtgagccccaccaagctgaatgatctgtgctttacaaacgtgtacgccgattccttcgtgatcaggggcgacgaggtgcgccagatcgcaccaggacagaccggcaagatcgcagactacaattataagctgcctgacgatttcacaggctgcgtgatcgcctggaactctaacaatctggatagcaaagtgggcggcaactacaattatctgtaccggctgtttagaaagtctaatctgaagccattcgagcgggacatctccaccgagatctaccaggccggctctacaccctgcaatggcgtggagggctttaactgttatttccctctgcagtcctacggcttccagccaaccaacggcgtgggctatcagccctacagagtggtggtgctgtcttttgagctgctgcacgcacctgcaaccgtgtgcggcccaaagaagagcacaaatctggtgaagaacaagtgcgtgaacttcaacttcaacggactgaccggcacaggcgtgctgaccgagagcaacaagaagttcctgccatttcagcagttcggcagggacatcgcagataccacagacgccgtgcgcgaccctcagaccctggagatcctggacatcacaccatgttccttcggcggcgtgtctgtgatcaccccaggcaccaatacatccaaccaggtggccgtgctgtatcaggacgtgaattgcacagaggtgcccgtggcaatccacgcagatcagctgacccctacatggcgggtgtactctaccggcagcaacgtgttccagacaagagccggatgcctgatcggagcagagcacgtgaacaatagctatgagtgcgacatccctatcggcgccggcatctgtgcctcctaccagacccagacaaactccccaaggagagcccggtctgtggccagccagtccatcatcgcctataccatgagcctgggcgccgagaacagcgtggcctactccaacaattctatcgccatccctaccaacttcacaatcagcgtgaccacagagatcctgccagtgagcatgaccaagacatccgtggactgcaccatgtatatctgtggcgattccacagagtgttctaacctgctgctgcagtacggctccttttgcacccagctgaatagagccctgacaggcatcgccgtggagcaggacaagaacacccaggaggtgttcgcccaggtgaagcagatctacaagacaccacccatcaaggactttggcggcttcaacttcagccagatcctgcccgatcctagcaagccatccaagcggtcttttatcgaggacctgctgttcaacaaggtgaccctggccgatgccggcttcatcaagcagtatggcgattgtctgggcgacatcgccgccagagacctgatctgcgcccagaagtttaatggcctgaccgtgctgcctccactgctgacagatgagatgatcgcacagtacacctctgccctgctggccggcaccatcacaagcggatggacattcggcgcaggagccgccctgcagatcccctttgccatgcagatggcctatcggttcaacggcatcggcgtgacccagaatgtgctgtacgagaaccagaagctgatcgccaatcagtttaacagcgccatcggcaagatccaggactctctgagctccaccgccagcgccctgggcaagctgcaggatgtggtgaatcagaacgcccaggccctgaatacactggtgaagcagctgtctagcaacttcggcgccatctcctctgtgctgaatgacatcctgagccggctggacaaggtggaggcagaggtgcagatcgaccggctgatcaccggcagactgcagtccctgcagacctacgtgacacagcagctgatcagggcagcagagatcagggcctctgccaatctggccgccacaaagatgagcgagtgcgtgctgggacagtccaagagggtggacttttgcggcaagggctatcacctgatgagcttcccacagtccgcccctcacggagtggtgtttctgcacgtgacctacgtgccagcccaggagaagaacttcaccacagcccccgccatctgtcacgatggcaaggcccactttcctagggagggcgtgttcgtgagcaacggcacccactggtttgtgacacagcgcaatttctacgagccacagatcatcaccacagacaataccttcgtgtccggcaactgcgacgtggtcatcggcatcgtgaacaatacagtgtatgatcctctgcagccagagctggactcttttaaggaggagctggataagtacttcaagaatcacaccagccccgacgtggatctgggcgacatctctggcatcaatgccagcgtggtgaacatccagaaggagatcgacagactgaacgaggtggccaagaatctgaacgagagcctgatcgatctgcaggagctgggcaagtatgagcagtacatcaagtggccctggtatatctggctgggcttcatcgccggcctgatcgccatcgtgatggtgaccatcatgctgtgctgtatgacaagctgctgttcctgcctgaagggctgctgttcttgtggcagctgctgtaagtttgatgaggacgattccgagcctgtgctgaagggcgtgaagctgcactacacctaa（seqidno.：1）。
为了降低基因的gc含量，发明人在nb2基础上进一步将密码子优化，合成的序列命名为nb4，具体如下seqidno.：2所示，nb4和nb2的序列相同性为85.93%。
atgtttgtcttcctggtgctgctgcctctggtctcttctcagtgtgtgaacctgaccaccaggacacagctgcctcctgcttacaccaactccttcacacggggcgtctactaccctgacaaggtcttcaggtcctctgtgctgcactccacacaagacctgttcctgccattcttctccaacgtgacctggttccatgccatccatgtctctggcaccaatggcaccaagaggttcgacaaccctgtgctgccattcaacgacggcgtctactttgcctccaccgagaagtccaacatcatcaggggctggatctttggcaccaccctggactccaagacccagtccctgctgattgtgaacaatgccaccaacgtggtgatcaaagtctgcgagttccagttctgcaatgacccattcctgggcgtctactaccacaagaacaacaagtcctggatggagtctgagttcagggtctactcctctgccaacaactgcacctttgaatatgtctcccagccattcctgatggacctggagggcaagcagggcaacttcaagaacctgagggagttcgtcttcaagaacatcgacggctacttcaagatctactccaagcacacacccattaatctcgtccgggatctgcctcagggcttctctgccctggagcccctggtggacctgcccattggcatcaacatcacacgctttcagaccctgctggctctgcaccggtcttacctgacacctggcgactcctcctctggctggacagctggcgctgctgcctactatgtcggctacctgcagcctaggaccttcctgctgaagtacaatgagaatggcaccatcacagatgctgtggactgtgccctggaccccctgtctgagaccaagtgcaccctgaagtccttcacagtcgagaagggcatctaccagacctccaacttccgggtgcagcccacagagtccattgtcaggttccccaacatcaccaacctgtgcccatttggcgaggtcttcaatgccacacgctttgcctctgtctatgcctggaacaggaagaggatctccaactgtgtggctgactactctgtgctgtacaactctgcctccttctccacatttaagtgctatggcgtctcccccaccaagctgaatgacctgtgcttcaccaatgtctatgctgactcctttgtgatccggggcgatgaagttaggcagattgcccctggccagacaggcaagattgctgactacaactacaagctgcctgatgacttcaccggctgtgtgattgcctggaactccaacaacctggactctaaagttggcggcaactacaactacctgtacaggctgttcaggaagtccaacctgaagccatttgagagggacatctccacagagatctaccaggctggctccaccccatgcaatggcgtggagggcttcaactgctacttccccctgcaatcctatggcttccaacccaccaatggcgtgggctaccagccatacagggtggtggtgctgtcctttgagctgctgcatgcccctgccaccgtctgtggccccaagaagtccaccaacctcgtgaagaacaaatgtgtgaacttcaacttcaacggcctgacaggcacaggcgtgctgacagagtccaacaagaagttcctgccattccaacagtttggcagggacattgctgacaccaccgatgctgtcagggacccccagaccctggagatcctggacatcaccccatgctcctttggcggcgtctctgtgatcacccctggcaccaacacctctaatcaagtcgctgtgctgtaccaggacgtgaactgcacagaggttcctgtggccatccatgctgaccagctgacccccacctggagggtctactccaccggctccaatgtcttccaaacacgggctggctgcctgattggcgctgagcatgtgaacaactcctatgagtgtgacatccccattggcgctggcatctgtgcctcctaccaaacccagaccaactcccctcggagggctcgctctgtggcttctcagtctatcattgcctacaccatgtccctgggcgctgagaactctgtggcctactccaacaactccattgccatccccaccaacttcaccatctctgtgaccaccgagatcctgcctgtctccatgaccaagacctctgtggactgcaccatgtacatctgtggcgactccacagagtgctccaacctgctgctgcagtatggctccttctgcacccaactgaacagggccctgacaggcattgctgtggagcaggacaagaacacccaggaggtctttgcccaagtcaagcagatctacaagaccccccccatcaaggactttggcggcttcaacttctcccaaatcctgcctgacccatccaagccatccaagaggtccttcattgaggacctgctgttcaacaaggttaccctggctgatgctggcttcatcaagcagtatggcgactgcctgggcgacattgctgccagggacctgatctgtgcccaaaagttcaatggcctgacagtgctgccccccctgctgaccgatgagatgattgcccagtacacatctgctctgctggctggcacaatcacctctggctggacctttggcgctggcgctgccctgcaaatcccatttgccatgcaaatggcctacaggttcaatggcattggcgtgacccagaacgtgctgtatgagaaccagaagctgattgccaaccagttcaactctgccattggcaagatccaggactccctgtcctccaccgcctctgccctgggcaagctgcaggatgtggtgaaccagaatgcccaggccctgaacaccctggtgaagcagctgtcctccaactttggcgccatctcctctgtgctgaatgacatcctgtcccggctggacaaggtggaggctgaggtgcagattgacaggctgatcacaggcaggctgcagtccctgcaaacctatgtgacccagcagctgatcagggctgctgagatcagggcctctgccaacctggctgccaccaagatgtctgaatgtgtgctgggccagtccaagagggtggacttctgtggcaagggctaccatctgatgtccttcccccaatctgccccccatggcgtggtcttcctgcatgtgacctatgtgcctgctcaggagaagaacttcaccacagcccctgccatctgccatgatggcaaggcccacttccctcgggagggcgtctttgtctccaatggcacccactggtttgtgacccagaggaacttctatgagcctcagatcatcaccacagacaacacctttgtctctggcaactgtgatgtggtgattggcattgtgaacaacacagtctatgaccccctgcagcctgagctggactccttcaaagaggagctggacaagtacttcaagaaccacacctcccctgatgtggacctgggcgacatctctggcatcaatgcctctgtggtgaacatccagaaggagattgacaggctgaatgaggtggccaagaacctgaatgagtccctgattgacctgcaagagctgggcaagtatgagcagtacatcaagtggccatggtacatctggctgggcttcattgctggcctgattgccattgtgatggtgaccatcatgctgtgctgcatgacctcctgctgctcctgcctgaaaggctgctgctcctgtggctcctgctgcaagtttgatgaggatgactctgagcctgtgctgaagggcgtgaagctgcactacacctaataa（seqidno.：2）
spike基因表达载体的构建：
分别以nb1，nb2和nb4为模板，以nb1-f和nb1-r为引物pcr扩增获得nb1片段，以nb2-f和nb2-r为引物pcr扩增获得nb2片段，以nb4-f和nb4-r为引物pcr扩增获得nb4片段后，再分别以各cmv-r和bgh-f为引物，以本公司已有的pga1-egfp质粒为模板，pcr扩增载体质粒骨架pga1后，采用同源重组酶（exnase）分别与nb1，nb2和nb4片段进行体外二片段重组，得到pga1-nb1，pga1-nb2和pga1-nb4。将pga1-nb2采用bstz17i和sgarai线性化，采用bj5183感受态与对应删除e1区唯一酶切位点酶切线性化的pad5△e1△e3(即ad5空载体)进行同源重组，构建pad5-nb2疫苗载体。
扩增nb1的引物序列：
nb1-f：gcgtttaaacttaagcttggtaccgagctcggatccgccaccatgtttgtttttcttgt（seqidno.：3）
nb1-r：agaatagggccctctagactagtttatgtgtaatgtaatttg（seqidno.：4）
扩增nb2的引物序列：
nb2-f：gcgtttaaacttaagcttggtaccgagctcggatccgccaccatgttcgtgtttctggt（seqidno.：5）
nb2-r：agaatagggccctctagactagtttatcaggtgtagtgcagcttc（seqidno.：6）
扩增nb4的引物序列：
nb4-f：gcgtttaaacttaagcttggtaccgagctcggatccgccaccatgtttgtcttcctggt（seqidno.：7）
nb4-r：agaatagggccctctagactagtttaggtgtagtgcagcttc（seqidno.：8）
扩增pga1的引物序列：
bgh-f:tctagagggccctattctatagtgtc（seqidno.：9）
cmv-r:ggatccgagctcggtaccaagcttaagtttaaacgctagagtccgg（seqidno.：10）
pcr条件：95℃，3min;95℃，30s；60℃30s；72℃2min；cycles30；72℃，5min。
ad5-nb2载体的拯救与生产
1)按照常规方法，pad5-nb2以asisi线性化，乙醇沉淀回收，阳离子脂质体转染法转染293细胞，转染后8小时，加入2毫升含5%胎牛血清的dmem培养基，孵育7-10天，观察细胞病变；
2)出毒后，收集细胞及培养上清，在37度水浴及液氮中反复冻融3次并离心去除细胞碎片，上清感染10厘米皿；
3)2-3天后，收集细胞及培养上清，反复冻融3次并离心去除细胞碎片，上清感染3-5个15厘米皿；
4)2-3天后，收集细胞，反复冻融3次并离心去除细胞碎片；上清感染30个15厘米皿2-3天后，收集细胞，反复冻融3次并离心去除细胞碎片；
5)上清加至氯化铯密度梯度离心管；4℃，40000转，离心4小时；
6)吸出病毒条带，脱盐，分装。
以od260吸光度测定病毒粒子滴度，计算公式为：病毒浓度=od260×稀释倍数×36/基因组长度(kb)；病毒储存液于-80℃冻存。
检测spike基因表达：
按照常规方法，利用阳离子脂质体，分别将2.5ug的pga-nb1，pga-nb2和pga-nb4转染48小时后，收集细胞。用ad5-nb2和ad5空载体病毒侵染hek293细胞，24h后收集细胞。上述四个样品按照常规的westernblot方法处理样品，并进行蛋白检测（图1）。
可以看出，pga1-nb1样品中没有检测到s蛋白的表达，而经过密码子优化的pga1-nb2、pga1-nb4和疫苗候选株ad5-nb2样品中能够观察到s蛋白的表达，说明nb2的序列具有意料之外的效果。pga1-nb4也可以观察到s蛋白的表达，说明与nb2至少85%以上，进一步为86%、90%、95%、98%以上序列相同性的核酸序列均能有限表达相应的蛋白。
动物免疫原性评价
6-8周龄balb/c小鼠分为5组，每组5只；第0天，分别肌注免疫ad5-nb2剂量：5×109vp/只，采用肌注和滴鼻两种接种方式；第8天，眼眶取血并分离血清。采用酶联免疫吸附测定（elisa），以新冠病毒的s蛋白为抗原检测血清中的抗体水平。具体操作为：
1)96孔板，每孔加100ul的pbs和50ngs蛋白，4℃过夜，16-18小时；
2)吸掉上清，pbst洗一遍，加入200ul5%脱脂牛奶室温封闭2h；
3)pbst洗2次；
4)加样：加入100ul稀释后的血清样品，37℃孵育2h，用pbst洗5次；
5)加酶标抗体：加入100ul稀释后hrp标记igm或igg二抗，37℃孵育2h；
6)pbst洗6-8次；
7)加底物液显色：加入100ultmb显色；
8)终止反应：加入50ul1m硫酸终止反应；
9)结果判定：测od值，od值控制在0.1-4。
实验结果表明，ad5-nb2能够诱异小鼠产生抗体（图2）。
sequencelisting
<110>广州恩宝生物医药科技有限公司
<120>一种用于预防sars-cov-2感染的腺病毒载体疫苗
<130>
<160>10
<170>patentinversion3.5
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<212>dna
<213>人工序列
<400>1
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