用于治疗鼻咽癌的中药口服制剂及其鉴别方法与应用与流程

本发明涉及制药领域。更具体地说，本发明涉及一种用于治疗鼻咽癌的中药口服制剂及其鉴别方法与应用。

背景技术：

鼻咽癌发生于鼻咽腔顶部和侧壁的恶性肿瘤，是我国高发恶性肿瘤之一，发病率为耳鼻咽喉恶性肿瘤之首，具有生长部位隐蔽、早期症状不明显、淋巴转移早及远处转移发生率高的特点，严重威胁鼻咽癌患者的生命，已经成为耳鼻咽喉恶性肿瘤的主要癌种和病死因素。常见临床症状为鼻塞、涕中带血、耳闷堵感、听力下降、复视及头痛等。在我国发病率由南向北递减，在两广地区尤其高发。发病率在20岁以上的人群中随着年龄增长递增，在45～60岁左右达到峰值。未来随着我国人口老龄化不断加重，鼻咽癌的发病、死亡水平可能还将不断上升，而由此带来的癌症负担也将持续增长，防控形势严峻，而目前有效治疗鼻咽癌的药物十分紧缺。

鼻咽癌大多对放射治疗具有中度敏感性，放射治疗是鼻咽癌的首选治疗方法。但是对较高分化癌，病程较晚以及放疗后复发的病例，手术切除和化学药物治疗亦属于不可缺少的手段。化疗是一种有效而经典的肿瘤治疗手段，但化疗药物通常在杀死肿瘤细胞的同时也杀死正常细胞，从而产生严重的不良反应和并发症，治疗效果不理想。因此，为了达到较好的疗效而最大限度减少化疗药物的毒副作用，开发具有毒性小，抗癌靶向作用强的天然药物成为国内外同行的研究热点。

技术实现要素：

本发明的一个目的是提供一种用于治疗鼻咽癌的中药口服制剂，其具有很好的抗肿瘤活性，可有效的抑制鼻咽癌细胞的生长和转移，毒副作用小。

本发明的另一个目的是提供一种用于治疗鼻咽癌的中药口服制剂的鉴别方法，其具有检测结果准确，重复性好，灵敏度高的优点，可用于用于治疗鼻咽癌的中药口服制剂的质量控制，或鉴别用于治疗鼻咽癌的中药口服制剂的优劣。

本发明的另一个目的是将用于治疗鼻咽癌的中药口服制剂应用于制备治疗呼吸道癌症和/或呼吸道炎症的药物。

为了实现根据本发明的上述目的，提供了一种用于治疗鼻咽癌的中药口服制剂，其有效活性成分包括高丽槐素、红车轴草苷和环广豆根素，且高丽槐素的含量大于等于0.59mg/g，和/或高丽槐素、红车轴草苷和环广豆根素的总含量大于等于2.00mg/g。

优选的是，所述的用于治疗鼻咽癌的中药口服制剂，其标准指纹图谱中包含12个特征峰，其中，按出峰顺序，以第8个特征峰为参照物峰，第1个特征峰的相对保留时间为0.331，对应的化合物为芒柄花苷，第2个特征峰的相对保留时间为0.446，对应的化合物为红车轴草甘，第3个特征峰的相对保留时间为0.497，第4个特征峰的相对保留时间为0.599，对应的化合物为染料木苷，第5个特征峰的相对保留时间为0.653，对应的化合物为染料木黄酮，第6个特征峰的相对保留时间为0.709，对应的化合物为乙酰红车轴草苷，第7个特征峰的相对保留时间为0.764，第8个特征峰的相对保留时间为1.000，对应的化合物为高丽槐素，第9个特征峰的相对保留时间为1.067，对应的化合物为2-(2',4'-二羟基苯基)-5,6-二氧亚甲基苯并呋喃，第10个特征峰的相对保留时间为1.734，对应的化合物为4',7-二羟基-6,8-二异戊烯基黄烷酮，第11个特征峰的相对保留时间为1.908，第12个特征峰的相对保留时间为2.004，对应的化合物为环广豆根素。

优选的是，所述的用于治疗鼻咽癌的中药口服制剂，其剂型包括片剂、颗粒剂、胶囊剂、丸剂、散剂、膏剂、口服液和合剂。

本发明还提供了一种上述用于治疗鼻咽癌的中药口服制剂的鉴别方法，包括，

采用薄层色谱法对待测中药口服制剂中的高丽槐素和红车轴草苷进行定性检测；

采用高效液相色谱法对待测中药口服制剂中的高丽槐素进行定量检测；

若待测中药口服制剂中同时含有高丽槐素和红车轴草苷，且高丽槐素的含量大于等于第一预设值，则判定所述待测中药口服制剂为合格品，否则为伪劣品，优选第一预设值为0.59mg/g。

本发明还提供了一种上述用于治疗鼻咽癌的中药口服制剂的鉴别方法，包括，

采用指纹图谱法对待测中药口服制剂进行定性检测，获取待测中药口服制剂的指纹图谱；

采用高效液相色谱法对待测中药口服制剂中的高丽槐素进行定量检测，并采用一测多评法计算待测中药口服制剂中的红车轴草苷和环广豆根素的含量；

若待测中药口服制剂的指纹图谱中同时出现与所述标准指纹图谱相对应的12个特征峰，且高丽槐素的含量大于等于第一预设值，和/或高丽槐素、红车轴草苷和环广豆根素的总含量大于等于第二预设值，则判定所述待测中药口服制剂为合格品，否则为伪劣品，优选第二预设值为2.00mg/g。

本发明还提供了一种上述用于治疗鼻咽癌的中药口服制剂在制备治疗呼吸道癌症和/或呼吸道炎症的药物中的应用。

优选的是，所述的用于治疗鼻咽癌的中药口服制剂在制备治疗鼻咽癌、肺癌的药物中的应用。

优选的是，所述的用于治疗鼻咽癌的中药口服制剂在制备治疗阻塞性肺炎、咽喉炎、支气管炎的药物中的应用。

本发明至少包含以下有益效果：

第一、本发明的用于治疗鼻咽癌的中药口服制剂具有很好的抗肿瘤活性，可有效的抑制鼻咽癌细胞的生长和转移，毒副作用小，质量稳定可控。

第二、本发明的用于治疗鼻咽癌的中药口服制剂的鉴别方法具有检测结果准确，重复性好，灵敏度高的优点，可用于用于治疗鼻咽癌的中药口服制剂的质量控制，或鉴别用于治疗鼻咽癌的中药口服制剂的优劣。

第三、本发明的用于治疗鼻咽癌的中药口服制剂可应用于制备治疗呼吸道癌症和/或呼吸道炎症的药物，应用前景好。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1为山豆根片中红车轴草苷tlc鉴别结果；

图2为山豆根片中高丽槐素tlc鉴别结果；

图3为高丽槐素对照品溶液hplc谱图；

图4为供试品溶液hplc谱图；

图5为山豆根片全谱峰匹配图；

图6为山豆根片指认图谱；

图7为供试品溶液hplc谱图；

图8为高丽槐素、红车轴草苷、环广豆根素对照品溶液hplc谱图；

图9为山豆根片提取物对cne-1细胞生长的抑制率；

图10为山豆根片提取物对cne-1细胞克隆的抑制作用；

图11为山豆根片提取物对cne-1细胞划痕的愈合率；

图12为cne-1细胞穿过小室的数量；

图13为山豆根片提取物诱导鼻咽癌细胞株cne-1的凋亡率；

图14为cne-1细胞周期中dna分布状况。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

本发明提供的用于治疗鼻咽癌的中药口服制剂，其有效活性成分包括高丽槐素、红车轴草苷和环广豆根素，且高丽槐素的含量大于等于0.59mg/g，和/或高丽槐素、红车轴草苷和环广豆根素的总含量大于等于2.00mg/g。这里，有效活性成分可以从山豆根、北豆根、红车轴草等一种或几种中药材中提取得到，不限定具体来源；用于治疗鼻咽癌的中药口服制剂的剂型可根据实际需要进行调整，剂型包括但不限于片剂、颗粒剂、胶囊剂、丸剂、散剂、膏剂、口服液和合剂。

为了更加清楚、深入的介绍本发明的技术构思，以令本领域技术人员能够参照实施，本发明仅以山豆根片进行具体举例说明。

实施例1：山豆根片的制备

本实施例提供了一种山豆根片的制备方法，包括以下步骤：

步骤一、将山豆根粉与80vol.％乙醇水溶液按照料液比1:40混合，静置半小时后，于提取温度为70℃，压力为0.8mpa下回流提取2h，提取完成后，分离，得第一次提取液和第一药渣；将所述第一药渣与80vol.％乙醇水按照料液比1:40混合，于提取温度为70℃，压力为0.8mpa下回流提取2h，提取完成后，分离，得第二提取液和第二药渣；合并所述第一提取液和所述第二提取液，得提取液；

步骤二、将所述提取液于浓缩温度为70℃，压力为0.8mpa下减压浓缩至无醇味，得浓缩液；

步骤三、将所述浓缩液加水混悬后，加入氯仿，所述浓缩液与氯仿的体积比为1:3，搅拌均匀，静置分层，取氯仿层液体，得萃取液i；将余下水层与氯仿按照体积比为1:2混合，搅拌均匀，静置分层，再取氯仿层液体，得萃取液ii；将余下水层再与氯仿按照体积比为1:2混合，搅拌均匀，静置分层，再取氯仿层液体，得萃取液iii；合并萃取液i、萃取液ii、萃取液iii，得萃取液；

步骤四、将所述萃取液减压浓缩，并将所得浸膏加纯水溶解后过大孔树脂，所述大孔树脂的径高比为1:10，吸附完成后，先用8倍大孔树脂体积的纯净水洗脱，弃去水洗脱液，再用8倍大孔树脂体积的乙醇水溶液进行梯度洗脱，乙醇水溶液的体积分数依次为0-39％，40-95％，收集40-95vol.％洗脱液；

步骤五、将所述40-95vol.％乙醇水部位的洗脱液减压浓缩至相对密度为1.3的稠膏状，得山豆根总黄酮浸膏；

步骤六、向所述山豆根总黄酮浸膏中加入淀粉、糊精、蔗糖、和硬脂酸镁，混合均匀后，直接压片，得山豆根片，其中，所述山豆根总黄酮浸膏、淀粉、糊精、蔗糖、和硬脂酸镁的重量比为30:54:10:5:1。

实验例1：山豆根片的薄层色谱鉴别

1对照品溶液的制备

取高丽槐素对照品、红车轴草苷对照品适量，加甲醇制成每1ml各含对照品2mg的混合溶液，作为对照品溶液。

2药材供试品溶液的制备

取山豆根药材粉末2g，加甲醇20ml，于功率250w，频率35khz下超声提取2次，每次15min，合并提取溶液，用旋转薄膜蒸发仪减压蒸干，残渣加甲醇1ml溶解，作为药材供试品溶液。

3供试品溶液的制备

取实施例1制备的十批山豆根片剂各1.08g，分别入加甲醇20ml，于功率250w，频率35khz下超声提取2次，每次15min，合并提取溶液，用旋转薄膜蒸发仪减压蒸干，残渣加甲醇2ml溶解，作为供试品溶液。

4山豆根片薄层色谱(tlc)鉴定结果

吸取上述对照品溶液5ul及药材供试品溶液和供试品溶液各10ul，分别点于同一硅胶gf254薄层板上，

(1)以氯仿-甲醇(4：1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5wt.％硫酸香草醛溶液，置日光灯下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的两个荧光斑点，见图1，其中，1-10为供试品溶液、11为药材供试品溶液、12为对照品溶液。

(2)以石油醚-丙酮(1：1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以磷钼酸铵溶液，置日光灯下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的两个荧光斑点，见图2，其中，1-10为供试品溶液、11为药材供试品溶液、12为对照品溶液。

由图1、图2可知，采用以上薄层色谱法鉴别，样品斑点清晰，稳定性好，适合山豆根片剂中高丽槐素、红车轴草苷的薄层鉴别，进行山豆根片的鉴别和质量控制。

实验例2：山豆根片高丽槐素含量测定

1方法

1.1色谱条件

色谱柱：agilenteclipsec184.6×250mm，5μm；流动相：以乙腈为流动相a，以水溶液为流动相b，梯度洗脱：0～5min，35％a；5～15min，35～50％a；15～20min50～55％a；检测波长：205nm；流速：1ml/min；柱温：30℃；理论板数：不低于30000。

1.2对照品溶液的制备

取高丽槐素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含对照品0.122mg的溶液，即得。

1.3供试品溶液的制备

将实施例1制备的山豆根片粉碎后过四号筛，取1.35g粉末，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50ml，称定重量，超声处理(功率250w，频率35khz)30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，浓缩至干，用色谱甲醇溶解至10ml容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，0.45μm微孔滤膜过滤，即得。

2系统适应性及专属性考察

按1.1项下的色谱条件进行测定，分别精密吸取供试品溶液、对照品溶液各10μl，注入液相色谱仪测定，测定结果见图3、图4。由图3、图4可知，采用该色谱条件测定的供试品溶液色谱的分离度、理论塔板数、对称因子等系统适用性良好，具有良好的专属性。

另，本发明还对该方法的线性关系、精密度、稳定性、重复性、加样回收率等方便进行了考察，结果均满足要求，这里不再赘述。

3高丽槐素含量测定

取十批实施例1制备的山豆根片样品，每批各5片，依法制备供试品溶液，分别精密吸取对照品溶液及供试品溶液各10μl，平行进针，注入液相色谱仪，测定峰面积，计算山豆根片样品中高丽槐素含量，结果下表。

根据十批样品含量测定结果，确定本品高丽槐素的含量限度为每g含高丽槐素(c12h12o5)不得少于0.59mg。

实施例3：山豆根片的标准指纹图谱

1色谱条件

色谱柱为agilentplus-c18色谱柱(4.6×250mm,5μm)，流动相为乙腈(b)-水(a)溶液，梯度洗脱：0～5min，25％b；5～55min，25～50％b；55～80min，50～95％b。体积流量1.0ml/min，检测波长205nm，柱温30℃，进样量10μl。

2对照品溶液的制备

分别取高丽槐素、红车轴草苷、芒柄花苷、芒柄花黄素适量，精密称取，加甲醇配制每1ml溶液中分别含0.175mg、0.14mg、0.07mg、0.07mg的混标对照溶液。

3、供试品溶液的制备

同实验例2。

4山豆根片指纹图谱分析

4.1hplc标准指纹图谱的建立

分别取10批山豆根片样品，按照实验例2“1.3”项下方法制备供试品溶液，标记为s1-s10，按照色谱条件进行测定。将色谱数据以cdf格式导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”软件，对照图谱采用中位数法生成，使用多点校正对色谱峰进行匹配，生成10批山豆根片全谱峰匹配图，见图5。

4.2相似度评价及共有峰比值分析

由上表可知，10批山豆根片样品共有峰相对保留时间的rsd(即相对标准偏差)为1.44％，相对峰面积的rsd为2.21％。以s1样品图谱为参考图谱，得到十批样品与对照指纹图谱的相似度分别为0.950、0.935、0.938、0.927、0.956、0.939、0.801、0.899、0.943、0.888。其中与高丽槐素(峰8)为参照物峰，10批山豆根片在相对保留时间为0.331(峰1)、0.446(峰2)、0.497(峰3)、0.599(峰4)、0.653(峰5)、0.709(峰6)、0.764(峰7)、1.000(峰8)、1.067(峰9)、1.734(峰10)、1.908(峰11)、2.004(峰12)处呈现12个共有峰。

经与对照品比对12个共有峰分别是：1号峰为芒柄花苷(ononin)，2号峰为红车轴草甘(trifolirhizin)，3号峰为isotrifolirhizin，4号峰为染料木苷(genistin)，5号峰为染料木黄酮(genistein)，6号峰为乙酰红车轴草苷(trifolirhizin-6'-ethanoyl)，7号峰为gormononetin，8号峰为高丽槐素(maackiain)，9号峰为2-(2',4'-二羟基苯基)-5,6-二氧亚甲基苯并呋喃[2-(2',4'-dihidroxyphenyl)-5,6-methylenedioxybenzofuran]，10号峰为4',7-二羟基-6,8-二异戊烯基黄烷酮[4',7-dihydroxy-6,8-bis(3-methyl-2-butenyl)flavanone]，11号峰为sophoranochromone，12号峰为环广豆根素，指认图谱见图6。

实验例4：一测多评法测定山豆根片成分含量

1色谱条件

同实验例3。

2对照品溶液的制备

对照品的制备：分别取高丽槐素、红车轴草苷、环广豆根素适量，精密称取，配制每1ml溶液中分别含0.175mg、0.140mg、0.070mg的混合对照品溶液。

3供试品溶液的制备

将实施例1制备的山豆根片粉碎后过四号筛，取2.0g粉末，置于50ml圆底烧瓶中，加入20ml75％乙醇水溶液，85℃水浴回流提取2h。冷却至室温，过滤，上d101大孔树脂柱，依次用蒸馏水、39％乙醇水、95％乙醇水洗脱，收集40％-95％乙醇水部位，蒸干溶剂后用色谱甲醇溶解定容至10ml容量瓶中，0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得供试品溶液。

4系统适应性及专属性考察

精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，按色谱条件测定，记录色谱图，结果见图7、图8，其中，图8中1为中高丽槐素、2为红车轴草苷、3为环广豆根素。结果表明，供试品溶液图谱中1、2、3号色谱峰的相对保留时间与混合对照品溶液图谱一致，说明该方法具有良好的系统适应性及专属性。

另，本发明还对该方法的线性关系、精密度、稳定性、重复性、加样回收率等方便进行了考察，结果均满足要求，这里不再赘述。

5、相对校正因子(fs/i)的确定

5.1fs/i的计算

按色谱条件测定，对照品溶液进行一系列不同的进样量，分别为2μl、4μl、8μl、10μl、15μl、20μl，以高丽槐素为内参物s，测定红车轴草苷(a)、环广豆根素(b)的峰面积，按公式fs/i＝fs/fi＝(as/cs)/(ai/ci)(其中as为内参物的峰面积，cs为内参物的浓度，ai为其余组分的峰面积，ci为其余组分的浓度)，计算，取平均值，确定红车轴草苷的相对校正因子fs/a为1.606；环广豆根素的相对校正因子fs/b为0.774。

5.2一测多评法对十批山豆根片样品的检测

分别取十批山豆根片粉末各2.0g，制备供试品溶液，按色谱条件进样测定，分别采用外标法和一测多评法计算山豆根片中高丽槐素,红车轴草苷,环广豆根素的含量。结果见下表。

采用spss25.0软件，对十批山豆根片中红车轴草苷esm与qams的含量测定结果进行成对样品t检验，计算统计量t＝1.776＜t0.05/2,20，p＞0.05，红车轴草苷的esm与qams两种方法无显著性差异。同理，环广豆根素esm与qams的含量测定结果进行检验，其统计t＝1.596＜t0.10/2,20，p＞0.05，环广豆根素的qams与esm方法无显著性差异。

以高丽槐素为内参物，建立了红车轴草苷的相对校正因子(fs/a)为1.606、环广豆根素的相对校正因子(fs/b)为0.774的一测多评定量方法。该方法精密度、稳定性、重复性及耐用性较好，均符合分析要求。采用以高丽槐素为内参物建立的一测多评法，检测山豆根片中的高丽槐素、红车轴草苷和环广豆根素的含量分别为0.621mg/ml，0.997mg/ml，0.480mg/ml。

实验例5：山豆根片对人鼻咽癌细胞体外研究

1实验方法

1.1细胞培养

1.1.1细胞复苏

从液氮中取出细胞冻存管，快速将其置入37℃恒我把水浴锅中解冻，直到冻存管中无结晶；从水浴锅中取出冻存管，用75％的酒精擦拭冻存管外壁后转移至超净台；将冻存管里的细胞悬液转移至含5ml完全培养基的15ml离心管中，常温条件下，1000rpm离心5min；取出离心好的15ml离心管，用75％的酒精擦拭离心管外壁后转移至超净台，弃去上清，沉淀用5ml新鲜的完全培养基重悬，将悬液接种于25cm2培养瓶，于37℃，5％co2细胞培养箱中培养；第二天，换用新鲜的完全培养基继续培养。

1.1.2常规培养

观察25cm2培养瓶中培养液的颜色，确定是否需要更换新鲜的完全培养基；用75％的酒精擦拭25cm2培养瓶外壁后转移至超净台，弃去原先的完全培养基，用1×pbs清洗细胞两次；加入5ml新鲜的完全培养基至25cm2培养瓶，于37℃，5％co2细胞培养箱中培养。

1.1.3细胞传代

倒置显微镜下观察细胞，当细胞生长至覆盖培养瓶80％的面积时，用75％的酒精擦拭25cm2培养瓶外壁后转移至超净台；弃去25cm2培养瓶中的培养液，用1×pbs清洗细胞两次；添加0.25％胰蛋白酶消化液约1ml至培养瓶中，消化大约3min，倒置显微镜下观察，待细胞回缩变圆后加入新鲜的完全培养基终止消化，轻轻吹打细胞使之脱落，然后将悬液转移至15ml离心管中，常温条件下，1000rpm离心5min；取出离心好的15ml离心管，用75％的酒精擦拭离心管外壁后转移至超净台，弃去上清，沉淀用12ml新鲜的完全培养基重悬，然后按1:2的比例进行分瓶传代，最后放入37℃，5％co2细胞培养箱中培养；待细胞完全贴壁后，观察培养结果，之后进行换液培养或传代。

1.1.4细胞冻存

倒置显微镜下观察细胞，当细胞生长至覆盖培养瓶80％的面积时，用75％的酒精擦拭25cm2培养瓶外壁后转移至超净台；弃去25cm2培养瓶中的培养液，用1×pbs清洗细胞两次；添加0.25％胰蛋白酶消化液约1ml至培养瓶中，消化大约3min，倒置显微镜下观察，待细胞回缩变圆后加入新鲜的完全培养基终止消化，轻轻吹打细胞使之脱落，然后将悬液转移至15ml离心管中，常温条件下，1000rpm离心5min；用适量已配置好的冻存液(fbs：dmso＝9:1)重悬细胞，取1ml细胞悬液放置于冻存管中，并用封口胶密封；先将冻存放置于-20℃冰箱1.5h，然后将其转移至-80℃冰箱过夜，24h后转移至液氮罐中进行长期保存。

1.1.5细胞计数

取重悬均匀好的细胞悬液和台酚蓝各10ul加入含有80ul培养基的1.5ml离心管中，用10ul移液枪轻轻吹打均匀，从1.5ml离心管中取10ul细胞悬液加入到计数板中计数，读取计数板中4个大方格中的细胞数，取4个大方格细胞数的平均数，所得的数值乘以105即为每毫升所含的细胞个数，计数重复三次。

1.2山豆根片母液的配置

称取山豆根片粉末0.4g置于5ml离心管中，加入4mldmso；将已加入dmso的5ml离心管用封口胶密封，置于超声仪中超声，使山豆根片成分溶解；将上述5ml离心管用75％的酒精擦拭外壁后转移至超净台，用0.22um过滤器过滤，将过滤后的母液进行分装与1.5ml离心管中，即得到50ug/ml山豆根片提取物母液；将分装好的母液用封口胶密封，-80℃冰箱保存。

1.3细胞增殖

倒置显微镜下观察cne-1细胞，当细胞生长至覆盖培养瓶80％的面积时，用75％的酒精擦拭25cm2培养瓶外壁后转移至超净台；弃去25cm2培养瓶中的培养液，用1×pbs清洗细胞两次；添加0.25％胰蛋白酶消化液约1ml至培养瓶中，消化大约3min，倒置显微镜下观察，待细胞回缩变圆后加入新鲜的完全培养基终止消化，轻轻吹打细胞使之脱落，然后将悬液转移至15ml离心管中，常温条件下，1000rpm离心5min；取出离心好的15ml离心管，用75％的酒精擦拭离心管外壁后转移至超净台，弃去上清，加入新鲜的完全培养基重悬细胞，重悬均匀后对细胞悬液进行细胞计数，调整细胞浓度为2×104个/ml；将实验进行分组，分别为control组、实验组，每组设置6个复孔；取细胞浓度为2×104个/ml的细胞悬液100ul按上述分组加入到96孔板中后，将96孔板置于37℃，5％co2细胞培养箱中培养过夜；第二天分别给予实验组相应的山豆根片提取物浓度分别为5、10、15、20、25、30、35、40、45、50ug/ml，control组相同的完全培养基，将96孔板置于37℃，5％co2细胞培养箱中培养24h、48h、72h；待24、48、72小时时，在各孔中加入20ul5mg/mlmtt，将96孔板置于37℃，5％co2细胞培养箱中培养4h；取出96孔板，弃去上清，各孔加入150uldmso后，将96孔板置于微量振荡器振荡10min，使孔内的结晶完全溶解后，用酶标仪于570nm处测定od值。实验重复三次。

1.4细胞克隆

倒置显微镜下观察cne-1细胞，当细胞生长至覆盖培养瓶80％的面积时将细胞进行常规消化，加入完全培养基后，反复轻轻吹打细胞，使细胞重悬混匀，用计数板计数使其细胞浓度最终为200个/ml，吸取该浓度细胞悬液接种于6孔板中，每孔为1ml细胞悬液，将6孔板置于37℃，5％co2细胞培养箱中培养过夜；第二天加药，control组为完全培养基，给药组为山豆根片提取物15ug/ml、30ug/ml，将6孔板置于37℃，5％co2细胞培养箱中培养；经药物处理4天后，将6孔板中的培养基换成原先相应培养基，置于37℃，5％co2细胞培养箱中进行培养；经药物处理8天时在，弃去6孔板内的培养基，用1×pbs细胞清洗两次，然后加入4％多聚甲醛1ml固定细胞20min；弃去孔内的4％多聚甲醛，加入0.1％结晶紫燃料染色细胞18min；弃去孔内的结晶紫燃料，用1×pbs清洗2次，弃去1×pbs，用相机对6孔板进行拍照。实验重复三次。

1.5细胞划痕

倒置显微镜下观察cne-1细胞，当细胞生长至覆盖培养瓶80％的面积时将细胞进行常规消化，加入完全培养基后，反复轻轻吹打细胞，使细胞重悬混匀，用计数板计数使其细胞浓度最终为8×105个/ml，吸取该浓度细胞悬液接种于6孔板中，每孔为1ml细胞悬液，每组2个复孔，将6孔板置于37℃，5％co2细胞培养箱中培养过夜；6孔板在接种前先在背面用标记笔划三条平行线直线，每条线距离0.5cm左右。将6孔板置于37℃，5％co2细胞培养箱中培养过夜；待细胞铺满整个孔时，用200ul规格的黄色枪头垂直于原先用所标记的线，均匀的划三条直线；弃去孔内原先的完全培养基，用培养基清洗三次，空白孔加入含2％fbs完全培养基2ml，给药组分别加入山豆根片提取物浓度为10ug/ml和20ug/ml的含2％fbs完全培养基2ml，将6孔板置于37℃，5％co2细胞培养箱中培养；分别在0h、12h、24h对划痕区域进行拍照，不同时间拍照时确保位置一致；通过imagej软件对划痕区域进行处理，得出细胞的愈合率。

1.6细胞侵袭

倒置显微镜下观察cne-1细胞，当细胞生长至覆盖培养瓶80％的面积时将细胞进行常规消化，加入完全培养基后，反复轻轻吹打细胞，使细胞重悬混匀，用计数板计数使其细胞浓度最终为3×105个/ml，将6孔板置于37℃，5％co2细胞培养箱中培养过夜；第二天，弃去孔内原先的完全培养基，空白孔加入完全培养基2ml，给药组分别加入山豆根片提取物浓度为15ug/ml和30ug/ml的完全培养基，将6孔板置于37℃，5％co2细胞培养箱中培养24h、48h、72h；待24、48、72h时，用0.25％胰蛋白酶将6孔板上的细胞消化下来，收集与15ml离心管中，常温条件下，1000rpm离心5min；取出离心好的15ml离心管，用75％的酒精擦拭离心管外壁后转移至超净台，弃去上清，加入不含fbs的培养基后，反复轻轻吹打细胞，使细胞重悬混匀，用计数板计数使其细胞浓度最终为4×105个/ml，将transwell小室铺在24孔板中，吸取该浓度细胞悬液接种于transwell小室上室中，每孔200ul，设32个复孔，transwell小室下室加入650ul完全培养基，检查transwell小室上室和下室之间是否有气泡产生，若有气泡需除去气泡，将24孔板置于37℃，5％co2细胞培养箱中培养过夜42h；待42h时，弃去transwell小室上室和下室中的培养基，用1×pbs清洗transwell小室3次，加入4％多聚甲醛固定细胞15min；待15min时，弃去孔内4％多聚甲醛，用1×pbs清洗3次，加入0.1％结晶紫燃料染色细胞8min；待8min时，弃去孔内4％多聚甲醛，用用1×pbs清洗3次；用湿润的棉签擦去上室的细胞；待transwell小室干燥后，显微镜下用200×倍数观察，并随机取5个视野拍照；用imagej对照片进行计数，得出细胞侵袭的个数。

1.7细胞凋亡

倒置显微镜下观察cne-1细胞，当细胞生长至覆盖培养瓶80％的面积时将细胞进行常规消化，加入完全培养基后，反复轻轻吹打细胞，使细胞重悬混匀，用计数板计数使其细胞浓度最终为2×105个/ml，将6孔板置于37℃，5％co2细胞培养箱中培养过夜；第二天，弃去孔内原先的完全培养基，空白孔加入完全培养基2ml，给药组分别加入山豆根片提取物浓度为15ug/ml和30ug/ml的完全培养基，将6孔板置于37℃，5％co2细胞培养箱中培养24h、48h、72h；待24、48、72h时，用不含edta的0.25％胰蛋白酶将6孔板上的细胞消化下来，收集与15ml离心管中，常温条件下，1000rpm离心5min；取出离心好的15ml离心管，用75％的酒精擦拭离心管外壁后转移至超净台，弃去上清，加入bd凋亡试剂盒中预先配置好的1×bindingbuffer缓冲液重悬细胞，用计数板计数使其细胞浓度最终为1×106个/ml；取6个1.5ml的离心管，分别标记为1～6，从control组中取100ul细胞悬液加入1～4号离心管中，山豆根片提取物浓度为15ug/ml组取100ul细胞悬液加入5号离心管中，山豆根片提取物浓度为30ug/ml组取100ul细胞悬液加入6号离心管中，在4、5、6号管中加入bd凋亡试剂盒中的av和pi各5ul，1号管加入av5ul，2号管加入pi5ul，3号管什么试剂都不加，混匀后置于避光处室温静置15min；待15min时，1～6号1.5ml离心管中各加入400ul1×bindingbuffer缓冲液，混匀后置于避光处室温静置15min；待15min时，用流失细胞仪进行细胞凋亡的检测。

1.8细胞周期

倒置显微镜下观察cne-1细胞，当细胞生长至覆盖培养瓶80％的面积时将细胞进行常规消化，加入完全培养基后，反复轻轻吹打细胞，使细胞重悬混匀，用计数板计数使其细胞浓度最终为2×105个/ml，将6孔板置于37℃，5％co2细胞培养箱中培养过夜；第二天，弃去孔内原先的完全培养基，空白孔加入完全培养基2ml，给药组分别加入山豆根片提取物浓度为15ug/ml和30ug/ml的完全培养基，将6孔板置于37℃，5％co2细胞培养箱中培养24h、48h、72h；待24、48、72h时，用不含edta的0.25％胰蛋白酶将6孔板上的细胞消化下来，收集与15ml离心管中，常温条件下，1000rpm离心5min；取出离心好的15ml离心管，用75％的酒精擦拭离心管外壁后转移至超净台，弃去上清，加入bd周期试剂盒中缓冲液500ul重悬细胞，常温条件下，1000rpm离心5min，重复三次；第三次时加入加入bd周期试剂盒中的a试剂125ul轻轻混匀，常温条件下静置10min。然后加入bd周期试剂盒中的b试剂100ul轻轻混匀，常温条件下静置10min。最后加入bd周期试剂盒中的c试剂100ul轻轻混匀，冰上避光静置10min；用流失细胞仪进行细胞周期的检测；用modfitlt软件处理细胞周期图。

2.结果

2.1细胞增殖实验结果

为探讨山豆根片提取物对cne-1细胞增殖的影响，我们通过mtt法检测山豆根片提取物在一定浓度梯度下cne-1细胞的抑制率，结果如图9所示。研究结果表明抑制率与山豆根片提取物浓度和作用时间成正比，其24h、48h、72h的ic50分别为31.62ug/ml、27.25ug/ml、20.61ug/ml。

2.2细胞克隆实验结果

为探讨山豆根片提取物对cne-1细胞克隆形成率的影响，我们通过平板克隆法进行检测，结果如图10所示。研究结果表明，山豆根片提取物作用后的cne-1细胞，其克隆形成率要低于control组，并且随着山豆根片提取物浓度的增大和作用时间的延长，克隆形成率越低。在山豆根片提取物浓度为15ug/ml时，和control组相比克隆形成率无显著差异(p＞0.05)，但在山豆根片提取物浓度为30ug/ml时，与control组相比有显著性差异(p＜0.01)，大大降低了细胞的贴壁率和存活率，导致cne-1细胞的克隆形成率只有22.5％。因此得出山豆根片提取物可以降低鼻咽癌cne-1的细胞活力，从而降低细胞的增值力。

2.3细胞划痕实验结果

为探讨山豆根片提取物对cne-1细胞迁移率的影响，我们通过细胞划痕来进行检测，结果如图11所示。研究结果表明，山豆根片提取物浓度为15ug/ml和30ug/ml时对cne-1细胞的迁移能力都起到了一定的抑制作用，且细胞迁移率和山豆根片提取物浓度成反比。24h时，经高、低浓度组处理的cne-1细胞的愈合率分别为18.38±2.80％，22.76±2.68％，48h时，经高、低浓度组处理cne1细胞的愈合率分别为37.96±2.32％、44.01±3.54％，与control组相比，均有统计学差异(p＜0.01)，说明山豆根片提取物可以显著的抑制鼻咽癌细胞株cne-1的迁移能力。

2.4细胞侵袭实验结果

为探讨山豆根片提取物对cne-1细胞侵袭能力的影响，我们通过细胞侵袭实验来进行检测，结果如图12所示。研究结果显示，cne-1细胞经山豆根片提取物15ug/ml和30ug/ml作用后，其细胞的侵袭能力都得到了降低，特别是在高浓度72h时cne-1细胞穿过小室数量显著减少，与control组比较，有显著性差异(p＜0.01)，说明山豆根片提取物是可以显著的降低鼻咽癌cne-1细胞的侵袭能力。

2.5细胞凋亡实验结果

为了探讨山豆根片提取物抑制cne-1细胞增殖的影响机制，我们通过流式细胞仪观察山豆根片提取物作用cne-1后细胞的凋亡状况，结果图13所示。结果显示山豆根片提取物可以显著的促进细胞的凋亡，且其浓度和细胞凋亡率成正比，在72h时山豆根片提取物浓度为30ug/ml作用cne-1细胞后，其细胞凋亡率已达到55.58％，与control组比较，有显著性差异(p＜0.01)，说明山豆根片提取物可以促进cne-1细胞发生凋亡，提高cne-1细胞的凋亡率。

2.6细胞周期实验结果

为探讨山豆根片提取物对cne-1细胞周期的影响，我们通过流失细胞仪观察山豆根片提取物作用cne-1后细胞周期中dna分布状况，结果如图14所示。研究结果显示cne-1细胞经山豆根片提取物作用后，g0/g1期的dna含量分布增大，s期的dna含量分布减小，且山豆根片提取物的浓度越大，g0/g1期的dna含量分布越大，说明山豆根片提取物可以使鼻咽癌cne-1细胞的周期阻滞在g0/g1期，且和山豆根片提取物的浓度和作用时间呈依赖性。

实验例6：山豆根片提取物对人鼻咽癌细胞体内研究

1实验方法

1.1肿瘤接种

采用balb/c裸鼠，体重20g左右，4～6周龄，雄性，饲养于spf级无菌实验室，温度24～26℃，湿度52％～62％，每天光照8h，所用的鼠笼、水、饲料、垫料及所有带进该实验室的器具都均已消毒，每周星期2及星期5换掉料一次；倒置显微镜下观察cne-1细胞，当细胞生长至覆盖培养瓶80％的面积时将细胞进行常规消化，加入完全培养基后，反复轻轻吹打细胞，使细胞重悬混匀，用计数板计数使其细胞浓度最终为2×107个/ml，置于冰上；用酒精棉擦拭裸鼠右后肢腋下，用注射器吸取混悬均匀的细胞悬液注射100ul；待一周后，观察裸鼠注射部位是否成瘤，将裸鼠按体重的比例进行随机分组，分为control组(羧甲基纤维素钠)、高剂量(0.10544g/kg/d)、中剂量(0.05272g/kg/d)、低剂量(0.02636g/kg/d)组和顺铂组(13.43g/kg/d)，给药组分别为人体正常剂量的2、4、8倍，每组10只，隔两天对裸鼠的体重和肿瘤的体积进行测量；分组后一天给药，control组和山豆根片提取物高、中、低浓度组每天在相同时间点灌胃一次，连续灌胃3周，顺铂组每周腹腔注射一次连续注射3周；

1.2裸鼠活体成像

15mg/mlluciferase底物的配置：取1gluciferase底物溶解于66.7ml1×pbs中，混匀，使最终浓度为15mg/ml，用0.22um过滤器过滤，分装后-80℃冰箱保存；配置合适的戊巴比妥钠麻醉剂，按裸鼠的体重注射相应的剂量进行麻醉，确保裸鼠麻醉成功。裸鼠腹腔注射15mg/mlluciferase底物0.02ml，静置裸鼠15min；待15min时，将裸鼠置于活体成像仪上，收集各组裸鼠体内的荧光信号；

1.3获取指标

灌胃结束的后一天对裸鼠进行体重和肿瘤体积的测量；取1.5ml灭菌离心管固定于泡沫板上，固定裸鼠并使其眼球突出，用剪刀减去胡须，迅速夹去眼球，将血液收集与1.5ml灭菌离心管中，每只裸鼠取血量约1ml左右，将装有裸鼠血液的1.5ml灭菌离心管常温静置2～3h，3000rpm离心10min，吸取上清转移至新的离心管中，-80℃冰箱保存以备后续实验；颈椎处死裸鼠后，用镊子夹去裸鼠肿瘤附近的皮肤，用剪刀小心剪开皮肤后继续剪下肿瘤，将肿瘤表面的脂肪等一下组织去除，用生理盐水清洗肿瘤一次，置于滤纸上吸除表面残余生理盐水后称重并记录，同时按分类序号将肿瘤进行排序，同时用直尺作为参照物对肿瘤进行拍照；将裸鼠肿瘤分为两部分，一部分用4％多聚甲醛保存，一部分置于-80℃冰箱中保存，以备后续实验；

2实验结果

2.1裸鼠体重变化趋势

结果见下表。研究结果表明与control组相比，顺铂组、山豆根片提取物高剂量、山豆根片提取物中剂量、山豆根片提取物低剂量组的成瘤裸鼠体重无显著差异，说明山豆根片提取物在作用于成瘤裸鼠过程中，体重无明显变化。

2.2裸鼠体内肿瘤荧光强度变化

结果见下表。研究结果显示与control组相比，顺铂组肿瘤荧光发光强度在给药后第6d开始有差异(p＜0.05)，给药21d其抑瘤率为54.22％±14.04％。山豆根片提取物高剂量、山豆根片提取物中剂量、山豆根片提取物低剂量组的肿瘤荧光发光强度在给药后第12d开始有显著差异(p＜0.01)，给药21天其抑瘤率为52.15％±14.65％、40.61％±17.51％、37.89％±12.79％，表明山豆根片提取物可以抑制鼻咽癌成瘤裸鼠体内的肿瘤。

注：^*，与control组相比，p＜0.05，^**，与control组相比，p＜0.01

实验例7：山豆根片的安全性研究

1实验方法

1.1小鼠急性毒性ld50实验

20只昆明种小鼠，雌雄各半，7～9w龄，体重20g左右。适应性喂养3d，禁食12h后，随机分为4组，分别为control组和高(40g/kg/d)、中(20g/kg/d)、低剂量组(10g/kg/d)。灌胃前禁食不禁水14h，一天灌胃莨次，control组灌服羧甲基纤维素钠，给药后常规饲养，观察小鼠对山豆根片提取物的毒性反应，连续给药7d。

结果发现当山豆根片提取物浓度为40g/kg灌胃小鼠时小鼠并无死亡现象，表明山豆根片提取物的ld50＞40g/kg，山豆根片提取物的毒性很小，因此给为最大耐受量。

1.2小鼠急性毒性最大耐受量实验

小鼠20只，雌雄各半，7～9w龄，体重20g左右。适应性喂养3d，禁食12h后，control组灌服羧甲基纤维素钠，给药组灌服浓度为40g/kg的山豆根片提取物，每天灌胃3次，每8h时灌胃一次，第三次给药2h后给饲料。分别在第1、3、5、7d时对小鼠的进食量和体重称量。给药组一天小鼠总共给药量为120g/kg，经换算为人体正常给药的154倍，control组灌胃等体积的羧甲基纤维性钠，给药后常规饲养，观察7d。观察小鼠外表行动，反射活动，饮水量，大、小便情况，记录小鼠死亡数目、死亡时间和体重。第8d脱颈处死小鼠，取肝脏相同部分组织，10％甲醛固定，石蜡切片，常规he染色，光学显微镜下观察肝脏组织病理学变化。

1.3大鼠长期毒性实验

取sd大鼠80只，雌雄各半，7～9w龄，体重200g左右。适应性喂养3d，禁食12h后，随机分为四组，每组20只，雌雄各半，分笼饲养。由于本山豆根片提取物的毒性较小，药物溶解度有限，将给药组分山豆根片提取物分为低(8.1g/kg/d)、中(16.2g/kg/d)、高(24.3g/kg/d)剂量组，分别相当于人体正常用量的15、30、45倍，为另设一个control组，给药组每日固定时间灌服一次山豆根片提取物溶液，control组灌服羧甲基纤维素钠。灌胃前禁食不禁水14h，间隔期间不供食，给药后常规饲养。每日观察小鼠外表行动，反射活动，饮水量，大、小便情况，记录大鼠死亡数目和死亡时间。每周称量体重，按体重及时调整给药剂量。每组小鼠灌胃给予山豆根片提取物13w后，每组随机选取10只大鼠，雌雄各半，末次给药24h后，用10％的水合氯醛麻醉，腹主动脉取血10ml，快速取心、肝、脾、肺、肾，用滤纸吸干，分别称量其重量，并计算脏器指数(脏器系数＝脏器湿重/动物体重*100)。大鼠血液在4℃1000g·min-1的条件下，离心20min，吸取血清，-20℃保存。按试剂盒操作说明检测血清中bun、akp、alt、ast、白蛋白、总蛋白、胆红素、ck、tch、k+、cl-、na+的含量。每组大鼠剩余大鼠雌雄各5只，停药继续观察4w后采集上述相应指标，方法同上。

2实验结果

2.1小鼠急性毒性及最大耐受剂量实验结果

为了确定山豆根片提取物是否具有急性毒性，我们通过小鼠急性毒性实验进行安全性评价，实验过程中均无小鼠死亡，饮食、大小便、行为活动均正常，病理切片显示肝脏并没出现病理变化，体重、脏器指标与control组相比均无显著性差异。

2.2大鼠长期毒性实验结果

通过大鼠长期毒性实验再次对山豆根片提取物进行安全性评价，实验结果表明，山豆根片提取物降低了ast和钠离子的指标，体重、脏器与control组比较均无差异，期间并无大鼠死亡，饮食、大小便、行为活动均正常，脏器的病理切片也无变异。

实施例8：山豆根片治疗大鼠阻塞型肺炎的实验研究

1实验方法

1.1动物模型的制备

雄性wistar大鼠购自广西医科大学实验动物中心(9～10周龄，体重200±18g)。实验动物于实验前1周开始饲养。大鼠分笼饲养(每笼10只)，室温维持在23-26℃左右，饲养期间大鼠自由摄食及饮水。大鼠随机分为3组，每组10只：正常对照组(c组)，香烟烟雾模型组(cs组)，山豆根片+香烟烟雾模型(sdg+cs组)。cs组大鼠暴露于16支香烟烟雾中(每支香烟中含有0.9mg尼古丁，14mg一氧化碳和12mg焦油)；每天2次，每周6天，共12周，每次30min然后将滤网移除。sdg+cs组大鼠暴露于cs中12周，每天口服1次sdg，灌胃，剂量为60mg/kg，从12周暴露期的第1天开始，在香烟烟雾暴露前0.5h进行药物治疗。对照组每天盐水作为对照灌胃。每天观察各组大鼠被毛、活动性、饮食、咳啼等一般情况。在第12周结束时，腹腔注射40mg/kg剂量戊巴比妥后取血处死大鼠，分离血清备用。通过结扎右主支气管，对大鼠进行左侧单侧肺灌洗，每次2ml生理盐水，灌洗肺泡3次后回抽放人ep管中，再抽取生理盐水2ml重复上述动作2次，每次灌洗后立即回吸，反复共3次，最终的回收量约为4.5ml肺泡灌洗液(balf)(回收率约75％)，将所有回吸液置于10mlep管中，立即进行离心，1000r/min，离心10min，留取上清液，弃去细胞沉渣。分装保存于-80℃备用。

1.2检测指标

按照酶联免疫吸附(elisa)试剂盒的说明进行操作，测定balf中tnf-α及il-8的含量。

2实验结果

2.1各组大鼠血清中ifn-γ和il-4含量变化

与c组相比，cs组血清中ifn-γ含量明显减少(p<0.01)；与cs组相比，山豆根片组血清中ifn-γ含量均明显增高(p<0.01)。与c组相比，cs组血清中il-4含量明显增高(p<0.01)；与cs组相比，山豆根片组血清中il-4含量均明显减少(p<0.01)。具体结果见下表。

注：与cs组比较，^**p<0.01

2.2各组大鼠balf中tnf-α和il-8的含量变化

与c组比较，cs组大鼠balf中炎症介质tnf-α及il-8表达均明显增高(p<0.01)；经山豆根片干预后，炎症介质tnf-α及il-8含量均有所降低(p<0.01)。具体结果见下表。

注：与cs组比较，^**p<0.01

综上，山豆根片可能能够通过减少血清中il-4的生成和促进ifn-γ的表达来维持thl细胞与th2细胞之间的动态平衡，同时通过减少balf中tnf-α和il-8的含量起到良好的抗炎和调节免疫作用，其机制仍需要大量的动物实验及临床观察来进行进一步研究。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。