本发明属于制剂领域，具体涉及一种用于防治鸡大肠杆菌病的口服液及其制备方法。
技术实现要素：
鸡大肠杆菌病是由埃希氏大肠杆菌引起的一种常见病，其特征是引起心包炎、肝周炎、气囊炎、腹膜炎、输卵管炎、滑膜炎、大肠杆菌性肉芽肿和脐炎等病变。
3,4-二羟基苯甲酸[(ho)2c6h3cooh]是原儿茶酸的主要成分，相对分子质量为154.12，主要来源包括：从刺五加、五味子、杜仲、冬青等植物中提取；以微生物中的莽草酸途径以葡萄糖为底物进行生物合成。因具有抗氧化、抗菌、抗炎、抗病毒等作用，已被应用于医药、保健等领域。3,4-二羟基苯甲酸尚未批准正式应用于畜禽，但已有相关的动物实验。饲喂原儿茶酸，可减轻断奶仔猪应激和炎症反应，改善肠道菌群，减轻肠道损伤，提高成活率和增重；改善黄羽肉鸡肠道菌群，提高增重；缓解家禽热应激、减轻氧化损伤；降低肉鸡肝脏中丙二醛含量，并提高肝脏中总抗氧化能力；抑制禽流感、新城疫、传染性法氏囊、传染性支气管炎等病毒繁殖，提高鸡的免疫力，降低死亡率。
3,4-二羟基苯甲酸的抗菌机理是：（1）羟基可以和细胞膜的脂质双分子层结合，影响细胞膜磷脂与蛋白质的相互作用，改变细胞膜结构、功能和通透性。（2）与铁形成稳定的配合物，而铁的缺乏会使金属酶如血红素酶和核糖苷酸还原酶的活性下降，大肠杆菌等致病菌的生长被抑制。（3）羟基易发生断裂，给出的电子能使o2活化成o-2，引起细菌细胞膜脂质过氧化，而o-2在sod作用下生成h2o2；大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等致病菌中二价铁离子(fe2+)易发生芬顿反应生成更多的·oh，过量的·oh接作用于dna导致断裂，引起细菌凋亡。
3,4-二羟基苯甲酸具有一定的体外抗菌作用，但与抗生素相比抗菌作用偏弱，比如：其对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌的mic范围0.5~3.0mg/ml，本发明人进行了其对大肠杆菌（cmcc44103）的抑菌试验，其mic为0.5mg/ml，而含该成分的中药提取液的抑菌效果更差。作为抗生素增效剂，原儿茶酸与痢菌净和克林沙星配伍对鱼源链球菌呈协同效应，但未报道对大肠杆菌的增效作用。因此，人们丧失了畜禽临床抗菌实验的兴趣，未搜索到其应用于畜禽细菌病的防治案例。
3,4-二羟基苯甲酸在冷水中的溶解性差，100ml水中的溶解量不足0.1g，限制了其在养鸡业的使用，因为目前的规模化鸡场普遍采用饮水给药，水溶性差的药物很难推广。专利cn201110045158.7将原儿茶酸制成液体制剂用于防治畜禽病毒性疾病，液体制剂方法是原儿茶酸与乙醇、吐温按重量体积比1∶3∶4溶解组成，还可加入丙三醇做溶媒。但该发明制剂如果给鸡混饮使用有四大缺陷：（1）当加10倍量水稀释时会出现浑浊，再稀释，仍然浑浊，放置1天后沉淀变成油滴状，会导致用药剂量不均匀；（2）鸡饮水用药时间包括4h集中饮用或12-24h饮用，即便将该制剂1:100倍一次性稀释（实际养殖场中很难操作）可达到澄清状态，但在水中12-24h，因酚羟基氧化，颜色会变浅黄色至黄色，药效不稳定，不适合12-24h饮用；（3）超剂量使用吐温，存在用药安全隐患；（4）加水稀释后，味极苦，鸡拒绝饮用。
3,4-二羟基苯甲酸是具有优秀抗菌作用的中药成分，要将其应用于鸡大肠杆菌病的防治，需解决以下问题：（1）不能仅限于大肠杆菌标准株的体外抑菌试验，应进一步研究其对鸡大肠杆菌临床分离株的体外抑菌作用；（2）在体外抑菌作用良好的前提下，制备成储存和应用时质量均稳定的口服溶液剂；（3）解决其味苦导致鸡饮水量大幅下降的问题，适合鸡正常饮水使用；（3）进行靶动物鸡的体内药效试验，达到安全有效防治鸡大肠杆菌病的目标；（4）研究其与抗菌药物的协同增效作用，提高疗效。
发明内容
针对上述问题，本申请提供了一种用于防治鸡大肠杆菌病的口服液，通过添加甜味剂，溶媒二甲基乙酰，添加剂乳酸的作用下，使3,4-二羟基苯甲酸稳定存在，不易氧化。同时还提供了该口服液的制备方法，该方法简单，适于工业化应用。
本发明的技术方案如下：（权利要求书）
1.一种用于防治鸡大肠杆菌病的口服液，其特征在于，原料包括：3,4-二羟基苯甲酸10-20g，添加剂2-4ml，甜味剂2-10g，氟苯尼考2-7g，溶媒100ml。
2.根据权利要求1所述的防治鸡大肠杆菌病的口服液，其特征在于，所述的添加剂为乳酸。
3.根据权利要求1所述的防治鸡大肠杆菌病的口服液，其特征在于，所述的甜味剂应溶于溶媒中。
4.根据权利要求1所述的防治鸡大肠杆菌病的口服液，其特征在于，所述的溶媒为非质子极性溶剂。
5.根据权利要求1或4所述的防治鸡大肠杆菌病的口服液，其特征在于，所述的溶媒为二甲基乙酰胺或二甲基甲酰胺中的一种或两种混合。
5.根据权利要求1或3所述的防治鸡大肠杆菌病的口服液，其特征在于，所述的甜味剂为：甜叶菊苷、甘草甜素的混合物。
6.根据权利要求1或3所述的防治鸡大肠杆菌病的口服液，其特征在于，所述的氟苯尼考、甘草甜素，联合3，4-二羟基苯甲酸，可发挥对大肠杆菌抗菌活性的增效作用（部分协同或相加作用）。
6.一种权利要求1-4任一所述的口服液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）向总量90%的溶媒中加入添加剂，然后加入2/3量的3,4-二羟基苯甲酸，搅拌均匀；
（2）向步骤（1）的溶液中加入氟苯尼考，搅拌均匀；
（3）升温至40-60℃，加入剩余的3,4-二羟基苯甲酸，搅拌均匀；冷却至室温，待用；
（4）向步骤（3）的溶液中加入2种甜味剂，搅拌溶解，加入剩余溶媒至全部体积；使用时按说明书加水稀释，搅拌均匀，供鸡饮用。
本发明采用乳酸作为添加剂，起到稳定3,4-二羟基苯甲酸的作用，不让其氧化，其主要是作用于3,4-二羟基苯甲酸易氧化的酚羟基。二甲基乙酰胺或二甲基甲酰胺为非质子极性溶剂，能溶解多种化合物，与水、醚、酮、酯等完全互溶，具有热稳定性高、不易水解、腐蚀性低、毒性小等特点，同时在有机合成中，二甲基乙酰胺或二甲基甲酰胺是极好的催化剂，可使环化、卤化、氰化、烷基化和脱氢等反应加速，因此在本申请中作为溶媒的二甲基乙酰胺还可以可起到抗氧化，及稳定溶液的作用。甜味剂主要是改善3,4-二羟基苯甲酸的苦味，同时具有增效作用，所选的甜味剂应溶于溶媒中；甜叶菊苷，是一种从菊科草本植物甜叶菊(或称甜菊叶)中精提的新型天然甜味剂；甘草甜素又称甘草酸，是从中药甘草中分离的一种皂甙成分，为甘草中的主要成分，也是有效成分。具有肾上腺皮质激素样作用，抗炎抗变态反应，以及抗菌、解毒等作用，可抑制鸡大肠杆菌的增殖、减轻大肠杆菌内毒素造成的炎症和毒性。氟苯尼考为动物专用抗菌药，用于敏感细菌所致的猪、鸡及鱼的细菌性疾病，尤其对呼吸系统感染和肠道感染疗效显著。
本发明的有益效果
1、制备出储存和应用时质量均稳定的口服溶液剂；
2、解决其味苦导致鸡饮水量大幅下降的问题，适合鸡正常饮水使用；
3、效果显著：进行靶动物鸡的体内药效试验，达到安全有效防治鸡大肠杆菌病的目标；研究其与抗菌药物的协同增效作用，提高疗效。
具体实施方式
实施例1
一种用于防治鸡大肠杆菌病的口服液的制备方法，包括以下步骤：
（1）向总量90%的二甲基乙酰胺100ml中加入乳酸4ml，然后加入13.5g的3,4-二羟基苯甲酸，搅拌均匀；
（2）向步骤（1）的溶液中加入氟苯尼考2g，搅拌均匀；
（3）升温至60℃，加入剩余的3,4-二羟基苯甲酸6.5g，搅拌均匀；冷却至室温，待用；
（4）向步骤（3）的溶液中加入甜味剂甜叶菊苷、甘草甜素各5g，搅拌溶解，搅拌均匀；加入剩余溶媒至全部体积；使用时按说明书加水稀释，搅拌均匀，供鸡饮用。
实施例2
一种用于防治鸡大肠杆菌病的口服液的制备方法，包括以下步骤：
（1）向总量90%的二甲基乙酰胺100ml中加入乳酸2ml，然后加入6.6g的3,4-二羟基苯甲酸，搅拌均匀；
（2）向步骤（1）的溶液中加入氟苯尼考7g，搅拌均匀；
（3）升温至40℃，加入剩余的3,4-二羟基苯甲酸3.4g，搅拌均匀；冷却至室温，待用；
（4）喂食前向步骤（3）的溶液中加入甜味剂甜叶菊苷0.5g、甘草甜素1.5g，搅拌溶解，搅拌均匀；加入剩余溶媒至全部体积；使用时按说明书加水稀释，搅拌均匀，供鸡饮用。
实施例3
一种用于防治鸡大肠杆菌病的口服液的制备方法，包括以下步骤：
（1）向总量90%的二甲基乙酰胺100ml中加入乳酸3ml，然后加入10g的3,4-二羟基苯甲酸，搅拌均匀；
（2）向步骤（1）的溶液中加入氟苯尼考5g，搅拌均匀；
（3）升温至50℃，加入剩余的3,4-二羟基苯甲酸5g，搅拌均匀；冷却至室温，待用；
（4）向步骤（3）的溶液中加入甜味剂甜叶菊苷2g、甘草甜素3g，搅拌溶解，搅拌均匀；加入剩余溶媒至全部体积；使用时按说明书加水稀释，搅拌均匀，供鸡饮用。
实施例4
一种用于防治鸡大肠杆菌病的口服液的制备方法，包括以下步骤：
（1）向总量90%的二甲基乙酰胺100ml中加入乳酸3ml，然后加入10g的3,4-二羟基苯甲酸，搅拌均匀；
（2）升温至50℃，加入剩余的3,4-二羟基苯甲酸5g，搅拌均匀；冷却至室温，待用；
（3）向步骤（3）的溶液中加入甜味剂甜叶菊苷2g、甘草甜素3g，搅拌溶解，搅拌均匀；加入剩余溶媒至全部体积；使用时按说明书加水稀释，搅拌均匀，供鸡饮用。
对比例1
一种用于防治鸡大肠杆菌病的口服液的制备方法，包括以下步骤：
（1）向总量90%的二甲基乙酰胺100ml中加入加入10g的3,4-二羟基苯甲酸，搅拌均匀；
（2）向步骤（1）的溶液中加入氟苯尼考5g，搅拌均匀；
（3）升温至50℃，加入剩余的3,4-二羟基苯甲酸5g，搅拌均匀；冷却至室温，待用；
（4）向步骤（3）的溶液中加入甜味剂甜叶菊苷2g、甘草甜素3g，搅拌均匀；稀疏搅拌均匀。
实施效果例
一、稀释后的溶液澄清度和稳定性
以实施例1-4及对比例1-2为例，稀释10倍、100倍、200倍、400倍，放置过夜；结果表明本发明实施例1-4制备的口服液的澄清、稳定性好；而对比例1，变色严重。
二、体外抑菌试验：采用实施例4的口服液配方在不稀释的情况下，将其制备成标准药敏片，含药量（4μg/片），对临床分离的耐药性较强的大肠杆菌进行药敏试验，结果：本发明敏感率100%，常用抗生素敏感率为0-43%。结果见表1。
表1实施例4及其他抗生素对不同来源的大肠杆菌分离株的抑菌结果
三、治疗效果
采用实施例1-3及对比例1-2的口服液，按每1kg体重灌服3,4-二羟基苯甲酸40mg的剂量，治疗人工感染鸡大肠杆菌（寿光分离株）病：实施例1-3的鸡死亡率由70%降至10%；实施例4的死亡率20%；对比例1的死亡率在10%（乳酸只对产品稳定性有作用，对直接灌服药效无明显作用，对鸡全天饮水，因原料不稳定、变色，会使疗效下降）。
四、实施例4与抗菌药联合对大肠杆菌的体外抑菌增效试验
4.1采用药敏纸片法进行试验。抗菌药的药敏片为市售；甘草甜素药敏片为自制，每片含甘草甜素10μg；本发明药敏片为自制，每片含3,4-二羟基苯甲酸4μg；联用药敏片是将含市售药敏片上滴加本发明（含3,4-二羟基苯甲酸4μg），低温干燥。大肠杆菌使用标准株（cmcc44103）。结果见表2。
表2药敏片与实施例4联合抑菌效果评价
4.2采用肉汤稀释棋盘试验。采取6×6棋盘，根据每种药物对大肠杆菌标准菌株的mic值，将每种药物的最高浓度设为2×mic，然后用培养基进行一系列双倍稀释，a（不同抗菌药）为纵列，b（本发明3,4-二羟基苯甲酸）为横列，使96孔板的每1横行孔中a浓度不变，b浓度依次为2、1、1/2、1/4、1/8、1/16倍mic（b的mic为0.5mg/ml），每1纵列孔中b浓度不变，a浓度递减至1/16倍mic。混匀后37℃静置培养18-24h。以部分抑菌浓度ficindex为判定依据，ficindex=[mic(a)/mica]+[mic(b)/micb]，其中，mica和micb分别代表a和b药物单独使用时的mic，mic(a)和mic(b)代表a和b药物联用时各自的mic值。ficindex≤0.5，为协同作用；0.5＜ficindex≤1为部分协同或相加作用；1＜ficindex≤2，为无关作用；＞2为拮抗作用。各组重复试验3次。结果见表3。
表3实施例4与抗菌药联合对大肠杆菌的体外抑菌增效试验
注：硫酸新霉素不溶于二甲基乙酰胺，但易溶于水，因此，不能混合制成同一溶液，但可在临床中分别兑水、配合使用，增加疗效。
五、饮水饲喂试验
本发明实施例1-4按1:100倍至400倍加水稀释，鸡自由饮水，饮水量无明显变化；将实施例3中去掉甜味剂，同样稀释，鸡自由饮水，饮水量降低60-90%。