PLCE1-AS2在乳腺癌中的应用的制作方法

本发明涉及生物医药研究领域，特别是涉及plce1-as2在乳腺癌中的应用。

背景技术：

乳腺癌(breastcancer)是女性最普遍的恶性肿瘤之一，通常发生在乳腺上皮组织。据资料统计，乳腺癌的发病率占全身各种恶性肿瘤的7-10％。全球每年有135万新增加的乳腺癌，其中有42万死亡，每年递增是2％。中国每年有4万多妇女死于本病，虽然不是乳腺癌高发国家，但是其增长速度远远高于其他国家。它的发病影响因素较多，遗传易感性和基因与环境相互作用均与其发生、进展和转移密切相关。虽然通过之前的研究已经发现了多种致癌基因和抑癌基因，使乳腺癌的诊断率有所提高，治疗效果有所改善，但并不能完全解决问题。因此需要对肿瘤发生的分子机制深入了解，为乳腺癌患者的治疗提供新的有效的治疗方法。在没有完全找到乳腺癌的发病原因之前，乳腺癌的早诊断、早治疗，是降低乳腺癌死亡率的关键。

非编码rna根据转录本长度不同又分为两类，一类是长度小于200个核苷酸的短链非编码rna，包括微小rna(mirnas)、小干扰rna(sirnas)和piwi相关rna(pirnas)。另一类长度超过200核苷酸称为长链非编码rna(longnon-codingrna，1ncrna)，其最初被视为“转录噪声”，不具备生物学功能，但越来越多的证据表明lncrna可以在转录水平、转录后水平以及表观遗传学层面调控基因的表达，从而参与人体的多种生理和病理过程，包括癌症转移、侵袭、细胞分化及凋亡等。随着对lncrna的研究增多，越来越多的lncrna在多种肿瘤中被发现，然而目前在乳腺癌中lncrna的研究仍处于起步阶段，在乳腺癌发生发展中作用机制尚不明确，有待进一步研究。寻找与乳腺癌发生发展相关的lncrna对乳腺癌的机制研究以及临床上的诊断和治疗具有重要的意义。

技术实现要素：

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明提供了一种与乳腺癌发生发展相关的标志物plce1-as2，并提供plce1-as2抑制剂为乳腺癌的治疗提供了新的方法和思路。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供了plce1-as2抑制剂在制备治疗乳腺癌的药物组合物中的应用。

在一些实施方式中，所述应用包括制备抑制乳腺癌细胞迁移、侵袭和增殖的药物组合物。

在一些实施方式中，所述药物组合物包括抑制plce1-as2表达或plce1-as2功能的试剂。

在一些实施方式中，所述试剂包括所述plce1-as2抑制剂选自：能降低plce1-as2表达量的sirna、dsrna、shrna、mirna、反义核苷酸；或者能表达或形成所述sirna、dsrna、shrna、mirna、反义核苷酸的构建物。

在一优选的实施方式中，所述plce1-as2抑制剂为sirna，其核苷酸序列如seqidno.1～2所示。

本发明的第二方面，提供了一种治疗乳腺癌的药物组合物，所述药物组合物以plce1-as2抑制剂为活性成分。

在一些实施方式中，所述药物组合物还包括药物可接受的载体和/或辅料。

优选地，所述载体和/或辅料包括慢病毒载体、脂质体或壳聚糖。

本发明的第三方面，提供了一种筛选治疗乳腺癌的候选物质的方法，所述方法包括：

用待筛选物质处理含有plce1-as2基因的培养体系；和

检测所述培养体系中plce1-as2基因的表达；

其中，若所述待筛选的物质可以抑制plce1-as2基因的表达水平，则表明该待筛选物质是治疗乳腺癌的候选物质。

本发明的第四方面，提供了第三方面所述的方法在筛选治疗乳腺癌的潜在物质中的应用。

本发明将plce1-as2基因作为作用对象，对药物或制剂进行筛选，以找到可以抑制plce1-as2基因表达的药物作为乳腺癌治疗备选药物。如本发明所述的plce1-as2基因小分子干扰rna(sirna)即是以人plce1-as2基因为作用对象筛选获得的，可用作具有抑制乳腺癌细胞增殖作用的药物。除此之外，诸如抗体药物，小分子药物等也可将plce1-as2基因作为作用对象。

本发明的第五方面，提供了plce1-as2检测试剂在制备乳腺癌诊断试剂盒中的应用。

在一种实施方式中，所述试剂盒用于诊断受试者是否患有乳腺癌风险，通过测量来自所述受试者的测试样品中的plce1-as2的水平来诊断受试者是否患有乳腺癌风险，其中与对照样品中plce1-as2的水平相比，测试样品中plce1-as2的水平上调，指示着受试者患有乳腺癌的风险。

在一些实施方式中，所述试剂盒包括通过使用qrt-pcr、印记杂交、原位杂交、阵列杂交、基因芯片或新一代测序来检测plce1-as2或其同源物的水平的试剂。

在一优选实施方式中，所述试剂包括特异性针对plce1-as2的探针或引物。

基于上述技术方案，本发明具有以下有益效果：

本发明通过敲低plce1-as2后可有效地抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移、侵袭进程。本发明提供的plce1-as2抑制剂能够特异性抑制乳腺癌细胞的增殖速率、迁移、侵袭，从而治疗乳腺癌，为乳腺癌治疗开辟新的方向。

附图说明

图1plce1-as2在乳腺癌组织中的表达；

图2plce1-as2在乳腺癌细胞中的表达；

图3为plce1-as2转染模拟物后，q-pcr检测plce1-as2的表达量；

图4为plce1-as2转染模拟物后检测细胞增殖；

图5为plce1-as2抑制乳腺癌细胞迁移(a)和侵袭(b)结果图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

本发明统计学分析：

所有数据采用均数±标准差(mean±sd)表示。两组间比较采用双侧student'st检验，三组及以上采用单因素方差分析。所有结果均采用graphpadsoftware软件进行绘图，以p<0.05为检验水准，当p<0.05为差异有统计学意义。

实施例1qpcr检测plce1-as2在乳腺癌组织中的表达

1、样本收集

收集就诊于北京大学深圳医院的乳腺癌组织和乳腺癌癌旁组织各8例，全部病例在手术前均未接收化疗和放疗，所有的患者均已知情同意，并取得均通过组织伦理委员会的同意。

2、rna提取

利用qiagen的组织rna提取试剂盒进行组织rna的提取，按说明书的具体步骤进行操作。

3、qpcr检测

1)反应体系：

rna模板1μl，随机引物1μl，双蒸水加至12μl，混匀，低转速离心，65℃5min，然后放在冰上冷却。

继续在12μl反应液中加入下列成分：

5×反应缓冲液4μl，rna酶抑制剂(20u/μl)1μl，10mmdntp混合液2μl，amv反转录酶(200u/μl)1μl；充分混匀并进行离心处理；

2)逆转录反应条件

25℃5min，42℃60min，70℃5min。

3)聚合酶链反应

pcr反应体系：

2×qpcr混合液12.5μl，基因引物2.0μl(引物由上海生工设计合成)，反转录产物2.5μl，ddh2o8.0μl。

pcr反应条件：95℃10min，(95℃15s，60℃60s)×40个循环，60℃5min延伸反应。75℃至95℃，每20s升温1℃，绘制溶解曲线。以sybrgreen作为荧光标记物，在荧光实时定量pcr仪上进行pcr反应。通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，2^-δδct法进行相对定量。

4、结果

结果如图1显示，plce1-as2在乳腺癌患者中呈现差异性表达，与癌旁组织相比，其在癌组织中的表达水平显著上调，*p<0.05。

实施例2qpcr检测plce1-as2在乳腺癌细胞中的表达

发明人检测mcf10a(对照细胞)、mda-mb-231细胞中plce1-as2的表达水平。

rna提取和pcr反应具体步骤参照实施例1中所述。

结果如图2所示，与对照细胞mcf10a相比，plce1-as2-在人乳腺癌细胞系中mda-mb-231细胞中高表达，*p<0.05。

实施例3plce1-as2基因对乳腺癌细胞增殖的影响

1、sirna的设计

针对plce1-as2基因的序列设计sirna，设计的sirna序列如下所示：

sirna-plce1-as2：

正义链：5’-uuccagucccauggcuugccc-3’(seqidno.1)，

反义链：5’-gcaagccaugggacuggaagg-3’(seqidno.2)；

阴性对照sirna序列(sirna-nc)：

正义链：5’-uucuccgaacgugucacgu-3’(seqidno.3)，

反义链：5’-acgugacacguucggagaa-3’(seqidno.4)；

3、转染

将mda-mb-231细胞按2×10⁵/孔接种到六孔细胞培养板中，在37℃、5％co2培养箱中细胞培养24h；在无双抗、含10％fbs的rpmi1640培养基中，转染按照脂质体转染试剂3000(购自于invitrogen公司)的说明书转染。

实验分为阴性对照组(sirna-nc)和实验组(sirna-plce1-as2)，其中阴性对照组sirna与plce1-as2基因的序列无同源性，浓度为20nm/孔，同时分别进行转染。

用q-pcr检测其表达量，具体步骤参照实施例1所述。结果如图3表明，sirna-plce1-as2转染mda-mb-231后细胞中plce1-as2表达量显著性降低(*p<0.05)，证明sirna能有效敲低plce1-as2的表达。

进一步，sirna-plce1-as2转染mda-mb-231细胞24、36、48、72和96h后，体外用cck-8试剂盒检测细胞增殖，具体步骤如下：

1)转染后的mda-mb-231细胞培养72h，用0.25％胰酶消化进行细胞计数，将细胞接种于96孔板中，浓度为1×10⁴/ml，每孔加100μl；

2)避光条件下，96孔板中每孔加入10μl的cck8试剂，晃动培养板3min,然后将培养板放入培养箱中继续培养，2h后取出，在酶标仪450nm波长处测定od值。

结果如图4，plce1-as2能够显著性抑制乳腺癌细胞的增殖(**p<0.01)。

实施例3细胞迁移及侵袭实验

1、侵袭实验

matrigel用pbs进行20倍稀释，以50μl/孔的体积铺在transwell小室的聚碳酸酯膜上。37℃预置2h聚合成凝胶备用。每组设3个复孔，上室每孔加入200μl细胞悬液，约1×l0⁵个；在下室加入500μl含fbs的rmpi1640培养基，置于37℃、5％co2条件下培养24h后用70％甲醇固定，0.4％结晶紫染色，封片后随机选取4个视野(x100)计穿膜细胞数，取平均值。

2、迁移实验

过程与transwell侵袭实验基本一致，但不需要铺matrigel胶及培养板置于37℃、5％co2条件下培养8h。

3、结果

结果如图5所示，与对照组相比，实验组的迁移(图5a)及侵袭(图5b)能力均有明显下降，结果说明plce1-as2水平的降低能够抑制乳腺癌的迁移及侵袭，提示plce1-as2可作为靶标应用于乳腺癌转移的治疗。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110>北京大学深圳医院

<120>plce1-as2在乳腺癌中的应用

<130>p200233

<141>2020-07-15

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>21

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

uuccagucccauggcuugccc21

<210>2

<211>21

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

gcaagccaugggacuggaagg21

<210>3

<211>19

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

uucuccgaacgugucacgu19

<210>4

<211>19

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

acgugacacguucggagaa19