一种间苯三酚类化合物在制备治疗痛风性关节炎的药物中的应用的制作方法

本发明涉及一种间苯三酚类化合物bf-2对痛风性关节炎的治疗用途。

背景技术：

痛风性关节炎是一种由单钠尿酸盐(msu)晶体沉积关节引起的关节性疾病。在临床上，常将抗炎性药物如皮质类固醇、非甾体抗炎药(nsaids)和秋水仙碱用于痛风治疗，便于缓解患者关节肿胀和疼痛。msu诱导的痛风性关节炎小鼠模型普遍应用于抗痛风药物和nlrp3炎性小体活化研究^[1-4]。

痛风和类风湿性关节炎病理过程完全不同，治疗药物和靶点也不相同。类风湿性关节炎(rheumatoidarthritis，ra)是一种慢性和全身性自身免疫性疾病，主要特点是关节持续发生滑膜炎、退行性软骨和骨破坏以及产生自身抗体。类风湿性关节炎是由于环境因素、遗传或免疫紊乱等引起体内免疫细胞活化，释放大量炎症因子，启动机体特异性免疫应答，从而导致相应的关节炎症状。痛风性关节炎是一种常见的关节性疾病，通常表现为一种急性、自限性的炎症性关节炎。血清msu水平升高(高尿酸血症)是msu晶体沉积和痛风发展的主要危险因素之一，近5％高尿酸患者最后发展形成痛风^[5]。近年来痛风的患病率不断上升，发病主要与尿酸钠晶体沉积关节有关，严重影响患者的运动能力和生活质量^[34]。痛风是由于嘌呤代谢紊乱引起的，黄嘌呤氧化酶(xod)是一种尿酸生成的限速酶，介导腺嘌呤氧化形成尿酸，因此xod是治疗痛风和高尿酸的重要靶点^[6]。xod抑制剂包括非布索坦和别嘌呤醇已被开发为临床上常用的抗高尿酸血症药物，但是非布索坦和别嘌呤醇有严重的副作用，而且对于急性痛风是无效的^[7-8]。同时，肠道和肾脏中尿酸盐转运的改变在高尿酸血症的发病机理中具有关键作用，因此靶向尿酸盐转运也是抗痛风治疗的另一重要靶点，如尿酸吸收抑制剂苯溴马隆、urt1抑制剂雷西纳德等。另一方面，临床常将抗炎性药物如皮质类固醇、非甾体抗炎药(nsaids)和秋水仙碱用于痛风治疗，但长期服用其也具有严重的胃肠道及肝脏毒性等副反应^[9-10]。

研究表明促炎细胞因子il-1β在痛风性关节炎的病理过程中起着关键作用，msu沉积于关节并与巨噬细胞结合活化nlrp3炎性小体，导致il-1β释放^[9,11]。目前，临床表明靶向于il-1β的生物制剂能够预防痛风的首次和进一步发作，并且对痛风患者具有一定的治疗作用[10,11]。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种间苯三酚类化合物在制备治疗痛风性关节炎的药物中的应用。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

式i所示的化合物bf2在制备治疗痛风性关节炎的药物中的应用，

化学名：

5,7-dihydroxy-8-(1-(2-hydroxy-4-methoxy-3,3,5-trimethyl-6-oxocyclohexa-1,4-dien-1-yl)-2-methylpropyl)-6-methyl-2-phenylchroman-4-one。

式i所示的化合物bf2在制备治疗痛风的药物中的应用。

有益效果：

本发明采用小鼠脚垫注射尿酸钠(msu)建立痛风性关节炎模型，通过药效学评价寻找先导化合物，发现了一种间苯三酚类化合物bf-2，为新型的抗痛风性关节炎开发提供先导化合物。本发明可为此类临床抗痛风性关节炎治疗药物的开发提供先导化合物，为新型抗痛风性关节炎药物开发提供线索和实验依据。

本发明实验结果表明小鼠足垫注射msu能够引起足趾肿胀，灌胃给予bf-2能够显著缓解痛风小鼠足趾肿胀，同时也能够降低小鼠足趾组织中il-1β和il-18含量，这些实验结果表明bf-2能够通过靶向于il-1β释放产生抗痛风效应，对痛风治疗具有潜在的价值。nlrp3炎性小体介导的il-1β产生在炎症发生阶段是至关重要的，但是，一旦中性粒细胞进入关节组织，丝氨酸蛋白酶将会发生作用^[11]。本研究病理染色实验结果表明bf-2也能够抑制中性粒细胞浸润关节腔和表皮滑膜组织，这表明bf-2的抗痛风活性可能与阻断nlrp3炎性小体活化。

组织中il-1β的产生受两个信号作用调节，第一个信号是il-1β转录和pro-il-1β合成，第二信号是nlrp3炎性小体活化。第一信号阶段，damp(如游离脂肪酸、msu等)和微生物产物(lps)能够分别通过tlr2/myd88和tlr4/myd88信号通路促进il-1β转录和pro-il-1β合成^[12,13]。本研究实验结果表明痛风小鼠足关节组织中il-1βmrna和pro-il-1β的蛋白水平显著上调，但灌胃给予bf-2能够显著抑制痛风小鼠关节组织中il-1βmrna和pro-il-1β的蛋白表达，这表明bf-2抗il-1β产生活性可能与抑制tlrs介导的第一信号有关。

综上所述，本章实验结果表明本研究首先成功建立了痛风性关节炎小鼠模型，并且表明岗松活性成分bf-2对痛风性关节炎具有潜在的治疗价值。同时，本研究表明岗松活性成分bf-2能够抑制msu刺激引起的il-1β和il-18释放。这些结果表明岗松活性成分bf-2对痛风性关节炎具有潜在的治疗价值，并且能够通过阻断nf-κb信号通路抑制nlrp3炎性小体的活化。

附图说明

图1：先导化合物bf2对痛风性关节炎的行为学结果

图2：先导化合物bf-2对痛风性关节炎的elisa结果

图3岗松活性成分bf-2对痛风小鼠足肿胀度的影响

a)动物干预和造模简图；b)不同时间点痛风小鼠的足肿胀度结果；c)痛风小鼠不同时间点曲线下面积统计结果图(n＝5，与对照组相比，###p<0.001；与模型组相比，**p<0.01，***p<0.001)

图4岗松活性成分bf-2对痛风小鼠组织炎症因子产生的影响

a)痛风小鼠足关节组织il-1β含量；b)痛风小鼠足关节组织il-18含量；c)痛风小鼠足关节组织il-1βmrna相对表达量(n＝5，与对照组相比，###p<0.001；与模型组相比，**p<0.01，***p<0.001)

图5岗松活性成分bf-2对痛风小鼠关节组织病理学的影响(n＝5)

具体实施方式

实施例1

1.1实验材料

实验试剂：尿酸钠，秋水仙碱，羧甲基纤维素钠(cmcna)，化合物bf2(购自成都普瑞法科技开发有限公司，结构确认数据详见cn109718232a)

实验耗材：1ml注射器，游标卡尺

1.2实验方法

痛风性关节炎模型诱导

将c57bl/6小鼠分为对照组(control)、模型组(model)、秋水仙碱(1mg/kg)组、bf-2-h50mg/kg、bf-2-l12.5mg/kg，n＝5，灌胃给药，每天一次，连续一周，对照组和模型组给予等体积的cmcna溶液，最后一次给药后1h，小鼠足垫皮下注射80μl尿酸钠混悬液(100mg/ml)诱导痛风性关节炎模型，对照组注射等体积生理盐水，分别在0h、1h、3h、6h、8h、24h使用电子游标卡尺测量足垫肿胀度。

在24h，小鼠眼球取血，脱颈椎处死，分离关节滑膜组织，匀浆，根据制造商说明使用小鼠elisa试剂盒检测关节滑膜液中il-1β的含量。

1.3体内抗痛风性关节炎实验结果

本实验证明化合物bf2对于痛风性关节炎具有显著的治疗作用，但与阳性药秋水仙碱相比，bf2高剂量组(50mg/kg)组对痛风模型动物足垫肿胀的治疗效果同样显著(图1)，两者对炎性因子标志物il-1β降低水平比模型组均有显著差异(图2)。

实施例2

2.1实验材料

动物：spf级别c57bl/6小鼠，雄性，25只，购买于南京市江宁区青龙山动物繁殖场。

仪器：酶标仪varioskan^tmlux(赛默飞，美国)；steponeplus^tmreal-timepcr仪(赛默飞，美国)；nanodrop2000(赛默飞，美国)；凝胶电泳设备(bio-rad，美国)。

试剂：单尿酸钠(msu，货号：u2875)购买于sigma公司(美国)；秋水仙碱(货号：hy-16569)购买于medchemexpress(上海，中国)；小鼠il-1β(货号：1210122)elisa试剂盒购买于达科为(北京，中国)；il-18(货号：70-ek218-96)elisa试剂盒购买于杭州联科生物技术股份有限公司(杭州，中国)；ripa蛋白裂解液(货号：p0013c)、蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物(货号：p1045)、bca定蛋白试剂盒(货号：p0012)购买于碧云天生物科技有限公司(上海，中国)；trizolrna裂解液(货号：r401-01)、cdna逆转录试剂盒(货号：r223-01)、qpcr试剂盒(货号：q141-02)购买于南京诺唯赞生物科技公司(南京，中国)。

2.2实验方法

2.2.1痛风性关节炎模型建立与药物干预研究

将c57bl/6小鼠分为对照组、模型组、秋水仙碱(1mg/kg)、bf-2-h(50mg/kg)、bf-2(12.5mg/kg)，n＝5，灌胃给药，每天一次，连续一周，对照组和模型组给予等体积的cmcna溶液，最后一次给药后1h，小鼠足垫皮下注射80μl尿酸钠混悬液(100mg/ml)诱导痛风性关节炎模型，对照组注射等体积生理盐水，分别在0h、1h、3h、6h、8h、24h使用电子游标卡尺测量足垫厚度并计算肿胀度。

2.2.2酶联免疫吸附(elisa)法

行为学检测结束后，小鼠脱颈椎处死，剔除踝关节及足趾的皮毛，将足关节组织置于2.0mlep管中，加入0.5ml生理盐水溶液，组织研磨仪匀浆，于10000g4℃离心15min，小心吸取上清于1.5mlep管，采用bca法蛋白定量，取总蛋白量100μg的组织匀浆，根据商用elisa试剂盒制造商说明检测匀浆液中il-1β和il-18蛋白含量。

2.2.3苏木精伊红(he)染色

小鼠脱颈椎处死，剔除小鼠踝关节及足趾的皮毛和肌肉，将踝关节及足趾置于4％多聚甲醛溶液中固定24h，然后放于10％edta脱钙液(ph＝8.0)，脱钙15天，每3天换一次液，然后用石蜡包埋，切成5μm矢状切片，苏木精伊红染色，用显微镜观察关节组织的病理形态。

2.2.4实时荧光定量聚合酶链式反应(qrt-pcr)

2.2.4.1rna提取及逆转录

取小鼠踝关节以下组织，提取rna，逆转录成cdna，储存于-80℃。

2.2.4.2实时荧光定量pcr反应

根据定量pcr检测试剂盒说明书进行实时荧光定量pcr检测，操作简要如下，配制反应体系：10μlaceq^tmqpcrgreenmastermix，0.8μlroxdye1，0.8μl引物，8.4μlcdna。加入96孔板，置于absteponeplusrt-pcrsystem仪器于95℃预变性5min，95℃变性10s，60℃延伸30s，重复40个循环，最后根据2^-δδct法计算目的基因的相对表达量，引物见表1。

表1引物序列

2.2.5蛋白免疫印迹(westernblot)法

采用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，电泳条件：80v，30min；120v，60min，随后将电泳分离的蛋白转移至聚偏氟乙烯(pvdf)膜，转膜条件：100v，90min，然后采用5％bsa室温封闭60min，tbst溶液洗涤5次，5min/次，随后用特异性一抗(抗体来源及应用见表4-1)4℃孵育过夜，tbst溶液洗涤5次，5min/次，用hrp标记山羊抗兔ig和hrp标记山羊抗鼠ig室温孵育90min，tbst溶液洗涤5次，5min/次，用ecl化学发光法显影检测，imagej分析灰度值。

2.2.6统计学分析

所有数据均采用graphpadprism8.0软件分析，结果表示为mean±sem，用one-wayanova和twowayanova进行多组数据的检验，用areaundercurve进行曲线下面积计算，以p<0.05为统计学差异。

2.3实验结果

2.3.1在痛风性关节炎小鼠中，岗松活性成分bf-2对关节炎小鼠足肿胀的影响

从注射msu开始第1h检测，足肿胀结果表明与对照组相比，模型组小鼠足肿胀度显著增加，持续至第6h，后面略有缓解，但依然显著大于对照组，差异有统计学意义(p<0.05)；与模型组相比，bf-2-l低剂量组小鼠足肿胀度与模型组同时增加，持续至第6h后，低剂量组小鼠足肿胀度显著下降，差异有统计学意义(p<0.05)；从第1h开始，bf-2-h高剂量和秋水仙碱组小鼠足肿胀度均显著小于模型组，持续至实验结束，差异有统计学意义(p<0.05)，见图3和表2。上述结果初步表明本研究成功建立了痛风性关节炎小鼠模型，并表明岗松活性成分bf-2对痛风性关节炎具有潜在治疗作用。

表2岗松活性成分bf-2对痛风小鼠足肿胀度的影响(mean±sem，n＝5)

注：与对照组相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；与模型组相比，##p<0.01，

###p<0.001

2.3.2在痛风性关节炎小鼠中，岗松活性成分bf-2对组织炎症因子产生的影响

il-1βelisa结果表明与对照组相比(30.54±1.82pg/ml)，模型组小鼠足关节组织中il-1β含量显著升高(63.88±1.71pg/ml，p<0.05)；与模型组相比，bf-2高剂量和秋水仙碱组小鼠足关节组织中il-1β含量显著下降(分别为48.76±1.31pg/ml和38.11±1.69pg/ml，p<0.05)，见图4a和表3。il-18elisa结果表明与对照组相比(50.52±9.07pg/ml)，模型组小鼠足关节组织中il-18含量显著升高(166.00±18.36pg/ml，p<0.05)；与模型组相比，bf-2高剂量和秋水仙碱组小鼠足关节组织中il-18含量显著下降(分别为90.80±6.25pg/ml和118.50±10.57pg/ml，p<0.05)，见图4b和表3。il-1βrt-pcr结果表明与对照组相比(1.00±0.14)，模型组小鼠足关节组织中il-1βmrna表达水平显著上调(11.49±0.54，p<0.05)；与模型组相比，bf-2高剂量和秋水仙碱组小鼠足关节组织中il-1βmrna表达水平显著下调(分别为3.28±0.17和3.52±0.27，p<0.05)，见图4c和表3。

表3岗松活性成分bf-2对痛风小鼠组织炎症因子的影响(mean±sem，n＝5)

注：n＝5，与对照组相比，###p<0.001；与模型组相比，**p<0.01，***p<0.001

2.3.3在痛风性关节炎小鼠中，岗松活性成分bf-2对关节组织病理学影响

he染色结果表明对照组小鼠关节组织中，基质分布均匀完整，关节腔无炎性细胞浸润，并且表皮滑膜组织细胞排列紧密均匀，无炎性细胞浸润；模型组小鼠关节组织中，基质完整但有炎性细胞浸润，且关节腔存在大量炎性细胞，同时表皮滑膜组织排列紊乱且有炎性细胞浸润；bf-2高剂量组小鼠关节组织中，基质分布均匀完整且炎性细胞浸润较少，关节腔无炎性细胞浸润，同时表皮滑膜组织细胞排列紧密均匀，炎性细胞浸润减少；秋水仙碱组小鼠关节组织中，基质分布均匀完整，炎性细胞浸润减少，关节腔无炎性细胞浸润，表皮滑膜组织细胞排列较为紧密均匀，炎性细胞浸润减少，见图5。

参考文献

[1].liuhj,panxx,liubq,etal.grapeseed-derivedprocyanidinsalleviategoutpainvianlrp3inflammasomesuppression[j].jneuroinflammation.2017,14(1):74.

[2].huangy,jiangh,cheny,etal.tranilastdirectlytargetsnlrp3totreatinflammasome-drivendiseases[j].embomolmed.2018,10(4).

[79].wuj,luoy,jiangq,etal.coptisinefromcoptischinensisblocksnlrp3inflammasomeactivationbyinhibitingcaspase-1[j].pharmacolres.2019:104348.

[80].heh,jiangh,cheny,etal.oridoninisacovalentnlrp3inhibitorwithstronganti-inflammasomeactivity[j].natcommun.2018,9(1):2550.

[5].igeltf,krasnokutskys,pillingermh.recentadvancesinunderstandingandmanaginggout[j].f1000res.2017,6:247.

[6].mandalak,mountdb.themolecularphysiologyofuricacidhomeostasis[j].annurevphysiol.2015,77:323-345.

[7].sattuise,gaffoal.treatmentofhyperuricemiaingout:currenttherapeuticoptions,latestdevelopmentsandclinicalimplications[j].theradvmusculoskeletdis.2016,8(4):145-159.

[8].hilmiba,asmahanmi,rosmana.useofnewlyavailablefebuxostatinacaseofchronictophaceousgoutcontraindicatedtoallopurinolandprobenecid[j].2012,67(1):125.

[9].dalbethn,choihk,joostenlab,etal.gout[j].natrevdisprimers.2019,5(1):69.

[10].igeltf,krasnokutskys,pillingermh.recentadvancesinunderstandingandmanaginggout[j].f1000res.2017,6:247.

[11].martinonf,petrilliv,mayora,etal.gout-associateduricacidcrystalsactivatethenalp3inflammasome[j].nature.2006,440(7081):237-241.

[12].giamarellos-bourboulisej,mouktaroudim,bodare,etal.crystalsofmonosodiumuratemonohydrateenhancelipopolysaccharide-inducedreleaseofinterleukin1βbymononuclearcellsthroughacaspase1-mediatedprocess[j].annrheumdis.2009,68(2):273.

[13].joostenla,neteamg,mylonae,etal.engagementoffattyacidswithtoll-likereceptor2drivesinterleukin-1betaproductionviatheasc/caspase1pathwayinmonosodiumuratemonohydratecrystal-inducedgoutyarthritis[j].arthritisrheum.2010,62(11):3237-3248.