一种浴海绵止血材料及其制备方法和应用

1.本发明属于医药领域，具体涉及浴海绵来源的止血材料。


背景技术：

2.海绵动物(多孔动物门)是地球上最简单和最古老的多细胞动物，其化石痕迹可以追溯到18亿年前的沉积物，海绵在动物进化树中分歧出来的时间比任何已知的其它后生动物门都要早。海绵具有由骨针或海绵质构成的骨架，那些没有硅质或钙质骨针但只具有海绵质骨架的海绵被俗称为浴海绵，在分类上属寻常海绵纲、网角海绵目。由于海绵质骨架具有坚韧耐久、有弹性和多孔吸水等特征，在人类历史早期就已被加工利用。比如5000年前，古埃及人和古希腊人就采集浴海绵将其骨架加工为清洁或绘画工具、储水工具、头盔衬垫、手术附件，甚至用做避孕工具。浴海绵的采集利用是一个历史悠久的产业，即便上世纪50年代开始出现的化工海绵对该产业造成了冲击，浴海绵产品仍然没有完全退出市场，其作为高档的沐浴用品备受人们喜爱。除了传统用途，浴海绵骨架作为一种生物惰性材料，具有潜在广泛的应用价值。有学者利用浴海绵骨架耐腐蚀、耐高温以及富含孔隙结构等特点，通过合成了赤铁矿-海绵质或氧化锰-海绵质复合材料，证实该材料具有良好的电容贮存能力和充放电稳定性。浴海绵骨架还可用于药物或固定化酶的载体材料。浴海绵骨架的另一个潜在应用是作为生物医学材料。浴海绵spongia sp.的骨架可以作为细胞附着支架体外培养人骨先质细胞，细胞生长效果明显好于人造塑料支架；另有报道显示浴海绵骨架是成骨细胞生长的理想支架，其枝状结构为细胞增殖提供了支撑使其能在孔隙空间中大量增殖，表明浴海绵骨架可以作为一种全新的材料用于骨组织工程学。
3.有研究表明，由浴海绵骨架制备而来的sfm和sr材料具有良好的体外凝血活性，具有一定的应用前景(沐浴角骨海绵硬蛋白提取及其止血性能评价，陈经纬，厦门大学2019年硕士毕业论文)。但sfm和sr的制备步骤较为繁琐，得率较低；动物在体止血实验也比较初浅。因此，有必要对浴海绵来源的止血材料进行进一步研究。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供了一种浴海绵止血材料及其制备方法和应用。
5.本发明解决其技术问题所采用的技术方案之一是：
6.一种浴海绵止血材料，所述浴海绵止血材料为不大于590μm的海绵质粉末，所述海绵质粉末来源于浴海绵骨架；所述海绵质粉末由浴海绵骨架直接破碎制成，不经过酸处理、碱处理和胰酶处理。
7.进一步地，所述海绵质粉末不具有网格结构，包括100～300μm的骨架纤维片段和50μm以下的骨架纤维颗粒，部分骨架纤维相互缠绕。
8.一实施例中，所述浴海绵包括沐浴角骨海绵(spongia officinalis)、髯毛角骨海绵(又译为丝海绵)(spongia barbara)或茸毛马海绵(hippospongia lachne)。不同来源的
agent均具有极显著的促凝血效果。
附图说明
28.图1为本发明实施例2中颈动脉破裂家兔3小时生存曲线。
29.图2本发明实施例3的不同来源的浴海绵骨架以及制备的海绵质粉末的照片。其中，a1为沐浴角骨海绵的骨架外观照片；a2为沐浴角骨海绵的骨架在石磨研磨前的扫描电镜照片；a3为沐浴角骨海绵的骨架破碎后(即f-agent)的扫描电镜照片；b1为髯毛角骨海绵的骨架外观照片，标尺为300μm；b2为髯毛角骨海绵的骨架在石磨研磨前的扫描电镜照片，标尺为300μm；b3为髯毛角骨海绵的骨架破碎后(即f-agent)的扫描电镜照片，标尺为200μm；c1为茸毛马海绵的骨架外观照片，标尺为300μm；c2为茸毛马海绵的骨架在石磨研磨前的扫描电镜照片，标尺为300μm；c3为茸毛马海绵的骨架破碎后(即f-agent)的扫描电镜照片，标尺为300μm。
具体实施方式
30.下面结合附图和实施例具体说明本发明的内容：
31.实施例1
32.本实施例提供了浴海绵止血材料的制备方法，包括如下步骤：
33.(1)从海南儋州海滩拾取沐浴角骨海绵的陈旧骨架，其肉质已天然脱落，将其在自来水中充分搓洗以除去泥沙，挤干水分，在烘干机中90℃烘干2h。
34.(2)将浴海绵骨架切成约1cm厚的海绵片，再用科密s-550碎纸机(广州科密)将海绵片剪碎为约0.2cm
×
0.5cm
×
0.5cm大小，将该破碎后的组分称为a。
35.(3)取部分a，加入适当的清水，-80℃冷冻4h，用荣浩rhp-600型高速粉碎机破碎5min，取出海绵材料后挤干水分，阴干，过30目不锈钢筛网，筛过组分称为b。
36.(4)取部分b用0.8n盐酸溶液室温处理19h，取出以清水洗涤数次，阴干，该组分称为c。
37.(5)取部分c加入100ml tris-hcl缓冲液(0.1m，ph7.8)和0.1g胰蛋白酶(trypsin 1:250，solarbio)，37℃震荡酶解2d，取出以清水洗涤数次，阴干，该组分称为d。
38.(6)取部分b、c和d组分，分别用0.5n naoh溶液浸泡2h，取出后以清水洗涤数次，阴干，分别称为bal、cal和dal。
39.(7)取部分a用石磨研磨，过30目不锈钢筛网，未筛过部分称为e，筛过部分称为f。
40.一、对枸橼酸钠抗凝血的体外凝血检测
41.取2ml枸橼酸钠处理的抗凝羊血于玻璃试管，加入85μl 0.1m的氯化钙溶液和20mg测试材料后迅速混匀，肉眼观察材料与血液的浸润程度，尽可能地使材料与血液浸润后再置于37℃水浴锅中温浴，每隔5～10秒倾斜试管45
°
观察血液是否凝固，记录血液完全凝固时的时间，每组重复3次。测试材料分别为空白对照(即不加任何材料)、上述制备流程得到的海绵质粉末a、b、c、d、bal、cal、dal、e、f材料，以及sfm材料(用作正对照1)和celox-a材料(medtrade products ltd，货号v12090+，用作正对照2)。其实验结果如表1所示：
42.表1各实验材料与血液的浸润情况和凝血时间
[0043][0044]
从表1可以看出，海绵质粉末a、b、bal、cal、dal、e、f和sfm在显著性分组中同属一组，可见这些材料具有相似的凝血时间。浴海绵骨架经过科密s-550碎纸机处理后就具有显著的促凝血效果(a材料)，但由于a材料存在大量小孔，其与血液的自然浸润速度较慢，在本实验操作时采取了剧烈震荡才将气泡赶出，使得材料迅速与血液浸润；酸处理反而使得材料抑制凝血，比空白对照的凝血时间显著地更长(c和d材料)；碱处理虽然不显著提升凝血效果(bal材料)，但可以有效反转由酸造成的抑制凝血效应(cal和dal材料)；胰蛋白酶处理不提升凝血效果(d和dal材料)；将材料研磨更细虽然不显著降低凝血时间，但其与血液浸润的速度将更快：其不需要震荡就自然地迅速与血液浸润，凝集后的血凝块也更为坚实(b和f材料)；e材料与血液浸润速度则与a材料类似，材料需要一定的震荡才能排出气泡而与血液浸润；从凝血时间、材料与血液浸润效率两个方面来看，b、f材料与正对照sfm材料几乎没有差异。
[0045]
意外的是正对照celox的数据。celox止血粉为商品化止血敷料的典型例子，由英国medtrade products ltd公司出品，其成分为壳聚糖颗粒。颗粒呈粉末状和鳞片状，具有很大的血液接触面。该止血粉直接给药于伤口部位，与血液接触后会导致颗粒膨胀，产生水凝胶吸收作用而促进物理止血。该材料已被广泛应用于严重出血伤口(比如肝钝伤、动脉穿刺出血和腹股沟撕裂伤等)的止血处理，显示出高效的止血效果，并能减少再出血的发生。但从上述结果可知，虽然celox比空白对照的凝血时间明显缩短，但与b、f和sfm材料相比，其凝血时间指标、与血液浸润效率这两个指标都显著更差，即使剧烈震荡，在短时间内celox材料也很难与血液完全浸润，其最终形成的凝血块坚实程度也明显不如b、f和sfm材料形成的凝血块。
[0046]
以上结果可以得出如下结论：采自遗留在海滩上的浴海绵骨架原料与从新鲜海绵制备获得的浴海绵骨架原料在凝血机能上没有明显差异；酸、碱和胰酶处理不会提升浴海
绵的促凝血活性，未经酸、碱或酶处理的浴海绵骨架本身就具备一定的促凝血的机能；但浴海绵骨架的疏松多孔结构使得单位体积海绵骨架的有效剂量较低，被多孔结构锁住的空气又阻碍了海绵骨架与血液的快速接触，因此影响了未处理的浴海绵骨架的止血性能。但通过将浴海绵骨架破碎到一定程度后，尺寸小于590μm(过30目筛后)就可以显著提高材料与血液的浸润速度，也即该材料的表面可以在极短时间内就与血液接触，更大程度发挥其凝血机能。
[0047]
同时，一种优异的浴海绵止血材料制备方法在于如何简便高效地破碎浴海绵骨架。而通过切片
→
科密s-550碎纸机剪切
→
石磨研磨串联的破碎方法可以快速达成预期(f)，比冷冻破碎法有更高的破碎效率(b)，且凝血时间也更低。因此f材料获得方法是上述不同处理方法中的最优方法。将f材料命名为f-agent。
[0048]
二、对脱纤维血液的体外凝血检测
[0049]
海绵质sfm材料和sr材料对于有凝血因子缺陷的血液具有明显的促凝血功能。本实验检测f-agent材料对脱纤维血液是否具有类似的功效。
[0050]
取1ml无菌脱纤维羊血(南京茂捷微生物有限公司)玻璃试管，加入40mg测试材料后迅速混匀，马上置于37℃水浴锅中温浴，每隔5～10秒倾斜试管45
°
观察血液是否凝固，记录血液完全凝固时的时间，每组重复3次。测试材料分别为空白对照、sfm材料、celox-a材料和f-agent。其实验结果如表2所示：
[0051]
表2各40mg材料对1ml脱纤维羊血的凝血时间
[0052][0053]
由此可见，f-agent对脱纤维羊血的促凝集效果与sfm材料一致，而celox材料无法凝集脱纤维血液。
[0054]
实施例2
[0055]
本实施例比较了沐浴角骨海绵的f-agent材料和商品化的celox材料对家兔颈动脉破裂的止血效果。沐浴角骨海绵的f-agent来源于实施例1。celox-a材料由medtrade products ltd生产，货号v12090+。实验步骤如下：
[0056]
(1)从上海市松江区松联实验动物场获得18只健康成年雄性新西兰大耳兔，体重(1.9
±
0.4)kg，实验动物质量合格证号：20170008000817，实验动物生产许可证号：scxk(沪)2017-0008。实验动物随机分为三组：负对照组(采用普通医用纱布止血)、正对照组(采用celox-a止血粉止血)和测试组(采用f-agent材料止血)。每组6只。
[0057]
(2)兔耳缘静脉注射20％氨基甲酸乙酯(5ml/kg)麻醉动物。动物固定于实验台上，颈部剪毛，紧靠喉头下缘切开颈部皮肤5～7cm，钝性分离皮下筋膜及胸锁乳突肌，游离出一侧颈总动脉，穿双线备用。结扎远心端，在距结扎线的4～5cm处用动脉夹夹闭近心端，颈总动脉下方用一纸条垫起。在靠近结扎线处用显微剪剪开血管直径的1/2刺破血管，然后打开
动脉夹，记时为t0，自由喷血30s，记时为t1，用纱布收集流出的血液，称重，记为自由出血量。
[0058]
(3)在t1时间点实施止血：负对照组使用三块无菌医用纱布(每块约0.5g，共约1.5g)，折成四折，直接在创口上用医用止血压袋(100g)进行压迫止血。正对照组和测试组分别将celox-a止血粉(1.0g)和f-agent材料(1.0g)撒在伤口上，马上用1块纱布(约0.5g)覆盖伤口，用医用止血压袋(100g)进行压迫止血。
[0059]
(4)各组动物压迫止血2min，除去医用止血压袋和纱布观察止血情况，之后每2min打开纱布观察止血情况。5s内不渗血(或用滤纸条轻蘸创口，不再沾有血液)即认为止血成功，记时t2。止血成功之后不再覆盖纱布，每隔10min观察是否出现再出血，记录再出血的案例数。t0之后3h，观察是否有死亡案例，若发生死亡，则记录开始t1后死亡时间，同时记录3h的纱布重量差。
[0060]
实验结果如下：
[0061]
(1)存活率
[0062]
表3 3小时生存率(n＝6/组)
[0063][0064]
3小时存活率：纱布组为0％，celox组为67％，f-agent组为100％。由此可见celox止血粉和f-agent能显著提升动物存活率，而f-agent无死亡案例，明显优于celox止血粉。
[0065]
(2)各材料的自由出血量、止血期出血量及止血时间
[0066]
表4自由出血量及止血期出血量及止血时间
[0067][0068]
注：每组6只动物。p1为纱布组和celox组比较，p2为纱布组与f-agent组比较，p3为celox组与f-agent组比较。
[0069]
*：显著差异；**：极显著差异
[0070]
由表1可见，实施止血前的3个组别自由出血量均值在24.1～25.2g之间，相互之间无显著差异(p＞0.05)。实施止血后，celox组的平均出血量少于纱布组，但差异不显著(p＞0.05)；f-agent组的平均出血量则显著少于纱布组(p＜0.05)；f-agent组的平均出血量少
于celox组，但差异不显著(p＞0.05)。从止血时间上来看，三组之间有极为显著的差异：纱布组的6只兔子均未止血成功；celox组平均止血时间为10.33分钟，f-agent组的平均止血时间为3分钟，极其显著地好于celox组(p＜0.001)。由此可见在相同止血措施下，f-agent明显优于celox-a止血粉，施加f-agent的实验动物的止血期出血量更少、止血时间更短和生存率更高。
[0071]
实施例3
[0072]
本实施例检测了不同来源天然浴海绵制备而来的f-agent的凝血活性。操作步骤如下：
[0073]
(1)从海南儋州潮间带收获新鲜的沐浴角骨海绵，用力搓洗海绵除去肉质直至获得干净的骨架；室温避光保存了5年的、从海南儋州海滩拾取的沐浴角骨海绵骨架；进口自希腊的经漂白加工成浴球的髯毛角骨海绵(s.barbara)和茸毛马海绵(h.lachne)。洗净、阴干。
[0074]
(2)将以上浴海绵骨架分别切成约1cm厚的海绵片，再用科密s-550碎纸机将海绵片剪碎为约0.2cm
×
0.5cm
×
0.5cm大小。
[0075]
(3)将上述海绵颗粒用石磨研磨，过30目不锈钢筛网，获得过筛部分，未过筛部分重新投入石磨研磨，直至8成以上的颗粒通过30目筛网。121℃15分钟灭菌。由此获得了来源于沐浴角骨海绵(新鲜)、沐浴角骨海绵(储存时间》5年)、髯毛角骨海绵(漂白加工)和茸毛马海绵(漂白加工)的f-agent粉末。
[0076]
一、体外凝血时间检测
[0077]
实验方法同实施例1，但略有不同：取2ml枸橼酸钠处理的抗凝羊血和20mg测试材料于聚丙烯塑料(pp)试管中混匀，肉眼观察材料与血液的浸润程度，37℃水浴预热5min。维持37℃水浴，加入85μl 0.1m的氯化钙溶液，每隔3～10秒倾斜试管45
°
观察血液是否凝固，记录血液完全凝固时的时间，每组重复3次。实验结果如表5所示：
[0078]
表5各实验材料与血液的浸润情况和凝血时间
[0079][0080]
由表5可见由不同新鲜程度的、不同物种的、甚至漂白过的浴海绵骨架加工而来的f-agent均具有极显著的促凝血效果。
[0081]
二、扫描电镜观察
[0082]
实验方法：将沐浴角骨海绵(新鲜)、髯毛角骨海绵(漂白加工)和茸毛马海绵(漂白加工)骨架的碎块(石磨研磨前)或f-agent粉末均匀撒在鸡蛋清液浸润过的硅片上，烘干使其固定。喷金，扫描电镜观察拍照。
[0083]
从图1可以看出：1.三种浴海绵骨架具有类似的外观和纤维结构，石磨研磨前后的显微结构也非常类似；2.石磨研磨后，浴海绵骨架的网络结构遭到破坏，骨架纤维大部分断裂为100～300微米长度的片段，少数破裂为50微米以下的细小颗粒，少数较长的纤维相互缠绕。由此可见f-agent粉末不再具有较为刚性的网络结构，纤维片段的密度有很大提高。
[0084]
综上3个实施例所述，不施加酸、碱和酶处理的天然浴海绵骨架本身就能促进凝血。但天然浴海绵骨架的疏松多孔结构使得单位体积海绵骨架的有效剂量较低，被多孔结构锁住的空气又阻碍了海绵骨架与血液的快速接触，降低了有效剂量。采用机械方法破坏海绵的多孔结构后的f-agent，单位体积的有效剂量得到明显提高，其效能迅速发挥而达到快速凝血。家兔颈动脉破裂止血实验证明了f-agent确实具有优秀的在体止血效果，而且从存活率、止血期出血量和止血速度等参数来看，f-agent均好于商品化的celox。f-agent凝血效果显著、材质惰性皮实、耐长时间储存、耐冷热、耐氧化，具有良好的应用前景。
[0085]
以上所述，仅为本发明较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。