一种磷脂酶d1(pld1)基因及其抑制剂在肝纤维化防治中的应用
技术领域
1.本发明涉及基因功能与应用技术领域，具体地说，是一种磷脂酶d1(pld1)基因及其抑制剂在肝纤维化防治中的应用。
背景技术：2.肝纤维化(hepatic fibrosis,hf)是各种慢性肝病向肝硬化发展的病理阶段，主要原因有：病毒感染、药物中毒、长期酗酒、遗传性疾病或免疫因素。肝纤维化是机体对肝实质损伤的一种修复反应，如果不及时予以治疗，将形成假小叶，同时也可能进一步发展为失代偿期肝硬化，甚至肝癌，并出现危及生命的并发症。近来已有大量研究表明肝纤维化、乃至肝硬化在去除致损伤因素或经使用抗肝纤维化药物后是可以逆转的。然而，目前临床上尚无治疗肝纤维化的有效的药物，引起国内外研究者的广泛关注，成为近年研究热点以及难点。
3.磷脂不仅是生物膜的骨架成分，而且能通过水解后产生的产物来参与多种生理过程以及环境刺激引起的细胞反应。磷脂酶(phospholipase)是催化磷脂水解的关键酶，可以分为5类，即磷脂酶a1(pla1)、磷脂酶a2(pla2)、磷脂酶b(plb)、磷脂酶c(plc)和磷脂酶d(pld)。磷脂酶d(pld)，即磷脂酰胆碱磷脂水解酶，属催化磷酸二酯键水解和碱基交换的一类酶的总称，是一类重要的细胞信号转导酶类，pld催化水解的底物是细胞信号转导过程中重要的第二信使分子，参与多种生理和环境刺激引起的细胞反应，调控细胞的生长、增殖和运动等；同时pld可调节细胞脂质代谢、囊泡运输、细胞骨架蛋白重排、细胞迁移、及胶原合成，并参与细胞衰老的调控。pld在哺乳动物组织细胞广泛分布，而pld1是已经克隆出的一个pld亚型。pld1在恶性肿瘤、炎症、神经系统疾病、免疫相关疾病的作用已被广泛研究。但目前为止，尚没有其它研究团队发现pld1与肝纤维化相关。
4.为解决临床上尚无治疗肝纤维化的有效药物，本发明的目的在于确定pld1基因与肝纤维化的相互关系，揭示pld1可成为抗肝纤维化治疗靶点，pld1特异性抑制剂有抗肝纤维化作用。
5.本发明通过对pld1基因与肝纤维化的相关性研究，发现抑制pld1基因具有良好的抗纤维化作用；pld1特异抑制剂具有良好的具有减轻甚至逆转肝纤维化作用，有望作为抗肝纤维化新药进行研发。
6.关于本发明一种磷脂酶d1(pld1)基因及其抑制剂在肝纤维化防治中的应用目前还未见报道。
技术实现要素：7.本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种磷脂酶d1(pld1)基因的新用途。
8.为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：
9.一方面，磷脂酶d1(pld1)基因在制备防治脂肪性肝炎致肝纤维化疾病的药物中的
应用。
10.另一方面，磷脂酶d1(pld1)基因的抑制剂在制备防治脂肪性肝炎致肝纤维化疾病的药物中的应用。
11.作为一个优选例，所述的磷脂酶d1(pld1)基因的抑制剂是降低磷脂酶d1表达量的物质。
12.作为一个优选例，所述的磷脂酶d1(pld1)基因的抑制剂选自小分子化合物或生物大分子。
13.作为一个优选例，所述的脂肪性肝炎致肝纤维化疾病是脂质输出受损导致过多的脂质沉积，引起肝细胞脂肪病变的疾病。
14.作为一个优选例，所述的脂肪性肝炎致肝纤维化疾病是线粒体功能障碍，脂肪酸β氧化途径受损，脂肪代谢异常的疾病。
15.更优选地，所述生物大分子是以磷脂酶d1(pld1)蛋白或其转录本为靶序列、且能够抑制磷脂酶d1(pld1)蛋白表达或基因转录的小干扰rna、dsrna、shrna、微小rna、反义核酸；或能表达或形成所述小干扰rna、dsrna、微小rna、反义核酸的构建物。
16.更优选地，所述的抑制剂是磷脂酶d1(pld1)基因的特异性抑制剂。
17.更优选地，所述的特异性抑制剂是vu0359595。
18.需要说明的是，肝纤维化动物模型造模机制不同会对结果产生不同影响。现有技术中已有用化学诱导剂二甲基亚硝胺(dmn)诱导的肝纤维化，本专利是采用胆碱和蛋氨酸缺乏(mcd)饮食诱导的肝纤维化。化学性诱导的肝纤维化和饮食诱导的肝纤维化这两种肝纤维化模型，在肝纤维化机制显著不同。dmn是致癌剂，通过造成肝细胞变性坏死、激活肝星状细胞，引起肝纤维化，造模周期短。mcd模型是模拟脂肪性肝炎致肝纤维化。其机制是由于饮食中蛋氨酸和胆碱的缺乏导致线粒体功能障碍，脂肪酸β氧化途径受损，脂肪代谢异常，即脂质输出受损导致过多的脂质沉积，引起肝细胞脂肪变，特别是脂肪性肝炎，进而进展为脂肪性肝纤维化，造模周期长。
19.另外，体外实验，验证pld1抑制剂对在细胞水平对hsc活化有抑制作用。体外细胞模型存在很大的局限性，不能模拟体内环境。本专利是通过体内动物实验验证pld1抑制剂对肝纤维化的作用与效果。
20.进一步地，现有技术中已有的“抑制剂”n-甲基乙醇胺(mea)并非特异性pld1抑制剂，可能通过pld1以外的其它多种途径发挥作用。而本专利选用的是pld1特异性抑制剂vu0359595，其作用明确，靶点单一，实验结果可靠性明显增加，未来做为抗肝纤维化的候选药物开发前景乐观。
21.本发明优点在于：
22.通过构建胆碱和蛋氨酸缺乏(mcd)饮食诱导的肝纤维化动物模型，对pld1基因与肝纤维化的相关性研究，发现抑制pld1基因具有良好的抗纤维化作用；
23.此外，实验结果表明pld1特异抑制剂具有良好的减轻甚至逆转肝纤维化的作用，有望作为抗肝纤维化新药进行研发。
24.本发明首次发现pld1基因与胆碱和蛋氨酸缺乏(mcd)饮食诱导的肝纤维化的关系，为该类患者的治疗提供了新的治疗途径，具有很好的应用前景。
附图说明
25.附图1是各组肝脏镜下病理表现。结果表明：正常对照组镜下未见明显的肝脏炎症及纤维化表现；与正常对照组相较，正常干预组镜下也未见明显的肝脏炎症及纤维化表现，未见明显差别(p>0.05)；与正常对照组相较，模型对照组的肝炎症及纤维化组织学评分明显加重，存在显著性差异(p<0.05)；与模型对照组相比，模型干预组的肝炎症及纤维化组织学评分明显改善，存在显著性差异(p<0.05)。
26.附图2是不同组大鼠血清肝功能指标比较。结果表明：模型干预组肝组织ast和alt含量低于模型对照组(p<0.01)，用***表示。
27.附图3是dmn和mcd模型小鼠的病理特征区别，结果显示：dmn模型以肝细胞变性坏死为主，mcd模型以肝细胞脂肪变性为主。
具体实施方式
28.下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。
29.实施例1 pld1抑制剂vu0359595减轻小鼠肝脏纤维化实验
30.1方法
31.1.1分组
32.将40只6-8周c57/bl6小鼠随机分为4组，分别为正常对照组、正常干预组、胆碱和蛋氨酸缺乏(mcd)模型组、mcd模型干预组。
33.1.2干预方法
34.正常对照组和正常干预组予以mcs饮食，胆碱和蛋氨酸缺乏(mcd)模型组、mcd模型干预组，均连续12周。pld1抑制剂vu0359595采用腹腔注射方式给药，100ng/kg，每日给药1次；正常对照组和胆碱和蛋氨酸缺乏(mcd)模型组小鼠行生理盐水腹腔注射，连续12周。于12周末腹腔麻醉后摘眼球法采血后处死动物，剪下完整肝组织标本，称重后取部分右叶肝脏以4％中性甲醛固定，用于病理检测；将余下肝脏于液氮中速冻，-80℃冰箱内保存。血清于-20℃冰箱内保存，用于血清学肝功能检测。
35.2结果
36.2.1各组肝脏镜下病理表现见图1。
37.正常对照组镜下未见明显的肝脏炎症及纤维化表现；与正常对照组相较，正常干预组镜下也未见明显的肝脏炎症及纤维化表现，未见明显差别(p>0.05)；与正常对照组相较，胆碱和蛋氨酸缺乏(mcd)模型组的肝炎症及纤维化组织学评分明显加重，存在显著性差异(p<0.05)；与胆碱和蛋氨酸缺乏(mcd)模型组相比，mcd模型干预组的肝炎症及纤维化组织学评分明显改善，存在显著性差异(p<0.05)。
38.2.2不同组大鼠血清肝功能指标比较见图2。
39.mcd模型干预组肝组织ast和alt含量低于胆碱和蛋氨酸缺乏(mcd)模型组(p<0.01)。
40.3结论
41.在mcd诱导的小鼠肝纤维化模型中，pld1小分子抑制剂vu0359595可改善肝功能、抑制肝星状细胞的激活指标α-sma蛋白的表达，同时也改善了肝纤维化的病理组织学。
42.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。