一种玫瑰石斛啶碱制备抗结肠癌药物的用途的制作方法

本发明属于医药领域，具体涉及一种玫瑰石斛啶碱制备抗结肠癌药物的用途。

背景技术：

恶性肿瘤是当前危害人类健康的最严重的疾病之一，发病率呈逐年上升趋势，预计到2020年末全球新发肿瘤病例将达2000万。恶性肿瘤的治疗方案研究刻不容缓。

化疗是目前治疗癌症的主要手段之一。化疗药(chemotherapeuticagents)又称细胞毒类药物(cytotoxicdrugs)，自上世纪40年代起应用于抗肿瘤治疗，其临床应用历史悠久、适应症广，在肿瘤药物治疗中占有重要地位。化疗药的作用机制各异，但均是通过作用于肿瘤细胞增殖和存活所必需的关键细胞生物学事件，实现其抗肿瘤作用。根据其作用机制不同，化疗药可分为：①影响dna化学结构的药物，如环磷酰胺、顺铂等；②抑制核酸合成的药物，如甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶等；③作用于核酸转录的药物，如多柔比星；④作用于dna复制的药物，如喜树碱类的伊立替康、拓扑替康等；⑤干扰有丝分裂期微管蛋白合成的药物，如紫杉醇、多西他赛等。从上述作用机制可以看出，化疗药干预的作用靶点，通常对正常细胞也至关重要，特别是快速分裂的正常细胞，如小肠上皮细胞、骨髓干细胞和毛囊细胞等。这也决定了化疗药不可避免地对机体产生毒副作用。

寻找新的化疗药物具有重要意义。天然药物是抗肿瘤药物来源的重要途经之一，因此天然产物是鉴别和开发新的癌症治疗方案的宝贵资源。我国天然产物资源丰富，其中具有抗肿瘤活性的天然产物资源更是种类繁多。

玫瑰石斛啶碱(crepidine)和玫瑰啶碱b(homocrepidineb)是存在于玫瑰石斛中的两种天然产物，目前尚未见这两种化合物在抗肿瘤治疗方面的应用。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种玫瑰石斛啶碱制备抗结肠癌药物的用途。

本发明目的通过以下方案实现：

一种玫瑰石斛啶碱制备抗结肠癌药物的用途。

一种玫瑰石斛啶碱单独或联合在抗结肠癌方面的应用。

有益效果：

本发明试验结果说明玫瑰石斛啶碱可以抑制人前列腺癌du145细胞、人结肠癌hct-116细胞、人绒毛膜癌jeg-3细胞和人鼻咽癌cne2细胞的增殖并促进其凋亡，具有开发成抗人前列腺癌、人结肠癌、人绒毛膜癌和人鼻咽癌药物的前景；玫瑰啶碱b可以抑制人前列腺癌du145细胞、人绒毛膜癌jeg-3细胞和人鼻咽癌cne2细胞的增殖并促进其凋亡，具有开发成抗人前列腺癌、人绒毛膜癌和人鼻咽癌药物的前景。

附图说明

图1为westernblot图。

具体实施方式

一、试验材料

肿瘤细胞系为实验室液氮冻存，按常规方法复苏后使用，包括人乳腺癌mcf-7细胞、人卵巢癌skov3细胞、人前列腺癌du145细胞、人结肠癌hct-116细胞、人绒毛膜癌jeg-3细胞、人鼻咽癌cne2细胞、人黑色素瘤a375细胞和人皮肤鳞状癌a431细胞。

玫瑰石斛啶碱(crepidine)、玫瑰啶碱b(homocrepidineb)的纯度≥98％。

胎牛血清fbs购自于gibco。

dmem高糖培养基购自美国gibco公司。

rpmi1640培养基购自于solarbio。

mem培养基购自美国gibco公司。

二、试验方法

1、细胞培养

人乳腺癌mcf-7细胞培养于含10％fbs及100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素的dmem高糖培养基于5％co2、37℃培养箱中培养，每2～3d传代，取对数期细胞用于后续实验。

人卵巢癌skov3细胞培养于含10％fbs及100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素的rpmi1640培养基于5％co2、37℃培养箱中培养，每2～3d传代，取对数期细胞用于后续实验。

人前列腺癌du145细胞培养于含10％fbs及100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素的dmem高糖培养基于5％co2、37℃培养箱中培养，每2～3d传代，取对数期细胞用于后续实验。

人结肠癌hct-116细胞培养于含10％fbs及100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素的dmem高糖培养基于5％co2、37℃培养箱中培养，每2～3d传代，取对数期细胞用于后续实验。

人绒毛膜癌jeg-3细胞培养于含10％fbs及100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素的mem培养基于5％co2、37℃培养箱中培养，每2～3d传代，取对数期细胞用于后续实验。

人鼻咽癌cne2细胞培养于含10％fbs及100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素的dmem高糖培养基于5％co2、37℃培养箱中培养，每2～3d传代，取对数期细胞用于后续实验。

人黑色素瘤a375细胞培养于含10％fbs及100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素的dmem高糖培养基于5％co2、37℃培养箱中培养，每2～3d传代，取对数期细胞用于后续实验。

人皮肤鳞状癌a431细胞培养于含10％fbs及100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素的dmem高糖培养基于5％co2、37℃培养箱中培养，每2～3d传代，取对数期细胞用于后续实验。

2、mtt法测定药物对肿瘤细胞的增殖抑制作用

取对数生长期的各肿瘤细胞，消化后用各自对应的培养基重悬制成细胞悬液，分别接种于96孔培养板中，每孔加入95μl，使细胞密度为10000个/孔，于5％co2、37℃培养箱中培养。培养12h后，分别加入5μl梯度浓度的玫瑰石斛啶碱或玫瑰啶碱b的溶液母液并混匀，使得各肿瘤细胞的不同培养孔中的药物浓度呈梯度排列(终浓度如表1所示)，每个浓度设3个复孔。同时设置不加药培养的细胞为对照组，以及不含细胞的培养液为空白组。继续培养48h后，每孔加入20μlmtt溶液(5mg/ml)继续培养4h，吸弃上清液，每孔加入150μldmso，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解，在酶联免疫检测仪490nm波长下测定各孔光吸收值，于490nm波长处测定吸光度值(od490)，并根据如下公式计算不同浓度玫瑰石斛啶碱或玫瑰啶碱b对各肿瘤细胞的增殖抑制率：增殖抑制率(％)＝[1－(od药物组－od空白组)/(od对照组－od空白组)]×100％。再用spss软件计算出药物对各肿瘤细胞的ic50值。实验重复3次。

表1mtt试验中梯度设置的终浓度

3、westernblot法测定药物对肿瘤细胞凋亡的促进作用

取对数生长期的各肿瘤细胞，消化后用各自对应的培养基重悬制成细胞悬液，分别接种于培养瓶中，于5％co2、37℃培养箱中培养。培养12h后，分别加入玫瑰石斛啶碱或玫瑰啶碱b(终浓度如表2所示)，同时设置不加药培养的细胞为对照组，继续培养48h后，离心收集细胞，pbs洗涤，冰上裂解，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)电泳，并转移至pvdf膜上，经5％脱脂奶粉封闭，加入bax和β-actin(内参)一抗溶液4℃孵育，以及合适的二抗溶液孵育。最后采用ecl化学发光显色试剂孵育曝光，采用荧光化学发光成像分析系统拍照，imagej分析条带灰度值。

表2westernblot试验中的药物终浓度

4、统计学处理

组间比较用t检验，应用spss17.0软件计算，p<0.05为差异有显著性意义。

三、试验结果

1、玫瑰石斛啶碱、玫瑰啶碱b对各肿瘤细胞抑制ic50值

结果如表3所示，玫瑰石斛啶碱、玫瑰啶碱b具有不同的抗肿瘤谱，对同一种肿瘤细胞的增殖抑制作用强度也存在差异，其中：玫瑰石斛啶碱对人前列腺癌du145细胞、人结肠癌hct-116细胞、人绒毛膜癌jeg-3细胞和人鼻咽癌cne2细胞具有较强的增殖抑制作用，而玫瑰啶碱b仅对人前列腺癌du145细胞、人绒毛膜癌jeg-3细胞和人鼻咽癌cne2细胞具有较强的增殖抑制作用。

表3玫瑰石斛啶碱、玫瑰啶碱b对各肿瘤细胞抑制ic50值

2、玫瑰石斛啶碱、玫瑰啶碱b对各肿瘤细胞中促凋亡蛋白表达的影响

westernblot法测定了玫瑰石斛啶碱对人前列腺癌du145细胞、人结肠癌hct-116细胞、人绒毛膜癌jeg-3细胞和人鼻咽癌cne2细胞中促凋亡蛋白bax表达的影响，以及玫瑰啶碱b仅对人前列腺癌du145细胞、人绒毛膜癌jeg-3细胞和人鼻咽癌cne2细胞中促凋亡蛋白bax表达的影响，如图1所示。bax是研究最广泛的促凋亡蛋白，存在于细胞质中，具有促进细胞凋亡的作用。该结果说明，玫瑰石斛啶碱可以显著提高人前列腺癌du145细胞、人结肠癌hct-116细胞、人绒毛膜癌jeg-3细胞和人鼻咽癌cne2细胞中促凋亡蛋白bax的表达水平，具有促进人前列腺癌du145细胞、人结肠癌hct-116细胞、人绒毛膜癌jeg-3细胞和人鼻咽癌cne2细胞凋亡的作用；玫瑰啶碱b可以显著提高人前列腺癌du145细胞、人绒毛膜癌jeg-3细胞和人鼻咽癌cne2细胞中促凋亡蛋白bax的表达水平，具有促进人前列腺癌du145细胞、人绒毛膜癌jeg-3细胞和人鼻咽癌cne2细胞凋亡的作用。

本发明试验结果说明玫瑰石斛啶碱可以抑制人前列腺癌du145细胞、人结肠癌hct-116细胞、人绒毛膜癌jeg-3细胞和人鼻咽癌cne2细胞的增殖并促进其凋亡，具有开发成抗人前列腺癌、人结肠癌、人绒毛膜癌和人鼻咽癌药物的前景；玫瑰啶碱b可以抑制人前列腺癌du145细胞、人绒毛膜癌jeg-3细胞和人鼻咽癌cne2细胞的增殖并促进其凋亡，具有开发成抗人前列腺癌、人绒毛膜癌和人鼻咽癌药物的前景。