增强MUC1CAR-T细胞治疗靶向药物及其应用与药物组合和分子标志物的制作方法

本发明涉及生物医药技术领域，更具体地，涉及增强muc1car-t细胞治疗靶向药物及其应用与药物组合和分子标志物。

背景技术：

目前嵌合抗原受体t细胞(car-t)疗法在血液系统恶性疾病的治疗中被证实具有一定的安全性与有效性。但是在实体瘤的应用仍存在疗效不确切、副作用较大等问题。尤其是实体瘤的高度异质性等特点使car-t细胞治疗充满挑战。由于实体瘤的抗原表达并不均一，其不仅表现在肿瘤内(肿瘤内异质性)和患者间(肿瘤间异质性)，治疗前后、原始与复发病灶之间也可能不同。部分肿瘤细胞因抗原表达较低、暴露不足容易产生抗原逃逸并致使复发。因此要解决car-t细胞在实体瘤的应用壁垒，增强并稳定肿瘤细胞表达特异性抗原靶点是重要途径之一。

muc1是一种高分子量跨膜糖蛋白，正常生理情况下分布于上皮细胞管腔面，具有保护和润滑的功能。在上皮细胞肿瘤中，muc1表达异常增加，并失去极性，遍布于整个细胞表面。特别地，在肿瘤细胞中muc1糖基化减少或变异，暴露了原有的蛋白主干分子结构并形成新的短小糖链结构。这种异常的糖基化改变使得肿瘤muc1的抗原表位具有很高的特异性。由于肿瘤细胞过度表达异常糖基化的muc1可以通过mhci/ii类分子递呈诱导t细胞，杀伤muc1阳性的肿瘤细胞，使muc1成为肿瘤免疫治疗的候选靶分子。然而muc1作为一种实体瘤细胞免疫治疗的靶点，亦存在表达异质性高、抗原暴露不充分、个体差异大等问题，目前对其转化价值还需要进一步的优化和探索。对于晚期肿瘤患者，针对muc1的car-t治疗具有很好的前景，但其作用尚需大规模的基础、转化及临床研究。

靶向治疗由于疗效确切、精准性强、副作用小等优势而成为化疗后新兴的抗癌药物。靶向药物通常作用于肿瘤细胞的特定信号传导通路，当靶向药物阻断特定的信号转导通路之后，肿瘤细胞的生物学特性及该信号通路下游的靶基因表达会发生改变。因此，临床上有必要筛选出可稳定并促进muc1肿瘤抗原的靶向药物，以此药物作为muc1car-t细胞治疗的增敏剂，提高肿瘤对muc1car-t细胞治疗的敏感性和临床效果。由于血清ca15-3已被fda批准用于监测乳腺癌治疗后复发、远端转移及预后评价，并且ca15-3作为肿瘤细胞muc1脱落于体液的存在形式，与肿瘤细胞muc1同属同一转录本且可获得性强，因此有必要验证ca15-3是否可作为预测muc1car-t细胞治疗疗效的分子标志物。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明为克服上述现有技术所述的至少一种不足，提供增强muc1car-t细胞治疗靶向药物及其应用与药物组合和分子标志物，解决现有muc1car-t细胞治疗抗原表达较低、暴露不足容易产生抗原逃逸并致使复发的技术问题并提供表征治疗效果的标志物。

为了解决上述存在的技术问题，本发明采用下述技术方案：

本发明第一方面提供一种用于增强muc1car-t细胞治疗的靶向药物，所述靶向药物为raf/mek/erk通路的小分子抑制剂。

其中，所述muc1car-t细胞治疗为靶向所有muc1分子的car-t细胞治疗，其抗原靶标为肿瘤细胞特异性表达的muc1；所述raf/mek/erk通路的小分子抑制剂可以抑制raf/mek/erk信号转导通路的活性，在常规作用浓度和作用3-5天的前提下，可提高肿瘤细胞muc1抗原表达，以增加肿瘤细胞对muc1car-t细胞治疗的敏感性。

所述小分子抑制剂选自达拉非尼、索拉菲尼、维罗非尼、曲美替尼、司美替尼、binimetinib、cobimetinib或其他fda批准的或未批准的raf/mek/erk通路抑制剂的至少一种。

本发明第二方面提供上述靶向药物在muc1car-t细胞治疗中的应用。

本发明第三发明提供一种用于muc1car-t细胞治疗的药物组合，包括

(1)上述用于增强muc1car-t细胞治疗的靶向药物；

(2)用于muc1car-t细胞治疗的药物。

所述muc1car-t细胞包括5e5car-t细胞、s28zcar-t细胞、h28zcar-t细胞、hdf28zcar-t细胞、hdftrcar-t细胞或muc28zcar-t细胞中的至少一种。

所述muc1car-t细胞不限于一代、二代、三代或四代car-t细胞，不限于其单链抗体以ige、iga、igd、igm、igg结构存在，不限于同时进行其他基因编辑处理。

上述靶向药物及其药物组合可应用于癌症治疗中，所述癌症包括卵巢癌、腹膜肿瘤、输卵管癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌、非小细胞肺癌、头颈部肿瘤、实体瘤、膀胱癌、小细胞肺癌、胃癌、移行细胞癌、子宫颈癌、子宫内膜样癌、食管癌、鳞状细胞癌、胶质母细胞瘤、间皮瘤、肾癌、尿道癌、葡萄膜黑色素瘤、胆管癌、尤文肉瘤或结直肠癌。

根据本发明的实施例，达拉非尼可作为5e5car-t细胞治疗的增敏剂，在体外实验中，建立肿瘤细胞与car-t细胞共培养体系，将5um达拉非尼处理的肿瘤细胞系与5e5car-t细胞共培养8小时，流式细胞术检测被杀伤的肿瘤细胞、elisa实验检测car-t细胞ifn-γ释放，实验结果均提示达拉非尼可提高5e5car-t细胞对肿瘤细胞的杀伤效果。并且这种现象在乳腺癌细胞系、肺癌细胞系、黑色素瘤细胞系中均得到体现。在体内实验中，利用黑色素瘤细胞系建立cdx小鼠模型及肺癌组织建立pdx小鼠模型，在给小鼠输注muc1car-t细胞前灌胃5天剂量为30mg/kg/d的达拉非尼，肿瘤体积可得到明显控制。体内实验及体外实验均表明达拉非尼可增强5e5car-t细胞治疗的疗效。

根据本发明的实施例，raf/mek/erk信号通路抑制剂一方面可降低甲基转移酶1(dnmt1)的转录活性，减少muc1基因甲基化从而提高了muc1基因的表达。另一方面，raf/mek/erk信号通路抑制剂降低了cosmc的表达，由于cosmc为muc1胞外段糖链延长的关键酶，因此raf/mek/erk通路抑制剂阻碍了muc1胞外段糖链的延长，暴露了更多muc1car-t细胞识别的抗原位点。

上述实施例的结果说明，raf/mek/erk通路的不同抑制剂促进肿瘤细胞muc1的表达在机制上是同等的，因此raf/mek/erk通路抑制剂与达拉非尼理应对muc1car-t细胞治疗具有同等的增强作用。raf/mek/erk通路抑制剂作用后对肿瘤细胞muc1特征性改变，一方面促进其表达量的增加，另一方面降低其糖基化程度从而减少car-t细胞单链抗体与抗原识别的空间位阻，因此raf/mek/erk通路抑制剂对muc1car-t细胞治疗的增强作用理应适用于所有抗原位点在于肿瘤细胞muc1的car-t细胞。

根据本发明的实施例，raf/mek/erk信号通路抑制剂对肿瘤细胞muc1的上调作用体现在不同肿瘤的细胞系、原代细胞及动物模型中，因此raf/mek/erk信号通路抑制剂的对muc1car-t细胞治疗的增强作用不依赖于该肿瘤是否具有其相应的靶点突变和特定的癌种限制，而在癌症的应用中存在广泛性。

本发明第四方面提供血清ca15-3作为muc1car-t细胞治疗分子标志物的应用。血清ca15-3水平与muc1car-t细胞治疗疗效呈正相关。

本发明第五方面提供血清ca15-3作为如权利要求1或2所述靶向药物是否增强muc1car-t细胞治疗的分子标志物的应用。靶向药物作用前后血清ca15-3的水平差异与靶向药物对muc1car-t细胞治疗的增强效果呈正相关。

本发明验证血清ca15-3作为预测muc1car-t细胞治疗疗效及评估raf/mek/erk通路抑制剂能否对muc1car-t细胞治疗产生增强作用的分子标志物。本发明的发明人基于ca15-3目前已作为监测乳腺癌患者术后复发、评估远端转移灶的体液指标，并且ca15-3作为肿瘤细胞膜muc1脱落于体液的存在形式存在可得性强等优势，在乳腺癌患者的临床标本中已证实血清ca15-3水平与肿瘤组织muc1表达水平呈正相关，在动物实验中证实raf/mek/erk通路抑制剂作用后ca15-3升高水平与后续muc1car-t细胞治疗疗效呈正相关，因此证明血清ca15-3可作为评估muc1car-t治疗的分子标志物。

本发明与现有技术相比较有如下有益效果：本发明所述的raf/mek/erk通路抑制剂与muc1car-t细胞治疗的组合应用，在临床上优化了muc1car-t细胞在实体瘤临床应用的疗效，并可通过血清ca15-3水平预测其疗效。raf/mek/erk通路抑制剂可降低muc1基因的甲基化从而提高muc1的转录活性，同时通过抑制cosmc的表达降低了糖基化程度，暴露了更多抗原位点，有利于muc1car-t识别肿瘤细胞。由于raf/mek/erk通路抑制剂对muc1car-t细胞治疗的增强作用存在较大的个体差异，血清ca15-3水平可用来预测其疗效，确保了此药物组合的安全性与可监测性。

附图说明

图1是从小分子药物库中筛选可促进muc1表达的药物。

图2是在多种肿瘤细胞系及多种肿瘤原代细胞中验证raf/mek/erk通路抑制剂对肿瘤细胞相关muc1(ta-muc1)的上调作用。

图3是在多种肿瘤细胞系中验证达拉非尼对muc1car-t细胞杀伤效果的促进作用。

图4是在动物模型中验证达拉非尼对muc1car-t细胞治疗的增强作用。

图5是验证血清ca15-3可作为指示muc1car-t治疗疗效的分子标志物。

图6是raf/mek/erk通路抑制剂可降低muc1基因甲基化水平从而促进muc1的表达。

图7是raf/mek/erk通路抑制剂可下调cosmc表达从而降低muc1糖基化。

具体实施方式

附图仅用于示例性说明，不能理解为对本发明的限制。下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

一、材料和方法

细胞和细胞培养：atcc来源的mda-mb-231细胞、a375细胞、pc9细胞在含10％fbs的dmem中培养。原代细胞由孙逸仙纪念医院提供，分别取乳腺癌、胃癌、结肠癌、肺癌、胰腺癌肿瘤组织及癌旁组织用乙醇快速消毒原代组织表面后，使用无菌手术刀将其剁碎成泥状，100目的滤膜过滤后在dmem/f12培养基中培养，加入10％胎牛血清，20ng/ml表皮生长因子(egf)，0.5μg/ml氢化可的松，100ng/ml霍乱毒素，10μg/ml胰岛素，8小时内进行流式细胞术检测。

流式细胞术：抗体包括抗总muc1(1:100，biolegend，355603)，低糖基化muc1(sm3antibody，1:200,abcam，ab2711)，收集细胞，pbs洗涤1遍后抗体孵育30min，低糖基化muc1抗体孵育后pbs洗涤1次后进行二抗孵育30min，最后pbs洗涤2次后进行检测。

免疫印迹：抗体包括抗muc1(1：1,000，abcam，ab109185)，dnmt1(1：1000，abcam，ab13537)，cosmc(1：300，santacruz,sc-271829)，按照标准操作进行免疫印迹实验。

免疫组织化学检测：根据标准方案对福尔马林固定和石蜡包埋的肿瘤进行ta-muc1(sm3antibody，1：200,abcam，ab2711)，p-erk(1:200,invitrogen,15h10l7)，染色。dab溶液(vectorlaboratories)混合物进行免疫标记，然后用苏木精复染。

杀伤实验：将肿瘤细胞用5um达拉非尼处理8小时，用calcein-am(invitrogen,c3011mp)染色后充分洗涤，取2×104个肿瘤细胞与10×104个t细胞或者car-t细胞共培养于24孔板中，过夜培养，次日收集共培养体系中的所有细胞，pi染色后使用流式细胞术检测calcein-am阳性且pi阳性的肿瘤细胞。

酶联免疫吸附实验：使用humanifn-gamma(biolegend，430101)，取上述肿瘤细胞与t细胞或者car-t细胞共培养体系上清，按照标准操作进行elisa实验。

动物实验：所有涉及小鼠的实验均由中山大学动物伦理委员会批准，并按照相关规定进行研究。将5*106个a375细胞注入6周龄nsg裸鼠的皮下组织。可见肿瘤生长时，小鼠随机分为接受达拉非尼治疗组和对照组。达拉非尼(25mg·kg-1·d-1)或安慰剂灌胃5天后，将两组小鼠随机尾静脉输注2*107个t细胞或car-t细胞。每周测量肿瘤体积并记录，瘤体积＝0.5*长径*短径2

关于pdx植入，5份肺癌标本来源中山大学孙逸仙纪念医院患者的肿瘤切除术中收集。按孙逸仙纪念医院的内部审查和道德委员会的规定进行患者知情同意。6周大的nsg雌性小鼠进行麻醉。肿瘤切成1mm3大小，直接嵌入皮下组织中以获得第一代pdx。一旦第一代pdx直径达1厘米，将其收获，切成1mm3大小，直接嵌入皮下组织中，以获得第二代用于治疗的pdx。将每个患者的pdx移植到四只小鼠中，随机分为四组。一旦形成肿瘤，将小鼠随机分为达拉非尼+t细胞组、达拉非尼+car-t细胞、t细胞组和car-t细胞组。每周测量肿瘤体积并记录，瘤体积＝0.5*长径*短径2。

car-t细胞构建：用ptrpe-5e5scfv-41bb-cd3z质粒、携带gag/pol、env、vsvg元件一起转染293t细胞(参照文献poseyetal.,2016,immunity44,1444–1454)，在24和48小时收集病毒液。病毒液感染pbmc细胞后，il-2刺激其增殖，含有10％胎牛血清的rpmi-1640中培养1周。

甲基化特异性pcr法：dneasytissuesystem(qiagen)提取细胞系的dna，用epitectbisulfitekit(qiagen)对基因组dna进行亚硫酸氢盐修饰，用快速循环pcr试剂盒(qiagen)对修饰后的dna进行pcr扩增(参考文献doi:10.1158/0008-5472.can-07-6844)。pcr条件为95℃5min,96℃5s36个循环,58℃5s,68℃3s，最终延伸反应72℃1min。扩增后产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳并成像。

荧光素酶报告基因检测：分别将dnmt1、cosmc基因的启动子区插入到pgl3-basic荧光素酶质粒中，构建成dnmt1-luc报告质粒与cosmc-luc报告质粒。分别将对照pgl3-basic荧光素酶质粒、dnmt1-luc报告质粒、cosmc-luc报告质粒与prl-tk内参质粒转染到mda-mb-231细胞系中，在不同药物处理后用luciferaseassaykit(promega,e1501)按照标准操作进行实验。

统计分析：体外实验数据按照平均值±标准差表示。所有统计分析均使用spss16.0统计软件包进行。不同治疗方法下的细胞活力，集落形成和肿瘤体积比较用t检验和单向方差分析。在所有情况下，*p<0.05，**p<0.01和***p<0.001。

二、结果

1、如图1所示，从小分子药物库中筛选可促进muc1表达的药物。a：以三阴性乳腺癌细胞系mda-mb-231为模型，在初步筛选中，达拉非尼可明显促进muc1的表达。b：对初步筛选结果中可促进muc1表达3倍以上的药物进行二次筛选。在二次筛选结果中，达拉非尼对muc1的表达促进作用最显著。

2、如图2所示，在多种肿瘤细胞系及多种肿瘤原代细胞中验证raf/mek/erk通路抑制剂对ta-muc1的上调作用。c、d：分别用rt-qpcr、westernblotting的方法检测mda-mb-231、a375、pc9细胞系中，raf/mek/erk通路抑制剂作用后muc1的表达上调。e、f、g：分别用总muc1的抗体和检测低糖基化muc1的抗体用流式细胞术检测到mda-md-231、a375、pc9细胞系中，raf/mek/erk通路抑制剂作用后肿瘤细胞低糖基化muc1上调程度远高于总muc1上调程度。h：用检测低糖基化muc1抗体检测多种肿瘤类型的原代细胞达拉非尼作用前后ta-muc1的变化。

3、如图3所示，在多种肿瘤细胞系中验证达拉非尼对muc1car-t细胞杀伤效果的促进作用。i、j、k：分别将对照组肿瘤细胞、达拉非尼处理后的肿瘤细胞与t细胞、car-t细胞共培养，用流式细胞术检测凋亡的肿瘤细胞，发现达拉非尼可明显增强muc1car-t细胞杀伤效果，但是却对t细胞的杀伤效果无明显影响，达拉非尼单独作用未造成肿瘤细胞明显的凋亡。l：elisa实验检测上述共培养上清中t细胞或car-t细胞ifn-γ的释放。

4、如图4所示，在动物模型中验证达拉非尼对muc1car-t细胞治疗的增强作用。m：在patienta、patientb的肺癌pdx模型中发现比较明显的达拉非尼对muc1car-t细胞治疗的增强作用，而在patientc肺癌pdx模型中未观察到达拉非尼的促进作用。n：在黑色素瘤细胞系a375构建的cdx模型中观察到达拉非尼可明显增强muc1car-t细胞治疗疗效。

5、如图5所示，验证血清ca15-3可作为指示muc1car-t治疗疗效的分子标志物。o：在乳腺癌患者的临床样本中，使用免疫组织化学染色进行ta-muc1表达分析、使用p-erk抗体染色进行raf/mek/erk通路激活状态分析，并与血清ca15-3水平进行相关性分析，结果表明肿瘤组织ta-muc1表达水平与血清ca15-3水平呈正相关，p-erk代表的通路激活状态与ta-muc1表达呈负相关。p：在肺癌pdx模型中验证ca15-3对达拉非尼增强muc1car-t细胞治疗疗效的指示作用，在modela中，小鼠灌胃达拉非尼后血清ca15-3的水平有明显的升高，相应地，后续的muc1car-t细胞治疗可被达拉非尼得到明显增强；在modelb中，小鼠灌胃达拉非尼后血清ca15-3升高并不明显，相应地后续muc1car-t细胞治疗疗效未观察到明显的增强作用。

6、如图6所示，raf/mek/erk通路抑制剂可降低muc1基因甲基化水平从而促进muc1的表达。q：msp实验验证muc1基因甲基化受到raf/mek/erk通路抑制剂的调控。r：将dnmt1沉默之后，分别用rt-qpcr、westernblotting、流式细胞术检测muc1表达，发现dnmt1沉默后muc1表达升高。s：回补实验证实raf/mek/erk通路抑制剂通过抑制dnmt1表达促进muc1表达，这种对muc1的上调作用可通过dnmt1过表达而得到减弱。t：荧光素酶报告基因检测(luciferase实验)验证raf/mek/erk通路抑制剂对dnmt1的转录调控作用，并且发明人发现e2f1是该通路下游调控dnmt1表达的转录因子。

7、如图7所示，raf/mek/erk通路抑制剂可下调cosmc表达从而降低muc1糖基化。u：rt-qpcr及荧光素酶报告基因检测(luciferase实验)证明raf/mek/erk通路可调控cosmc的表达及转录。v、w：cosmc可促进muc1的糖基化，raf/mek/erk通路抑制剂对低糖基化ta-muc1的上调作用可被cosmc的过表达所减弱，而raf/mek/erk通路抑制剂对总muc1的上调作用无法被cosmc的过表达所减弱。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。