一种药物组合物及其应用的制作方法

本发明属于医药
技术领域：
，特别涉及一种药物组合物及其应用。
背景技术：
：阿尔兹海默症(ad)，俗称为老年痴呆，是一种发病隐匿的进行性发展的中枢神经系统(cns)退化性疾病，以神经炎性斑(老年斑，sp)、神经原纤维缠结(nft)、神经原缺失、胶质增生和β-淀粉样蛋白(aβ)沉积等为其典型病理特征。该病症的主要临床表现为记忆、认知功能和语言的障碍，以及人格的改变，严重的影响社交、职业与生活功能，同时亦是一种高死亡率的神经退化性疾病。该病从被发现到现在已有上百年的历史，因为其发病机制复杂，所以截止到目前，其发病机制仍未被揭示。目前对用于ad诊断与治疗评价的生物标记物的研究和探索已成为热点。在ad患者的脑组织中发现了有关和学习记忆等相关的神经递质失调等现象，该类神经递质主要有乙酰胆碱、单胺类、氨基酸类等。乙酰胆碱(ach)类属于胆碱能神经递质中的一种，是脑组织中重要的化学组成成分之一。ad病人脑部皮质及海马体中观察发现其脑内ach合成、储存和释放减少等胆碱能组分有明显改变。目前临床中常用他克敏、卡巴拉汀等乙酰胆碱酯酶(ache)抑制剂治疗ad，一般情况下，他克敏用药剂量为20μm,卡巴拉汀的用药剂量为50μm；而他克敏、卡巴拉汀等乙酰胆碱酯酶(ache)抑制剂具有一定毒性，长期使用不利于患者健康。因此，寻找一种能有效增强ache靶点抑制作用，降低药物使用剂量和毒性，提高ad治疗效果的替代药物具有重要意义。技术实现要素：本发明意在提供一种能增强对乙酰胆碱酯酶抑制作用的药物，为预防及治疗ad提供一种新的药物来源。本方案中的一种药物组合物，包括摩尔比为1：4～9的(6ar,11ar)-3-羟基-9,10-二甲氧基紫檀烷和(6ar,11ar)9,10-二甲氧基紫檀烷-3-o-β-d-葡萄糖苷。本方案的有益效果：本方案通过((6ar,11ar)-3-羟基-9,10-二甲氧基紫檀烷与(6ar,11ar)9,10-二甲氧基紫檀烷-3-o-β-d-葡萄糖苷)的组合，为预防和治疗ad提供了新的药物候选来源，可显著增强对乙酰胆碱酯酶抑制作用，降低药物使用剂量和毒性。进一步，所述药物组合物，包括摩尔比为1：4～6的(6ar,11ar)-3-羟基-9,10-二甲氧基紫檀烷和(6ar,11ar)9,10-二甲氧基紫檀烷-3-o-β-d-葡萄糖苷。该配比的中药组合物对乙酰胆碱酯酶的抑制作用更好。进一步，本申请中的药物组合物可应用于制备抑制乙酰胆碱酯酶活性的药物或保健品中。进一步，本申请中的药物组合物可应用于制备预防或治疗神经退行性疾病的药物或保健品中。进一步，本申请中的药物组合物可应用于制备预防或治疗阿尔茨海默症的药物或保健品中。进一步，药物或保健品的剂型为粉剂、片剂、冲剂、胶囊剂或口服液。根据不同剂型，选择合适的药物上可接受的载体，为本领域常规技术，在此不再详述。附图说明图1为(6ar,11ar)-3-羟基-9,10-二甲氧基紫檀烷与(6ar,11ar)9,10-二甲氧基紫檀烷-3-o-β-d-葡萄糖苷及二者组合物抑制乙酰胆碱酯酶活性的量效关系曲线图；图2为(6ar,11ar)-3-羟基-9,10-二甲氧基紫檀烷与(6ar,11ar)9,10-二甲氧基紫檀烷-3-o-β-d-葡萄糖苷在摩尔浓度比1：5配伍下的fa-c曲线图。具体实施方式下面通过具体实施方式进一步详细说明：实施例(6ar,11ar)-3-羟基-9,10-二甲氧基紫檀烷与(6ar,11ar)9,10-二甲氧基紫檀烷-3-o-β-d-葡萄糖苷及二者组合物(1：5)抗乙酰胆碱酯酶活性研究1材料与试剂1.1药物与试剂(6ar,11ar)-3-羟基-9,10-二甲氧基紫檀烷和(6ar,11ar)9,10-二甲氧基紫檀烷-3-o-β-d-葡萄糖苷购于成都曼斯特生物科技有限公司。dtnb(lot16262)、碘化乙酰胆碱(atch，lotbcbv4822)、四异丙基焦磷酸亚胺(iso-ompa，lotbcbw4257)购于西格玛奥德里奇(美国)公司；np-40(lotc10297258)，亮抑肽酶(lotc10079991)，抑肽酶(lotc10060365)，胃蛋白酶抑制剂(lotb10084382)、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(hepes，lotb10094032)、苯甲脒盐酸盐(lotc10089171)及其它分析试剂均购于上海麦克林生化科技有限公司。1.2动物脑裂解液的制备选择c57bl/6雄性小鼠(遵义医科大学，动物实验中心)，小鼠脱颈处死后，分取小鼠大脑置-80℃脱水4h。精密称取小鼠大脑，用低盐裂解液在冰上研磨大脑组织15min(1:10w/v,包含10mmhepes、1mm乙二胺四乙酸、1mm乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸、150mm氯化钠、0.5％聚乙二醇辛基苯基醚、10μg/ml亮抑肽酶、10μg/ml抑肽酶、10μg/ml胃蛋白酶抑制剂及50μg/ml苯甲脒盐酸盐)，进行组织匀浆。匀浆混合液在4℃下，以16000g离心15min，分取上清，即得含有乙酰胆碱酯酶的小鼠大脑裂解液，-80℃保存，待用。2实验方法2.1药物配制精密称取(6ar,11ar)-3-羟基-9,10-二甲氧基紫檀烷和(6ar,11ar)9,10-二甲氧基紫檀烷-3-o-β-d-葡萄糖苷对照品适量，分别用dmso溶解至50mm、25mm。取(6ar,11ar)-3-羟基-9,10-二甲氧基紫檀烷母液适量，用dmso进行稀释，并从0.8mm起始浓度2倍梯度连续稀释成7个梯度。取(6ar,11ar)9,10-二甲氧基紫檀烷-3-o-β-d-葡萄糖苷母液适量，用dmso进行稀释，并从4mm起始浓度2倍梯度连续稀释成7个梯度。分别取适当体积的(6ar,11ar)-3-羟基-9,10-二甲氧基紫檀烷和(6ar,11ar)9,10-二甲氧基紫檀烷-3-o-β-d-葡萄糖苷母液进行混合，得到摩尔比1：5的(6ar,11ar)-3-羟基-9,10-二甲氧基紫檀烷和(6ar,11ar)9,10-二甲氧基紫檀烷-3-o-β-d-葡萄糖苷组合物溶液，用dmso进行稀释。各实验药物浓度梯度设置如下：(6ar,11ar)-3-羟基-9,10-二甲氧基紫檀烷浓度为0.8、0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125mm；(6ar,11ar)9,10-二甲氧基紫檀烷-3-o-β-d-葡萄糖苷浓度为4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625mm。2.2ellman法测试(6ar,11ar)-3-羟基-9,10-二甲氧基紫檀烷和(6ar,11ar)9,10-二甲氧基紫檀烷-3-o-β-d-葡萄糖苷及二者组合物抗乙酰胆碱酯酶活性采用改良的ellman法测定(6ar,11ar)-3-羟基-9,10-二甲氧基紫檀烷和(6ar,11ar)9,10-二甲氧基紫檀烷-3-o-β-d-葡萄糖苷及二者组合物的乙酰胆碱酯酶抑制活性，每个药物浓度设置3个复孔。选取96孔细胞培养板进行ellman法反应，反应液终体系体积为200μl。反应液包含80mmna2hpo4(ph7.4)、0.1mmiso-ompa、0.625mmatch、0.5mmdtnb。药物、动物大脑裂解液与反应液在37℃孵育15分钟后，加入底物10μlatch(12.5mm)、10μldtnb(12.5mm)，37℃孵育30分钟，采用biotekepoch2酶标读数仪在405nm下测定各组药物吸光度(扣除背景及药物本身颜色干扰)，计算药物对乙酰胆碱酯酶活性的抑制率。抑制率计算公式如下：抑制率＝(1－加药组od值/空白对照组od值)×100％。2.3(6ar,11ar)-3-羟基-9,10-二甲氧基紫檀烷和(6ar,11ar)9,10-二甲氧基紫檀烷-3-o-β-d-葡萄糖苷组合物对乙酰胆碱酯酶活性的协同抑制作用分析采用中效原理和chou-talalay联合指数法对(6ar,11ar)-3-羟基-9,10-二甲氧基紫檀烷和(6ar,11ar)9,10-二甲氧基紫檀烷-3-o-β-d-葡萄糖苷组合物对乙酰胆碱酯酶活性的协同抑制作用进行测定。根据中效方程fa/fu＝(d/dm)m计算单个或两个药物特定抑制率下的使用剂量。将中效方程转化为线性方程log(fa/fu)＝mlogd-mlogdm，d代表药物剂量，fa代表小数抑制率，fu＝1-fa，dm为中效浓度，代表50％效应时的药物浓度，m为线性方程直线的斜率。根据chou-talalay方程(ci＝(d)1/(dx)1+(dx)2/(dx)2)计算(6ar,11ar)-3-羟基-9,10-二甲氧基紫檀烷和(6ar,11ar)9,10-二甲氧基紫檀烷-3-o-β-d-葡萄糖苷的合用指数(ci)，d1、d2为(6ar,11ar)-3-羟基-9,10-二甲氧基紫檀烷和(6ar,11ar)9,10-二甲氧基紫檀烷-3-o-β-d-葡萄糖苷组合物在x药物效应(乙酰胆碱酯酶活性抑制率)时各自的浓度，(dx)1、(dx)2为达到上述x药物效应时(6ar,11ar)-3-羟基-9,10-二甲氧基紫檀烷和(6ar,11ar)9,10-二甲氧基紫檀烷-3-o-β-d-葡萄糖苷单独使用时的浓度。评价二者对乙酰胆碱酯酶的协同抑制作用。当ci<1，两药合用效应为协同效应；当ci＝1，两药合用效应为相加效应；当ci>1，两药合用效应为拮抗效应。3实验结果3.1.图1为(6ar,11ar)-3-羟基-9,10-二甲氧基紫檀烷和(6ar,11ar)9,10-二甲氧基紫檀烷-3-o-β-d-葡萄糖苷及二者组合物抑制乙酰胆碱酯酶活性的量效关系曲线，(6ar,11ar)-3-羟基-9,10-二甲氧基紫檀烷和(6ar,11ar)9,10-二甲氧基紫檀烷-3-o-β-d-葡萄糖苷配伍的摩尔浓度比为1：5。结果表明，(6ar,11ar)-3-羟基-9,10-二甲氧基紫檀烷和(6ar,11ar)9,10-二甲氧基紫檀烷-3-o-β-d-葡萄糖苷对乙酰胆碱酯酶活性抑制率均呈现浓度依赖性增加，且与(6ar,11ar)-3-羟基-9,10-二甲氧基紫檀烷和(6ar,11ar)9,10-二甲氧基紫檀烷-3-o-β-d-葡萄糖苷单独使用相比，达到特定药物效应时，组合物中单药的浓度明显降低。3.2(6ar,11ar)-3-羟基-9,10-二甲氧基紫檀烷和(6ar,11ar)9,10-二甲氧基紫檀烷-3-o-β-d-葡萄糖苷组合物对乙酰胆碱酯酶活性的协同抑制效应分析根据中效原理和chou-talalay联合指数法评价(6ar,11ar)-3-羟基-9,10-二甲氧基紫檀烷和(6ar,11ar)9,10-二甲氧基紫檀烷-3-o-β-d-葡萄糖苷在摩尔浓度比1：5配伍下，二者的协同配伍效应。根据计算结果绘制不同效应下，(6ar,11ar)-3-羟基-9,10-二甲氧基紫檀烷和(6ar,11ar)9,10-二甲氧基紫檀烷-3-o-β-d-葡萄糖苷的合用指数(fa-c曲线)，通过合用效应与合用指数曲线图评价(6ar,11ar)-3-羟基-9,10-二甲氧基紫檀烷和(6ar,11ar)9,10-二甲氧基紫檀烷-3-o-β-d-葡萄糖苷的协同配伍效应。图2为(6ar,11ar)-3-羟基-9,10-二甲氧基紫檀烷和(6ar,11ar)9,10-二甲氧基紫檀烷-3-o-β-d-葡萄糖苷在摩尔浓度比1：5配伍下的fa-c曲线图。结果表明，(6ar,11ar)-3-羟基-9,10-二甲氧基紫檀烷和(6ar,11ar)9,10-二甲氧基紫檀烷-3-o-β-d-葡萄糖苷在摩尔浓度比1：5配伍下能够发挥明显的协同增强抑制乙酰胆碱酯酶活性作用。由表1可知，当fa＝0.5时，(6ar,11ar)-3-羟基-9,10-二甲氧基紫檀烷和(6ar,11ar)9,10-二甲氧基紫檀烷-3-o-β-d-葡萄糖苷摩尔浓度1：5配伍后，能明显降低单药使用剂量。结论：本发明采用改良的ellman法测定(6ar,11ar)-3-羟基-9,10-二甲氧基紫檀烷和(6ar,11ar)9,10-二甲氧基紫檀烷-3-o-β-d-葡萄糖苷及二者组合物对乙酰胆碱酯酶活性的影响，发现摩尔比为1：5时，(6ar,11ar)-3-羟基-9,10-二甲氧基紫檀烷和(6ar,11ar)9,10-二甲氧基紫檀烷-3-o-β-d-葡萄糖苷组合物对乙酰胆碱酯酶活性具有明显的协同抑制作用。另外，发明人还采用上述方法对不同(6ar,11ar)-3-羟基-9,10-二甲氧基紫檀烷与(6ar,11ar)9,10-二甲氧基紫檀烷-3-o-β-d-葡萄糖苷配伍比例对ache抑制率进行了试验，具体参数如下表所示：数据显示，(6ar,11ar)-3-羟基-9,10-二甲氧基紫檀烷与(6ar,11ar)9,10-二甲氧基紫檀烷-3-o-β-d-葡萄糖苷配伍比例在1:4～1：9之间对抑制乙酰胆碱酯酶具有较好的效果。对不同(6ar,11ar)9,10-二甲氧基紫檀烷-3-o-β-d-葡萄糖苷与(6ar,11ar)-3-羟基-9,10-二甲氧基紫檀烷配伍比例对ache抑制率进行了试验，具体参数如下表所示：药物浓度(nm)1:11:21:31:41:51:61:71:81:91:103013.6％8.0％6.9％7.8％16.2％12.2％13.5％6.0％15.6％8.5％10016.9％10.6％7.1％12.2％15.9％15.0％16.9％6.9％15.3％16.9％30022.3％15.2％8.3％14.2％26.1％16.2％19.2％6.9％21.4％14.8％100029.9％19.7％14.2％10.9％22.3％17.7％20.8％5.9％26.5％23.6％300041.6％23.6％16.3％18.7％18.9％20.6％21.6％26.8％31.1％27.4％1000052.9％20.8％23.1％23.3％18.4％23.4％22.3％25.9％30.9％35.3％数据显示，当(6ar,11ar)9,10-二甲氧基紫檀烷-3-o-β-d-葡萄糖苷含量大于(6ar,11ar)-3-羟基-9,10-二甲氧基紫檀烷时，两者组成的药物混合物对乙酰胆碱酯酶的抑制效果较差。上面结合附图对本发明的实施例进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多形式，这些均属于本发明的保护之内。当前第1页12