本发明属于植入性生物材料表面改性技术领域，具体涉及一种载sr和ag的提高生物相容性的医用钛材制备方法。
背景技术：
由于钛及其合金具有优异的机械性能和耐生理腐蚀性能，在硬组织材料领域具有广泛的应用，然而，由于表面生物相容性较差，因此植入体内后与骨组织的整合性较差，并且不能促进骨组织再生。目前，大量的表面改性技术用于提高医用钛材的生物相容性，包括等离子体喷涂、离子注入、酸碱处理、沉积ca-p涂层，制备高分子涂层以及原位固定生物分子等。但是这些方法步骤复杂，有些方法还需要特殊的设备，并且生物相容性也不够理想。
通过物理化学方法在钛材表面构建多孔的纳米结构，不仅可以促进骨细胞生长和增殖，而且可以促进骨组织长入，从而提高材料的骨整合性能。电化学氧化是一种经济简便的在钛表面原位制备纳米结构的重要方法，通过控制适当的工艺条件，可以在钛材表面原位形成纳米管阵列结构，并且可以调整工艺参数控制纳米管的直径和长度。因此，通过电化学氧化制备的纳米管阵列涂层可以促进骨组织再生，提高骨整合性。通过在纳米管内部装载生物活性分子、药物或者纳米粒子可以进一步提高其生物相容性和其它性能。
医用钛材用于骨替代材料，除了要具备良好的骨再生能力外，还需要具有优异的抗菌性能以便阻止由于植入引发的感染，尽管钛材表面的纳米管结构可以促进成骨细胞的生长，但其抗菌性能却很差。近年来的研究发现，金属离子在生物材料的生物相容性方面发挥着十分重要的作用，例如，cu2+具有良好的抗菌性能，促内皮细胞生长性能和良好的血液相容性。sr是一种在人体骨组织中广泛存在的微量元素，在骨组织的生长发育中起到非常重要的重要，sr2+可以促进骨细胞生长、增殖和分化。银是一种重要的无机抗菌剂，具有广谱抗菌特性，并且不产生耐药性。因此，将sr和ag同时装载在钛材表面的纳米管阵列结构中，可以同时赋予材料优异的促成骨性能和抗菌性能。
技术实现要素：
发明目的：本发明的目的在于提供一种载sr和ag的提高生物相容性的医用钛材制备方法，通过钛材表面sr2+和ag+的持续释放，促进骨组织再生，提高植入材料的骨整合性能，并赋予材料优异的抗菌性能，有效预防植入后的感染。
技术方案：为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种载sr和ag的提高生物相容性的医用钛材制备方法，包括如下步骤：
1)以医用钛材作为阳极，采用电化学氧化的方法在钛材表面制备规整的纳米管阵列涂层，然后在空气中进行热处理；
2)将步骤1)获得的材料在含sr2+的溶液中进行水热处理；
3)将步骤2)获得的材料浸没到含银离子的溶液中充分吸附，最后采用高压汞灯进行紫外照射，将吸附的银离子还原为银纳米颗粒，获得载锶和银纳米颗粒的纳米管涂层材料。
进一步地，步骤1)中，电化学氧化的电压为30-70v，处理时间为1-4小时，电化学氧化的电解质为含有0.1wt％-1wt％的nh4f和去离子水的乙二醇溶液；所述的热处理温度400-550℃，热处理时间1-4小时。
进一步地，步骤2)中，水热处理温度为200-400℃，时间0.5小时-2小时。
进一步地，步骤2)中，含sr2+的溶液为sr(oh)2的水溶液，浓度为0.01m-0.05m。
进一步地，步骤3)中，含银离子的溶液为agno3溶液，浓度为0.01m-0.1m，吸附时间为5-30分钟。
进一步地，步骤3)中，紫外照射时间为10-60分钟，波长为365nm。
有益效果：与现有技术相比，本发明的一种载sr和ag的提高生物相容性的医用钛材制备方法，通过该方法对骨植入材料进行表面改性，具备以下优势：
1)将促成骨细胞生长的sr2+以及具有良好抗菌性能的ag纳米颗粒装载在氧化钛纳米管中，同时赋予材料优异的成骨性能和抗菌性能，提高材料的骨整合性能和预防植入后感染的发生；
2)活性金属离子(sr2+和ag+)的释放时间超过14天，可以更长时间地发挥作用，持续提高材料的生物相容性；
3)独特的孔状纳米管结构有助于组织快速长入，提高骨整个能力。
附图说明
图1为医用钛材表面装载sr2+及银纳米颗粒的步骤示意图；
图2为钛材表面纳米管阵列(tnt)、载sr2+的纳米管阵列(tnt-sr)以及载sr/ag的纳米管阵列(tnt-sr/ag)的表面形貌；
图3为sr/ag离子的释放行为示意图；
图4为成骨细胞的增殖行为的示意图；
图5为钛材表面的细菌粘附性能和抗菌性能示意图。
具体实施方式
为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种载sr和ag的提高生物相容性的医用钛材制备方法。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外，应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
如图1所示，一种载sr和ag的提高生物相容性的医用钛材制备方法，包括如下步骤：
1)以医用钛材作为阳极，采用电化学氧化的方法在钛材表面制备规整的纳米管阵列涂层，并在空气中进行热处理；
2)将步骤1)获得的材料在含sr2+的溶液中进行水热处理；
3)将步骤2)获得的材料浸没到含银离子的溶液中充分吸附，最后采用高压汞灯进行紫外照射，将吸附的银离子还原为银纳米颗粒，获得载锶和银纳米颗粒的纳米管涂层材料。
步骤1)中，电化学氧化的电压为30-70v，处理时间为1-4小时，电化学氧化的电解质为含有0.1wt％-1wt％的nh4f和去离子水的乙二醇溶液；热处理温度400-550℃，热处理时间1-4小时。
步骤2)中，水热处理温度为200-400℃，时间0.5小时-2小时。
步骤2)中，含sr2+的溶液为，sr(oh)2的水溶液，浓度为0.01m-0.05m。
步骤3)中，含银离子的溶液为agno3溶液，浓度为0.01m-0.1m，吸附时间为5-30分钟。
步骤3)中，含银离子的溶液为agno3溶液，浓度为0.01m-0.1m，吸附时间为5-30分钟。
步骤3)中，紫外照射时间为10-60分钟，波长为365nm。
实施例1
图1表示了钛材表面载sr和ag纳米颗粒的制备过程示意图，医用钛材在50ml含有0.25wt％和6ml去离子水的乙二醇溶液中，以钛材为阳极，铂片为阴极，进行电化学氧化3小时，氧化电压为50v。样品清洗后获得表面纳米管阵列涂层，将获得的材料在500℃的空气气氛中热处理2小时(tnt)，然后，将获得的材料浸没到0.02m的sr(oh)2溶液中，热水釜中200℃处理1小时，获得载sr的纳米管涂层(tnt-sr)；最后，将样品浸没到0.02magno3充分吸附10分钟，干燥后用365nm的紫外光照射10分钟，将吸附的ag+转化为银纳米颗粒，获得载sr和ag的氧化钛纳米管涂层材料(tnt-sr/ag)。
对上述获得的材料进行表面喷金，然后采用扫描电镜观察表面形貌，可以明显看到管状的纳米管结构以及银纳米颗粒(图2)。
将tnt-sr/ag浸没到pbs溶液中不同时间，收集溶液中的sr2+和ag+，采用原子吸收光谱测量离子浓度，绘制释放曲线，得到图3的释放曲线，可以看出，两种金属离子的释放都超过了14天。
图4(a)采用cck-8实验评价的成骨细胞的增殖行为；(b)不同材料表面成骨细胞的碱性磷酸酶表达情况；(c)不同样品表面成骨细胞骨钙素表达情况；(d)采用茜红素染色评价的成骨细胞矿化行为。ti表示空白钛样品，tnt，表示电化学氧化后的具有纳米管状结构的钛材料；tnt-sr表示装载sr的钛材料；tnt-sr/ag表示装载sr和ag的钛材料。
图5表示钛材表面的细菌粘附性能(a)和抗菌性能(b)。ti表面空白钛样品，tnt，表示电化学氧化后的具有纳米管状结构的钛材料；tnt-sr表示装载sr的钛材料；tnt-sr/ag表示装载sr和ag的钛材料。
将成骨细胞接种到不同材料表面，进一步对增殖行为和细胞功能进行表征(图4)，可以看出，细胞在载金属离子的纳米管表面具有优异的增殖性能，与空白钛材相比，装载sr和ag的医用钛材的ckk-8值最高，表明材料具有显著促进细胞增殖的作用(图4(a))。同时，由图4(b)-(c)可以看出，载sr和ag的医用钛材还可以明显上调碱性磷酸酶和骨钙素的表达。另外，由图4d还可以看出，载sr和ag的医用钛材可以显著促进成骨细胞矿化(图4(d))。
将大肠杆菌接种在不同材料表面，进行细菌粘附和抗菌实验，可以看出，纳米管阵列结构以及载金属离子的材料都对细菌粘附具有明显的抗粘附作用(图5(a))，载银纳米颗粒的材料还具有优异的抗菌杀菌效果(图5(b))。
离子释放实验(图3)：将tntas-sr/ag浸泡在5ml，37℃的pbs溶液中1h、3h、5h、7h、1d、3d、7d、14d时取样0.5ml，设置三个平行样品，用电感耦合等离子体发射光谱仪(optima7000dv)测量sr、ag离子不同阶段的释放浓度，并与标准曲线比较，绘制离子释放曲线。
成骨细胞增殖实验：将样品放在24孔培养板中，在超净台上对样品使用紫外灯进行灭菌，然后在每个样品中加0.5ml的成骨细胞(5×104个细胞/ml)悬液和1.5ml细胞培养液。37℃，5％co2环境下分别培养1、3天后，用pbs洗涤样品3次。加入cck-8溶液(cck-8:细胞培养液＝9：1)0.5ml，在37孵化箱中孵化3.5小时。后吸取200μl放入96孔板中，用酶标仪(bio-tek，eons)测量450nm处的吸光度，来测定成骨细胞的增殖活性。
alp及ocn测量：采用酶联免疫吸附测定(elisa)的方法测量alp及ocn的活性。根据酶联免疫试剂盒的说明，将成骨细胞在样品表面培养1天和3天，吸取成骨细胞培养上清液。将上清液稀释5倍后，37℃孵育30分钟，并将样品板清洗5遍。然后加入酶标试剂50μl，继续37℃孵育30分钟，洗涤5次。最后加入显色剂a和b各50μl，37℃避光显色10分钟后，加入终止液50μl终止反应，并使用酶标仪在450nm波长处测定od。
细菌粘附(图5a)：将大肠杆菌至于液体培养液中培养20h，吸取10ml菌液，2000rpm离心3min，将细菌分散均匀。将菌液稀释10倍后吸取50微升滴在样品表面孵化2h，进行细菌粘附。随后使用pbs清洗样品3遍，并使用2.5％的戊二醛溶液固定2.5h，之后用pbs清洗样品，最后使用50％，70％，90％，100％乙醇溶液脱水，每次10分钟。样品表面喷金后，用扫描电子显微镜(sem，feiquanta250)观察细菌粘附的情况。
抗菌实验(图5b)：将大肠杆菌至于液体培养液中培养过夜，吸取10ml菌液，1300rpm离心5min，判断细菌存活情况及数量。将菌液重新摇匀，稀释至吸光度值接近0.01左右。将样品置于12孔板中，吸取500微升稀释后的菌液滴加到样品表面，37℃培养30min，然后分别加入1500微升的灭菌去离子水，继续在37℃培养24h。吸取50微升样品板中的菌液，滴加到固体培养基表面涂抹均匀，37摄氏度培养过夜后拍照观察。