一种用于角膜移植免疫排斥反应治疗的药物

1.本发明涉及角膜移植中免疫抑制相关领域，具体涉及一种利用调节性t细胞或rock蛋白抑制剂诱导角膜移植免疫耐受，抑制角膜移植免疫排斥反应的发生。


背景技术：

2.角膜盲是由于角膜失去功能导致视功能丧失的一类眼病；通常是由于眼部遭受疾病或外伤等原因，导致角膜受到不同程度的伤害，发生混浊、破裂或感染等导致。通常，导致角膜盲的原因主要有：感染性角膜病、非感染性角膜炎、角膜变性和角膜营养不良、圆锥角膜、眼外伤、眼睑损伤和干眼病等。由于角膜病损或角膜外伤都是仅角膜失去透明性，变混浊，而眼球内部结构正常，所以如果能用透明健康的角膜将病变角膜置换掉，病人的视力即可得到明显的改进，因此，角膜盲是可治愈眼盲。
3.据世界卫生组织统计，全球角膜盲患者可能高达6000万人，而国内约有500万人，且每年以10万认以上的规模增长，排在致盲眼病的第二位。目前角膜移植仍是治疗此类疾患最主要的手段；但在临床上，角膜移植材料的供给与需求之间存在着巨大的差异，世界各地的角膜来源均处于稀缺状态，而中国更是奇缺，不少患者只能被动地等待捐献。为了解决眼角膜不足的问题，世界各地的研究人员都在多方面努力进行有关开发代替性的新型移植材料的研究。随着一些关键技术的突破，角膜抑制正在掀起新的风暴，成为一种较为理想的角膜移植替代材料。目前，猪角膜已经成功用于人眼移植；但利用角膜进行移植，手术后的免疫排斥反应成为导致手术失败的主要原因。
4.虽然正常角膜组织无血管、淋巴管，处于相对“免疫豁免”的状态，但由于病变角膜组织炎症反应、新生血管等因素的存在，角膜移植术后很容易出现排斥反应，导致手术失败。
5.目前临床中针对角膜移植术后的免疫排斥反应主要通过药物治疗，一般需要长期使用。其中糖皮质激素、免疫抑制剂（如环孢素、他克莫司）的应用最为广泛。这些药物的应用包括局部和全身的应用。对于全身应用而言，这些药物长期使用通常会引起肝肾损伤、感染、肿瘤等严重的全身副反应；对于眼部局部的应用而言，糖皮质激素等药物也存在引发激素性青光眼、白内障、干眼症等并发症的问题，同时也不利于角膜植片的长期存活。因此针对角膜移植免疫排斥反应的发生机理，研究出更具有针对性的治疗方式具有积极意义。在角膜移植的相关领域，已有一些研究进展。有研究指出调节性t细胞分泌的tgf-β滴眼液可以有效防治角膜移植排斥反应，延长角膜植片存活时间。
6.但在本技术之前，没有研究将cd4
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tregs细胞用于角膜移植的免疫排斥抑制，也没有研究对所述cd4
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tregs细胞调节免疫排斥的调节机制进行研究；本技术不仅验证了cd4
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tregs细胞维持角膜移植免疫耐受，移植免疫排斥方面的作用，还对该调节路径进行了系统性研究，并发现通过调节rock蛋白（主要是rock2蛋白）能够实现对角膜移植排斥的有效抑制，延长角膜植片存活时间。


技术实现要素：

7.调节性t细胞（regulatory t cells，treg）是一类具有独特免疫调节功能的t细胞亚群，包括cd4
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cd25
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t细胞、辅助性t细胞iii型等，它们可以抑制病理或生理免疫反应活性，在维持自身免疫耐受和免疫稳态方面发挥重要功能。过往的研究，主要聚焦在cd4
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cd25
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t细胞，近年来，以潜能相关肽（latency-associated peptide,lap）为细胞表面标志的cd4
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tregs细胞被鉴定出来。一些研究发现cd4
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tregs细胞被认为是新的具有免疫抑制作用的调节性t细胞亚群。lap作为tgf-β的分子伴侣，可以在细胞表面释放出与lap相结合的tgf-β,即ltgf-β(latent tgf-β)。alessandra metelli等研究发现，tregs表面的跨膜蛋白与ltgf-β相结合，通过lap的水解作用，释放出有活性的tgf-β，促进tregs发挥负性免疫调控作用。如zhang l等人发现通过诱导系统性红斑狼疮的患者外周血单核细胞（pbmcs）中tregs表面lap的表达可以抑制免疫反应的发生。da cunha ap等人研究发现在实验性自身免疫性脑脊髓炎的动物模型中，阻断lap的表达，可以降低cd4
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tregs细胞的表达，拮抗口服cd3抗体诱导的免疫耐受。但目前并无cd4
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tregs细胞在角膜移植领域的作用的相关研究。
8.众所周知，角膜组织无血管、淋巴管，处于相对“免疫豁免”的状态，但由于病变角膜组织炎症反应、新生血管等因素的存在，角膜移植术后才会出现排斥反应；也就是说，角膜移植的排斥反应是有别于其他移植手术的。因此，在其他器官或组织移植领域能够起到相关移植或导致免疫反应发生的试剂，并不见得在角膜移植领域同样适用。
9.本技术发明人一直致力于角膜移植领域的研究与实践，在之前的研究中证实了自然杀伤性t细胞对角膜移植免疫抑制的作用机制。但自然杀伤性t细胞在角膜移植免疫治疗中会引发较强的局部副反应，因此，亟需寻找一种新的、更具针对性的角膜移植调控路径和药物。经过大量的研究与实验，本技术发明人通过建立小鼠同种异体角膜移植模型，发现在角膜植片发生排斥时，cd4
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tregs细胞比例明显降低，使用anti-lap的单克隆抗体腹腔注射至小鼠体内，发现可以减少多种tregs细胞的数量。并在进一步研究中证实， cd4
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tregs细胞在体外和体内的角膜移植免疫抑制功能。相较于自然杀伤性t细胞的调节，cd4
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tregs细胞具有更强的移植免疫调控针对性，也避免了t细胞治疗对于局部的副反应。
10.为了提供更多更优的角膜移植免疫药物选择，本技术发明人进一步对所述cd4
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tregs细胞的调节路径进行了相关研究。通过大量的研究和实验，本技术发明人证明，rock蛋白（尤其是rock2蛋白）是调节cd4
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tregs细胞表达的关键因素。
11.研究表明，rho蛋白属于小g蛋白超家族的亚家族成员，到目前为止，已发现了20多个rho家族成员，其中rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶（rho associated coiledcoil forming protein kinase，rock）是其中及其重要的酶之一。rock蛋白主要包括rock1和rock2两种蛋白。rock蛋白调节多种关键细胞功能，包括细胞增殖、迁移和活性。本技术发明人通过实验证实，rock蛋白抑制剂（尤其是rock2蛋白抑制剂）能够显著增强cd4
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tregs细胞抑制免疫反应的功能，延长角膜移植中植片的存活时间。
12.因此，本发明的目的在于，提供一种使用cd4
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tregs细胞抑制角膜移植手术中免疫排斥反应，维持角膜移植处于免疫耐受状态，提高植片存活时间的方法。
13.同时，本发明提供一种cd4
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tregs细胞调节通路，通过对通路中不同蛋白的调节实现对cd4
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tregs细胞表达的调节，进而起到抑制角膜移植手术中免疫排斥反应，维
持角膜移植免疫耐受状态，提高植片存活时间的方法。
14.优选地，本发明通过使用rock抑制剂实现对所述cd4
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tregs细胞的高表达调节，进而实现抑制角膜移植手术中免疫排斥反应，维持角膜移植处于免疫耐受状态，提高植片存活时间的功效；最优选地，所述抑制剂为rock2蛋白抑制剂。
15.因此，本发明还提供一种药物组合物，所述药物组合物含有cd4
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tregs细胞，所述组合物能够用于抑制角膜移植手术中的免疫排斥反应，维持角膜移植处于免疫耐受状态，提高植片存活时间。优选地，所述药物组合物还含有生理盐水。
16.本发明的所述的cd4
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tregs细胞制备方法包括但不限于：从正常balb/c小鼠脾脏中分选获得，并可以通过体外进一步扩增获得。
17.进一步地，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物含有rock蛋白抑制剂，所述药物组合物同样能够调节cd4
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tregs细胞高表达，进而抑制角膜移植手术中免疫排斥反应，维持角膜移植免疫耐受状态，提高植片存活时间。
18.本发明所述的rock蛋白抑制剂包括但不限于抗体、sirna、具有抑制活性的小分子化合物、短肽等能够降低和/或阻止所述rock蛋白表达和/或活性的物质。
19.优选地，所述rock蛋白抑制剂为rock2蛋白抑制剂，更优选地，所述rock2蛋白抑制剂为kd025。kd025是一种rock2的选择性口服抑制剂，其分子结构如下所示：说明书附图图1: rock2蛋白sirna对cd4
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tregs细胞细胞体外免疫抑制率对比图；图2：kd025治疗小鼠角膜移植排斥反应结果图：（a）术后植片存活时间对比图，（b）术后8周植片对比图。
具体实施方式
20.以下实施方式进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制，在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明的方法、步骤和条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
21.实施例1：cd4
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tregs细胞的制备无菌分离balb/c小鼠脾脏，碾磨200目滤网过滤，制备细胞悬液。按照小鼠cd4
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tregs细胞分离试剂盒分离cd4
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tregs细胞，流式细胞仪分析cd4+lap+tregs细胞纯度并
将分离后的cd4
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tregs细胞计数。调整细胞浓度为1
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106/ml，加入cd3/28抗体珠（按照细胞和珠子比例为2:1）并加入浓度为1000ng/ml的il-2进行培养。培养第5-7天，进行anti-cd4 fitc，anti-lap percp-cy5.5染色，使用流式细胞仪分选出cd4
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tregs细胞，分选后进行纯化回测，lap在体外培养扩增组的表达可为（85.76
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5.01）%。
22.实施例2：小鼠角膜移植排斥反应模型的构建采取balb/c (h-2d)小鼠作为受体，c57bl/6 (h-2b)小鼠作为供体，供受体小鼠均为雄性，8-10周龄。按照如下操作制备小鼠角膜移植模型，并验证cd4
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tregs细胞的作用：（1）小鼠麻醉：采用4%水合氯全，腹腔注射。麻醉后清除小鼠口腔异物，保持水平体位。麻醉过程中注意小鼠保温。
23.（2）小鼠角膜移植术：手术方法采用11-0单纯间断缝合。植片的制备：c57小鼠术前一小时复方托吡卡胺散瞳，2.5mm换钻钻取植片，显微镊沿印记剪下，注意不要碰到虹膜。可用粘弹剂维持前房。植片取下后放入pbs中备用。植床的制备：balb/c小鼠术前1小时复方托吡卡胺散瞳，2mm环钻钻取植片，1ml针头前房穿刺，粘弹剂打入前房。显微镊沿印记减除植片，移植过程：放入植片，11-0线沿植片边缘到植床对应缝合8针，水密/气密切口。术闭，典必殊膏点眼，8-0线缝合眼睑。
24.实验分为a组（同种同系角膜移植组）与b组（同种异系角膜移植组）。a组同种同系组：balb/c (h-2d)小鼠分别作为受体和供体。b组同种异系组：采取balb/c (h-2d)小鼠作为受体，c57bl/6 (h-2b)小鼠作为供体。
25.术后1天，拆除眼部缝线，裂隙灯显微镜下观察。术后1-3天，术后1周，2周，3周，4周持续观察。
26.角膜排斥判定标准：（参照holland评分标准），当植片总评分≥5 分或混浊评分≥2 分时，认为植片发生排斥反应。排除标准：术后出现的虹膜嵌顿，虹膜前粘，植片脱失，晶体脱位，前房出血，眼内炎。角膜移植术后28天，未发生角膜植片排斥，认为达到免疫耐受；发生角膜植片排斥，认为达到免疫排斥。
27.具体评分标准分为植片混浊评分、植片水肿评分和植片新生血管生长评分；三者的总和为植片总评分，具体的评分标注如下（评分标准如下(参照holland ej，chan cc，wetzig rp，et al.clinical andimmunohistologic studies of corneal rejection in the ratpenetrating keratoplasty model.cornea，1991，10(5)：374-380.）：（1）根据混浊情况，将角膜植片分为0-5分，标准如下：
（2）根据植片水肿情况，将角膜植片分为0-3分，标准如下：（3）根据植片新生血管生长情况，将角膜植片分为0-3分，标准如下：
28.实施例3：cd4
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tregs细胞治疗小鼠角膜移植排斥反应在实施例3的小鼠角膜移植手术结束后，向每组小鼠注射10微升浓度为5x105/ml 实施例1制备的cd4
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tregs细胞；并以未注射cd4
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tregs细胞的同种异系角膜移植小鼠为对照。结果显示，注射cd4
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tregs细胞的小鼠，其植片的存活时间明显延长，相较于对照组，平均延长15
±
1.32天。
29.实施例4：rock2蛋白sirna对cd4
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tregs细胞体外免疫抑制功能检测cd4
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效应性t细胞是与移植免疫排斥相关的一种t细胞，主要通过直接或间接途径识别抗原表面mhc2受体，通过分泌淋巴因子或细胞直接杀伤作用从而发挥免疫功能。cd4
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tregs细胞是一种新型调节性t细胞，与移植免疫耐受相关，主要发挥免疫抑制功能。cd4
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tregs细胞对于cd4
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效应性t细胞增殖抑制作用体现了cd4
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tregs细胞对移植的调控能力。抑制率越高，移植免疫越倾向于免疫耐受。通过使用rock2蛋白的sirna 体外干扰方法作用于实施例1制备的cd4
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tregs细胞；观察对cd4
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tregs细胞对cd4
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效应t细胞增殖抑制功能的影响。
30.将实施1制备得到的cd4
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tregs细胞，浓度调整至1
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105个细胞，与cd4
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效应性t细胞按不同比例（1∶1、1∶2、1∶4、1∶8）共培养3天，其中添加针对rock2蛋白的sirna，未加入sirna的组作为对照。采用cfse法测定细胞增殖，抑制率的计算方法为抑制率%=[（未加入sirna的效应t细胞增殖－加入sirna的效应t细胞增殖）/未加入sirna的效应t细胞增殖]
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100%，具体结果如图1所示。根据图1结果可知，不同细胞比例时，rock2的sirna调控cd4
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tregs细胞对效应t细胞的抑制作用均强于同比例下的未添加rock2的sirna的cd4+ lap+tregs细胞，具有显著差异(p<0.05)，尤其当rock2的sirna调控cd4
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tregs细胞与效应t细胞比例为 1∶1、1∶2时，对效应t细胞增殖的抑制效果更加显著。
[0031]
实施例5：rock2蛋白抑制剂kd025治疗小鼠角膜移植排斥反应同种异体角膜移植小鼠（实施例2制备的小鼠模型），术后对小鼠腹腔注射kd025
（150mg/kg）为实验组，对小鼠腹腔注射pbs作为对照组，同时设同种同体移植组排除手术操作对植片存活的影响，每组各10只，发现kd025组可以明显延长植片的存活时间。采用kaplan-meier存活曲线分析各组小鼠植片存活时间见图2。由图2（a）中可见小鼠角膜移植术后实验组、对照组两组随时间延长，植片存活率均逐渐降低，但实验组植片存活曲线始终位于对照组上方，且在8周时，实验组植片存活率仍有50%。从而提示术后对小鼠腹腔注射kd025（150mg/kg）对于植片的存活率具有积极影响。术后8周植片外眼像见图2（b），pbs对照组植片水肿增厚，kd025治疗后植片仍透明；差异非常明显。实验结果提示，kd025可以有效延长小鼠同种异体角膜移植的植片存活时间。