透明质酸及其盐在改善肠道菌群失调中的用途及其组合物的制作方法

1.本发明属于食品领域，具体涉及透明质酸及其盐在制备用于改善患者肠道菌群失调和/或与肠道菌群失调有关的病症的组合物中的应用，以及它们在用于改善患者炎症因子紊乱和/或与炎症因子紊乱有关的病症的组合物中的应用，还涉及包含它们的组合物。


背景技术：

2.人体肠道是一个多元化和充满活力的微生态系统，寄居着种类繁多的微生物，它们统称为肠道菌群。肠道微生物在人类健康中有着举足轻重的地位，它掌管着人体70％的免疫力，排除80％的毒素，消化吸收95％的营养物质。在我们的肠道上皮黏膜中存在的大量的微生物群以及肠上皮内的粘液和细胞所组成的物理屏障为肠道微生物群与宿主之间的共生关系提供了第一层保护。微生物多样性越低，表示菌群的组成和功能越简单，更容易破坏其稳定性，菌群失调的风险增加。肠道微生态失衡，已被证实与包括消化系统疾病(如炎症性肠病、慢性腹泻)、免疫系统疾病(如哮喘、过敏、湿疹)、代谢性疾病(如肥胖、糖尿病)在内的50多种疾病直接或间接相关。
3.炎症性肠病(ibd)是一种慢性炎症过程，包括克罗恩病(cd)和溃疡性结肠炎(uc)，克罗恩病的主要症状为慢性腹泻和腹痛，而溃疡性结肠炎患者则更容易出现间歇性腹部痉挛和血性腹泻，迄今为止的研究进展表明，炎症性肠病是一种多菌性疾病，源于遗传易感宿主中几种成分的相互作用，这些成分包括肠道微生物群的失调和环境因素。研究人员对确诊的炎症性肠炎患者肠道优势菌群定量检测发现：与健康对照者相比，脆弱拟杆菌在活动期uc和cd患者中均偏低。同时，研究者采用了一个微生物群落结构层次模型区分取得了持续缓解(sr)的小儿克罗恩病患者和那些启动正常饮食后早期复发(非sr)的患者。sr流行的群落包含大量的艾克曼菌属(akkermansia)和拟杆菌属，变形菌门数量有限，而非sr流行的群落中有较多的变形菌门。
4.拟杆菌属(bacteroides)又称类杆菌属，主要为脆弱拟杆菌，存在于肠道，其维护人体健康和调节免疫功能的作用已被广泛认可，属于条件致病菌。脆弱拟杆菌可有效抑制肠道腐败菌生长繁殖、减少毒素、促进排便、改善肠功能，并能够自动识别并激发巨噬细胞的吞噬能力，靶向作用于有害毒素，将其包裹并吞噬，恢复人体菌群平衡，优化肠腔环境，重建肠道微生态平衡。艾克曼菌属(akkermansia)被认为是健康人体肠道中最丰富的黏液溶解细菌，可以利用肠道黏膜层中的黏蛋白作为其能源，通过竞争作用保护肠道免受病原体侵害。肠道中低水平的艾克曼菌属可能导致黏膜层的变薄，从而导致肠道屏障功能减弱，使肠道内的毒素更容易侵入人体。患有炎症性肠病、肥胖症和ii型糖尿病的患者体内的艾克曼菌属含量会有所降低。
5.透明质酸(ha)是一种酸性粘多糖，由重复的d-葡萄糖醛酸和n-乙酰葡萄糖胺组成的高分子聚合物，是细胞外基质的重要组成成分。透明质酸的前体n-乙酰葡萄糖胺可以直接作为肽聚糖的底物，参与合成肽聚糖。肽聚糖是益生菌细胞壁的主要成分，如革兰氏阳性细菌(g+)胞壁所含的肽聚糖占干重的50-80％，保持肽聚糖的完整性和益生菌发挥其作用
密切相关。同时ha作为一种潜在的益生元，益生菌可以利用ha前体n-乙酰葡萄糖胺作为营养物质，促进肠道菌群共生，维护肠道微生态平衡，改善由肠道菌群紊乱引发的肠道炎症、免疫力低下、肥胖、糖尿病等疾病。
6.通过检索，发现如下三篇与本发明专利申请相关的文献和专利：
7.1.yeojungkim等利用35kda透明质酸钠处理小鼠肠道鼠柠檬酸杆菌感染，对小鼠远端结肠组织的裂解液进行zo-1印迹分析，检测粪便菌落总数，结果表明透明质酸可以促进结肠炎模型中的上皮zo-1表达，诱导β-防御素的表达，改善肠屏障功能，减少鼠柠檬酸杆菌定植，改善鼠柠檬酸杆菌引发的结肠炎。但该方法只能证明透明质酸可以改善鼠柠檬酸杆菌所导致的肠道炎症，无法证明透明质酸和肠道菌群的相互关系。
8.2.专利公开号cn103393713a提供了一种透明质酸及其盐在制备治疗便秘的药物中的应用，以透明质酸与调节肠道菌群的药物或膳食纤维(低聚木糖、低聚果糖、低聚半乳糖、大豆低聚糖或异麦芽低聚糖)为主要原料，改善便秘。但是该方法没有对透明质酸和肠道菌群的关系做深度分析。
9.3.专利公开号cn110101722a提供了一种复合益生菌菌剂用于制备治疗溃疡性结肠炎产品的用途，其按一定比例将干酪乳杆菌zhang、动物双歧杆菌v9、植物乳杆菌p-8和植物乳杆菌c2复合成制剂，该法能够调节肠道菌群的益生功能从而使肠道菌群健康化,改善肠炎。但相较于本发明该法工艺路线复杂，益生菌对保存条件要求高，加工或保存过程中极易失活，同时容易使消费者产生依赖性，产品的开发和应用有一定的局限性。
10.通过对比，本发明专利申请与上述公开专利和文献存在本质的不同。


技术实现要素：

11.本技术旨在至少解决现有技术中存在的技术问题。为此，本技术的目的之一在于提供一种特定分子量的透明质酸用于改善患者肠道菌群失调和/或改善患者肠道炎症；申请的目的之二在于提供一种新的具有改善肠道菌群失调和/或改善肠道炎症的组合物。透明质酸可以作为有益菌的碳源和有益菌细胞壁主要成分肽聚糖的底物，维护肠道微生态平衡。发明人发现特定分子量10至1000kda，优选20至35kda，最优选25kda的透明质酸钠能降低健康人群和肠炎患者厚壁菌门/拟杆菌门的比例，提高疣微菌门比例，显著提高艾克曼菌属(akkermansia)和拟杆菌属(bacteroides)的丰度。透明质酸钠是细胞外基质的重要组成成分，由重复的d-葡萄糖醛酸和n-乙酰葡萄糖胺组成的高分子聚合物组成，性质稳定、无异味、可溶于水，已实现工业化生产。现阶段未见透明质酸钠在调节肠道菌群方面的研究和报道。
12.本技术的目的是通过以下技术方案实现的：
13.1.透明质酸及其盐在制备用于改善患者肠道菌群失调和/或与肠道菌群失调有关的病症的组合物中的应用。
14.2.如项1所述的应用，其中所述改善患者肠道菌群失调是指，在透明质酸处理后，艾克曼菌属(akkermansia)、拟杆菌属(bacteroides)、毛螺旋菌科的lachnospiraceae_ucg-001菌属、ruminiclostridium菌属、ruminiclostridium_9菌属、罗斯特菌属(roseburia)的含量显著提高。
15.3.如项1所述的应用，所述与肠道菌群有关的病症选自炎症性肠病、免疫力低下、
肥胖、糖尿病、高血压、高血糖、高血脂、肿瘤、神经系统疾病、过敏性疾病、生殖系统炎症中的一项或多项。
16.4.如项1所述的应用，其中，所述透明质酸的盐是透明质酸的钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、锌盐、铋盐或者它们中的两种以上的组合。
17.5.如项1所述的应用，其中，所述透明质酸及其盐的分子量范围为10-1000kda，优选20至35kda，最优选25kda
18.6.如项1所述的应用，其中，所述透明质酸及其盐是经马链球菌兽疫亚种发酵后、再经透明质酸酶酶解获得的。
19.7.如项1所述的应用，其中，在用于改善患者肠道菌群失调时，所述组合物中的透明质酸及其盐的推荐用量为10mg-20g/天，优选至40mg-2g/天，最优选80-160mg/天。
20.8.透明质酸及其盐在制备用于改善患者炎症因子紊乱和/或与炎症因子紊乱有关的病症的组合物中的应用。
21.9.如项8所述的应用，其中改善患者炎症因子紊乱是指，下调组织中的tnf-α、inf-γ、il-17，而上调组织中的il-10。
22.10.如项8所述的应用，其中与炎症因子紊乱有关的病症是炎症性肠病(ibd)。
23.11.如项8所述的应用，其中，所述透明质酸的盐是透明质酸的钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、锌盐、铋盐或者它们中的两种以上的组合。
24.12.如项8所述的应用，其中，所述透明质酸及其盐的分子量范围为10-1000kda，优选20至35kda，最优选25kda
25.13.如项8所述的应用，其中，所述透明质酸及其盐是经马链球菌兽疫亚种发酵后、再经透明质酸酶酶解获得的。
26.14.如项8所述的应用，其中，在用于改善患者单独发生的或合并发生的肠道炎症时，所述组合物中的透明质酸及其盐的推荐用量为10mg-20g/天，优选至40mg-2g/天，最优选80-160mg/天。
27.15.一种用于改善患者的肠道炎症和/或菌群失调的组合物，其包括透明质酸及其盐。
28.16.如项15所述的组合物，其中，所述透明质酸的盐是透明质酸的钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、锌盐、铋盐或者它们中两种以上的组合。
29.17.如项15所述的组合物，其中，所述透明质酸的分子量范围为10-1000kda，优选20至35kda，最优选25kda。
30.18.如项15所述的组合物，其中，所述透明质酸是经马链球菌兽疫亚种发酵后、再经透明质酸酶酶解获得的。
31.19.如项15所述的组合物，其中，所述组合物还包括银耳多糖、γ-氨基丁酸、姜黄、姜黄素、铁皮石斛、锌盐、猴头菇提取物、噬酸乳杆菌、双歧杆菌、罗伊士乳杆菌、依克多因、麦角硫因等。
32.本技术的技术方案取得的有益效果有：
33.本技术人发现，分子量10-1000kda，优选20至35kda，最优选25kda透明质酸钠具有调节肠道菌群及改善肠炎的功能，上述分子量的透明质酸钠可提高益生菌/致病菌的比值进而达到改善肠道健康的目的；具体地，该分子量可以为10kda、15kda、20kda、25kda、
30kda、35kda、40kda、45kda、50kda、60kda、70kda、80kda、90kda、100kda、200kda、400kda、600kda、800kda、1000kda。透明质酸(ha)是肠道细胞外基质的重要组成成分，属于人体本身就有的成分，具有安全性，适合于长期服用。现阶段未见透明质酸钠在调节肠道菌群结构方面的报道。
34.因而，本发明提供了上述分子量的透明质酸钠在调节肠道菌群结构及改善肠炎中的用途。即将上述分子量的透明质酸钠以适当的产品形式、剂量对健康小鼠和感染鼠柠檬酸杆菌小鼠进行给药处理，经一段时间的干预后达到调节动物肠道菌群结构的目的，实验表明上述分子量的透明质酸钠能降低健康人群和肠炎患者厚壁菌门/拟杆菌门的比例，提高疣微菌门的丰度，为透明质酸钠在调整肠道菌群结构及改善肠炎方面的开发和应用奠定了基础。
35.目前市场上常见的肠道微生物调节剂为益生菌。补充益生菌虽然有益肠道健康，但外来的益生菌难以在肠道内长期定植及形成分布优势，因此效果不能持续。透明质酸(ha)是肠道细胞外基质的重要组成成分，其前体n-乙酰葡萄糖胺可以作为有益菌的有益菌碳源和有益菌细胞壁主要成分肽聚糖的底物，维护肠道微生态平衡。
36.根据本发明的透明质酸钠能降低鼠柠檬酸杆菌的含量，且显著增加健康小鼠和肠炎小鼠肠道中艾克曼菌属(akkermansia)、拟杆菌属(bacteroides)、毛螺旋菌科的lachnospiraceae_ucg-001菌属、ruminiclostridium菌属、ruminiclostridium_9菌属、罗斯特菌属(roseburia)、norank-f-ruminioco ccaceca菌属的相对丰度，这为透明质酸钠缓解肠炎提供了理论依据。
37.根据本发明的透明质酸钠及其产品能够有效促进抑炎因子的产生，抑制炎症反应，这提示透明质酸钠对肠道炎症有积极作用。
38.根据本发明的改善肠道菌群结构改善肠炎的方法所使用的透明质酸钠可单独食用亦可作为添加剂用于普通食品，保健品，功能性食品如运动饮料、特殊医学用途食品、婴幼儿奶粉等、药品中。
39.本发明的组合物还具有所有原料源于天然，安全可靠，贮运和应用安全，质量稳定，可长期保存的优点。
附图说明
40.图1不同分子量透明质酸钠对小鼠体重的影响；
41.图2不同分子量透明质酸钠对小鼠结肠组织病理学结果的影响；
42.图3不同分子量透明质酸钠对小鼠粪便中鼠柠檬酸杆菌含量的影响；
43.图4透明质酸钠对小鼠体重的影响；
44.图5透明质酸钠对小鼠结肠组织病理学结果的影响；
45.图6透明质酸钠对肠道微生物菌群分布(门分类水平)的影响；
46.图7透明质酸钠对肠道微生物菌群分布(属分类水平)的影响；
47.图8透明质酸钠对小鼠体重的影响；
48.图9透明质酸钠对肠道微生物菌群分布(门分类水平)的影响；
49.图10透明质酸钠对肠道微生物菌群分布(属分类水平)的影响；
50.图11透明质酸钠对小鼠结肠长度的影响；
51.图12透明质酸钠对小鼠组织学评估的影响；
52.图13透明质酸钠对小鼠粪便中鼠柠檬酸杆菌含量的影响；
53.图14透明质酸钠对小鼠炎症因子的影响。
具体实施方式
54.需要说明的是，在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定组件。本领域技术人员应可以理解，技术人员可能会用不同名词来称呼同一个组件。本说明书及权利要求并不以名词的差异来作为区分组件的方式，而是以组件在功能上的差异来作为区分的准则。如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本发明的较佳实施方式，然所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本发明的范围。本发明的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。
55.本技术首先实现了制成一种用于改善患者的肠道炎症和/或菌群失调的组合物，其包括透明质酸及其盐。该组合物可以为普通食品/功能食品/药品/保健品，并可以制成为任何适宜的剂型/产品形式，只要该形式适合于采用食品级透明质酸及其盐并将其作为有效成分使用。
56.在一个实施方式中，所述透明质酸是应用发酵法生产的，具体地，发酵时使用的是马链球菌兽疫亚种(s.equi subsp.zooepidimicus)，以葡萄糖、蛋白胨、酵母粉等为培养基，发酵温度为32-39℃，发酵ph为6-8。
57.在一个实施方式中，所述透明质酸是在发酵之后进一步采用酶解法生产的，具体地，酶解时采用的透明质酸酶为芽孢杆菌(bacillus sp.)发酵产生，酶活可达到8
×
10
6-1.5
×
107iu/ml，酶解温度为20-48℃，酶解ph为4-9，酶解至相应分子量后，酶解液在50-90℃下保持10-60min对芽孢杆菌透明质酸酶灭活，经过滤、沉淀、调整ph值等工艺得相应分子量透明质酸钠及透明质酸。
58.在一个实施方式中，所述透明质酸应当以盐的形式提供给患者使用，常用的形式可以是透明质酸钠、透明质酸钾、透明质酸镁、透明质酸钙、透明质酸锌、透明质酸铋，制成盐的方式可以使用本领域常用的手段，例如，透明质酸锌的制成是通过离子置换反应完成，透明质酸钠浸泡入锌盐的醇溶液中，经搅拌、过滤、洗涤、干燥得透明质酸锌固体粉末。
59.在一个实施方式中，进一步将透明质酸及其盐制成组合物，该组合物可以为片剂、胶囊剂、冲剂、口服液、普通食品形态(如饮料、果冻、饼干、糖果等)。例如当采用片剂(透明质酸钠)时候，除了透明质酸钠，该片剂的成分还包括填充剂诸如山梨糖醇、木糖醇、赤酰糖醇、乳糖、白砂糖、微晶纤维素、可食用淀粉等，功效成分诸如银耳多糖、γ-氨基丁酸、姜黄、姜黄素、铁皮石斛、猴头菇提取物、双歧杆菌、噬酸乳杆菌、罗伊士乳杆菌、维生素、矿物质、依克多因、麦角硫因等。
60.其次，本发明实现了采用上述组合物对患者肠道炎症和/或菌群失调进行治疗。在用于改善患者单独发生的或与菌群失调合并发生的肠道炎症时，所述组合物中的透明质酸及其盐的推荐用量为10mg-20g/天，优选至40mg-2g/天，最优选80-160mg/天；具体地，每日用量可以为10mg、20mg、30mg、40mg、50mg、60mg、70mg、80mg、90mg、100mg、120mg、140mg、160mg、180mg、200mg、300mg、400mg、600mg、800mg、1000mg、2g、3g、4g、6g、8g、10g、12g、14g、
16g、18g、20g。临床试验证明，使用上述用量的组合物用于治疗时，可以做到安全、有效。
61.在本说明书的上下文中，“肠道菌群失调”特指下述情况：健康人类的胃肠道内寄居着种类繁多的微生物，这些微生物统称为肠道菌群。肠道菌群按一定的比例组合，各菌间互相制约，互相依存，在质和量上形成一种生态平衡，一旦机体内外环境发生变化，例如应用广谱抗生素，敏感肠菌被抑制，而未被抑制的细菌会乘机繁殖，从而引起菌群失调，其正常生理组合被破坏，而产生病理性组合、引起临床症状；这种情况称为“肠道菌群失调”。本技术致力于将特定分子量的透明质酸应用于“肠道菌群失调”及其相关病症，其工作原理在于，透明质酸作为一种酸性粘多糖，是细胞外基质的重要组成成分；另外，其参与合成肽聚糖，而肽聚糖是益生菌细胞壁的主要成分；这些属性决定了，透明质酸可以作为益生元使用。
62.在本说明书的上下文中，“肠道菌群失调相关病症”选自：肠道炎症、免疫力低下、肥胖、糖尿病、高血压、高血糖、高血脂、肿瘤、神经系统疾病、过敏性疾病、生殖系统炎症中的一项或多项。
63.在本说明书的上下文中，“细胞因子”指由免疫细胞(如单核、巨噬细胞、t细胞、b细胞、nk细胞等)和某些非免疫细胞(内皮细胞、表皮细胞、纤维母细胞等)经刺激而合成、分泌的一类具有广泛生物学活性的小分子蛋白质。细胞因子一般通过结合相应受体调节细胞生长、分化和效应，调控免疫应答。细胞因子(cytokine，ck)是免疫原、丝裂原或其他刺激剂诱导多种细胞产生的低分子量可溶性蛋白质，具有调节固有免疫和适应性免疫、血细胞生成、细胞生长、apsc多能细胞以及损伤组织修复等多种功能。细胞因子可细分为白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子超家族、集落刺激因子、趋化因子、生长因子等。本技术的技术方案通过实验证明，特定范围分子量，特别是25kda的透明质酸钠能够下调结肠组织中tnf-α、inf-γ、il-17，上调il-10。
64.在本说明书的上下文中，“炎症性肠病”特指一种慢性炎症过程，包括克罗恩病(cd)和溃疡性结肠炎(uc)，克罗恩病的主要症状为慢性腹泻和腹痛，而溃疡性结肠炎患者则更容易出现间歇性腹部痉挛和血性腹泻，迄今为止的研究进展表明，炎症性肠病是一种多菌性疾病，源于遗传易感宿主中几种成分的相互作用，这些成分包括肠道微生物群的失调和环境因素。环境因素即包括细胞因子在内的微环境。上面提及几种细胞因子中，tnf-α主要是由单核细胞、巨噬细胞和t细胞产生，它不仅能刺激巨噬细胞、平滑肌细胞、上皮细胞等分泌花生四烯酸代谢物、细胞因子和蛋白酶还能吞噬细胞产物和补体片段引发细胞坏死、间质中蛋白质破坏和水肿发生，从而促进胃肠细胞的组织损害。tnf-α可协同inf-γ改变肠上皮细胞的形态结构和屏障特性，导致黏膜通透性增加。另外tnf-α还可诱导结肠上皮细胞凋亡促进uc的发生。在炎症反应方面，il-10能通过下调单核细胞表面主要组织相容性抗原ⅱ(classⅱmajor histocompatibilitycomplex,mhcⅱ)的表达，降低其抗原呈递作用，下调t淋巴细胞活性,抑制炎性细胞的激活、迁移和粘附。白细胞介素-17(il-17)则是细胞诱导的炎症反应的早期启动因子，可以通过促进释放前炎性细胞因子来放大炎症反应。
65.下面将更详细地描述本发明的具体实施例。虽然在此显示了本发明的具体实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。下文中，实施例由“制备例”和“测试例”组成。
66.《制备例》
67.制备例1.透明质酸钠固体饮料的制备
68.原料：25kda透明质酸钠、异麦芽酮糖醇、低聚异麦芽糖、甜菊糖苷、柠檬酸、硬脂酸镁、草莓香精
69.制备方法：将透明质酸钠、异麦芽酮糖醇、低聚异麦芽糖、柠檬酸分别过60目筛，称取9重量份透明质酸钠、60重量份异麦芽酮糖醇、70重量份低聚异麦芽糖、6重量份柠檬酸，充分混合45min加适量水混合制成软材，颗粒机14目筛制粒后干燥1-3h，经14目筛整粒得到透明质酸钠干颗粒。干颗粒和1重量份甜菊糖苷、1重量份草莓香精、2重量份硬脂酸镁高效混合30min后罐装即制得。
70.制备例2.透明质酸钠口服液的制备。
71.原料：25kda透明质酸钠、姜黄、葡萄糖酸锌、山梨酸钾、纯化水。
72.制备方法：将透明质酸钠、姜黄、葡萄糖酸锌分别过100目筛，称取6重量份透明质酸钠溶于250重量份纯净水中充分溶解30min后，依次溶解1重量份葡萄糖酸锌、5重量份姜黄和1重量份山梨酸钾，充分溶解1小时后过滤，杀菌，装罐后即制得。
73.制备例3.透明质酸钠片剂的制备。
74.原料：25kda透明质酸钠、噬酸乳杆菌、双歧杆菌、异麦芽酮糖醇、山梨糖醇、硬脂酸镁。
75.制备方法：将透明质酸钠、噬酸乳杆菌、双歧杆菌、异麦芽酮糖醇、山梨糖醇分别过60目筛，称取1重量份噬酸乳杆菌、1重量份双歧杆菌和10重量份山梨糖醇充分预混10分钟，将预混料和剩余山梨糖醇、10重量份透明质酸钠、15重量份异麦芽酮糖醇、1重量份硬脂酸镁继续高效混合30分钟，将所得物料置于压片机中，按照现有片剂生产技术要求制成片剂。
76.制备例4.透明质酸γ-氨基丁酸益生菌固体饮料的制备
77.原料：25kda透明质酸钠、银耳多糖、γ-氨基丁酸、噬酸乳杆菌、双歧杆菌、异麦芽酮糖醇、低聚异麦芽糖、甜菊糖苷、柠檬酸、甜橙香精
78.制备方法：将透明质酸钠、银耳多糖、γ-氨基丁酸、异麦芽酮糖醇、低聚异麦芽糖、柠檬酸过60目筛后，分别称取9重量份透明质酸钠、5重量份银耳多糖、3重量份γ-氨基丁酸、60重量份异麦芽酮糖醇、70重量份低聚异麦芽糖、6重量份柠檬酸，充分混合45min加适量水混合制成软材，颗粒机14目筛制粒后干燥1-3h，经14目筛整粒得到透明质酸钠干颗粒。干颗粒和1重量份噬酸乳杆菌、1重量份双歧杆菌、2重量份甜菊糖苷、3重量份甜橙香精高效混合30min后罐装即制得。
79.《测试例》
80.测试例1.不同分子量透明质酸钠对小鼠肠炎的影响
81.采用“25kda透明质酸钠、35kda透明质酸钠、1060kda透明质酸钠、360kda透明质酸钠食品级透明质酸钠原料”进行以下实验：
82.实验设计：
83.60只6-8周spf级balb/c小鼠，实验前一周从标准房移至bsl2实验室。随机分为6组，每组10只。具体处理方案如下：
84.对照组：10只，健康小鼠，正常饮食。
85.模型组：10只，健康小鼠，正常饮食。感染当天，小鼠禁食4h并管饲0.5ml(5
×
108cfu)鼠柠檬酸杆菌，并在2h后恢复正常饮食。
86.透明质酸处理组：共分为4组，每组小鼠10只，正常饮食。小鼠感染前3天至第4天感染当天，每天分别定时服用300μg 25kda透明质酸钠、300μg35kda透明质酸钠、300μg 360kda透明质酸钠、300μg 1060kda透明质酸钠，感染后期仍每日定时服用透明质酸钠。感染当天，小鼠禁食4h并管饲0.5ml(5
×
108cfu)鼠柠檬酸杆菌，并在2h后恢复正常饮食。
87.14d后，通过批准的人道主义方法处死小鼠。处死后解剖留取结肠组织，10％甲醛液固定，石蜡包埋，常规苏木素一伊红染色，观察结肠组织病理学改变。实验过程中每日定点检测一次小鼠体重，粪便涂板测粪便中细菌的含量。
88.1.1不同分子量透明质酸钠对小鼠体重的影响
89.记录各组小鼠每天的体重变化，结果如图1所示。结果显示，对照组小鼠体重增加5％，模型组小鼠体重减少5％。透明质酸处理组中服用360kda透明质酸钠和1060kda透明质酸钠的小鼠体重分别减少3％和4％，服用25kda透明质酸钠和服用35kda透明质酸钠的小鼠经过2周透明质酸钠给予体重基本恢复正常，但服用25kda透明质酸钠的小鼠体重恢复效果较服用35kda透明质酸钠的小鼠好。以上结果证明，不同分子段透明质酸钠均可以缓解鼠柠檬酸杆菌诱导小鼠结肠炎的体重下降，但是25kda透明质酸钠缓解鼠柠檬酸杆菌诱导小鼠结肠炎的体重下降的效果最好，可以有效帮助小鼠恢复体质，改善肠道炎症。
90.1.2不同分子量透明质酸钠对小鼠结肠组织病理学结果的影响
91.组织病理学评估是诊断和鉴别ibd的首要步骤，通过结肠组织病理组织图可以清晰的看到结肠组织的状态，准确判断小鼠肠道炎症的病程和恢复状况，结果如图2所示。结果显示与对照组(水)相比，模型组(cb，即鼠柠檬酸杆菌处理组)小鼠结肠组织粘膜损伤严重、杯状细胞减少、固有层细胞炎症浸润严重，并伴有肠壁增厚现象。25kda透明质酸钠和35kda透明质酸钠干预的结肠炎小鼠结肠组织粘膜损伤和炎症细胞浸润现象均得到明显缓解，360kda透明质酸钠对炎症细胞浸润有一定保护作用，1060kda透明质酸钠对炎症细胞浸润无明显保护作用。结果表明，25kda透明质酸钠和35kda透明质酸钠处理均能够明显改善鼠柠檬酸杆菌导致的结肠损伤。
92.1.3不同分子量透明质酸钠对小鼠粪便中鼠柠檬酸杆菌含量的影响
93.小鼠粪便中鼠柠檬酸杆菌的含量如图3所示。结果显示，与模型组比，透明质酸处理组小鼠粪便鼠柠檬酸杆菌排出量均减少，但25kda透明质酸钠处理组小鼠粪便鼠柠檬酸杆菌排出量明显比35kda透明质酸钠处理组、360kda透明质酸钠处理组和1060kda透明质酸钠处理组小鼠檬酸杆菌排出量低。结果表明，25kda透明质酸钠减少鼠柠檬酸杆菌的定植，提高肠道对病原微生物的控制能力。
94.该试验初步证明25kda和35kda透明质酸钠可以有效改善鼠柠檬酸杆菌导致的结肠损伤，帮助小鼠恢复体质，这可能是因为透明质酸钠分子量并不是固定的大小，所谓的透明质酸分子量为平均分子量，25kda和35kda透明质酸钠分子量分布很接近，因此改善结肠组织损伤的效果基本一致。但是25kda透明质酸钠缓解鼠柠檬酸杆菌诱导小鼠结肠炎的体重下降以及减少鼠柠檬杆菌的定植效果优于35kda透明质酸钠。综合改善结肠组织损伤、缓解小鼠体重下降以及减少鼠柠檬杆菌的定植的效果三个因素，后期试验采用25kda透明质酸钠处理小鼠，验证其改善小鼠肠道菌群及结肠炎症效果。
95.测试例2、透明质酸钠改善小鼠肠道菌群结构实验
96.采用“25kda食品级透明质酸钠原料”进行以下实验：
97.2.1实验设计：
98.20只6-8周spf级balb/c小鼠，实验前一周从标准房移至bsl2实验室。随机分为2组，每组10只。具体处理方案如下：
99.对照组：10只，健康小鼠，正常饮食。
100.透明质酸处理组：10只，健康小鼠，正常饮食+25kda透明质酸钠
101.按照试验分组情况饲养2周，实验过程中每天定点检测一次小鼠体重，实验结束前24小时取新鲜粪便，冷冻保存，采用高通量测序对粪便菌群测定。通过批准的人道主义方法处死小鼠后解剖留取结肠组织，10％甲醛液固定，石蜡包埋，常规苏木素一伊红染色，观察结肠组织病理学改变。
102.2.2透明质酸钠对小鼠体重的影响
103.连续14d分别灌胃pbs和透明质酸钠，记录各组小鼠给药后每天的体重重值，结果如4图所示。结果显示，对照组和实验组小鼠相差不大，说明透明质酸具有一定的安全性，不会对小鼠的健康产生影响。
104.2.3透明质酸钠对小鼠结肠组织病理学结果的影响
105.结肠组织病理组织图和组织学损伤评分结果如图5所示。结果显示与对照组相比，透明质酸处理组小鼠结肠组织形态结构更完整、排列紧密，无组织粘膜损伤和炎症细胞浸润现象，透明质酸钠处理组的组织学损伤评分结果比对照组低。结果表明，25kda透明质酸钠具有一定安全性，对小鼠肠道具有一定保护作用。
106.2.4透明质酸钠对小鼠肠道生物菌群结构组成的影响
107.主要微生物区系成分在门的水平上的相对丰度如图6所示。通过群落条形图分析，在门的水平上其优势菌群主要为厚壁菌门(firmicutes)、拟杆菌门(bacteroidetes))。透明质酸处理后厚壁菌门(firmicutes)的相对丰度与对照组相比略降低。相反，疣微菌门(verrucomicrobia)的相对丰度在透明质酸处理后透明质酸处理后显著增加。结果表明，透明质酸可以调节肠道菌群。
108.主要微生物区系成分在属的水平上的相对丰度如图7所示。透明质酸处理后艾克曼菌属(akkermansia)和拟杆菌属(bacteroides)的丰度显著增加。艾克曼菌属(akkermansia)被认为是健康人体肠道中最丰富的黏液溶解细菌，可以利用肠道黏膜层中的黏蛋白作为其能源，通过竞争作用保护肠道免受病原体侵害。肠道中低水平的akkermansia可能导致黏膜层的变薄，从而导致肠道屏障功能减弱，使肠道内的毒素更容易侵入人体。患有炎症性肠病、肥胖症和ii型糖尿病的患者体内的akkermansia含量会有所降低。拟杆菌属(bacteroides)又称类杆菌属，主要为脆弱拟杆菌，存在于肠道，其维护人体健康和调节免疫功能的作用已被广泛认可，属于条件致病菌。脆弱拟杆菌可有效抑制肠道腐败菌生长繁殖、减少毒素、促进排便、改善肠功能，并能够自动识别并激发巨噬细胞的吞噬能力，靶向作用于有害毒素，将其包裹并吞噬，恢复菌群平衡，优化肠腔环境，重建肠道微生态平衡。
109.该试验初步证明25kda透明质酸钠具有一定安全性，可以保护小鼠肠道组织，服用透明质酸钠的小鼠结肠组织更光滑清晰，无任何粘膜损伤和炎症细胞浸润现象。同时，透明质酸可以调整肠道菌群，显著提高小鼠肠道内艾克曼菌属(akkermansia)和拟杆菌属
(bacteroides)的含量。
110.测试例3.透明质酸钠对菌群失调模型小鼠的影响
111.采用“25kda食品级透明质酸钠原料”进行以下实验
112.3.1实验设计
113.实验设计思路：30只6-8周spf级balb/c小鼠，实验前一周从标准房移至bsl2实验室。
114.具体处理方案如下：
115.对照组：10只，健康小鼠，正常饮食。
116.模型组：10只，健康小鼠，正常饮食。小鼠灌胃鼠柠檬酸杆菌构建菌群失调模型，均按计量0.5ml/次(109cfu)，1次/天，连续造模6天，确保造模小鼠出现腹泻等致病菌相关性症状。
117.透明质酸处理组：10只，健康小鼠，正常饮食。小鼠灌胃鼠柠檬酸杆菌构建菌群失调模型，均按计量0.5ml/次(109cfu)，1次/天，连续造模6天，确保造模小鼠出现腹泻等致病菌相关性症状。造模成功后采取灌胃方式每天同一时间分别服用300μg 25kda透明质酸钠。
118.造模成功后，连续饲养14天，饲养条件与适应性实验一致。每日定点检测一次小鼠体重，粪便涂板测粪便中细菌的含量。实验结束前24小时取新鲜粪便，冷冻保存，采用高通量测序对粪便菌群测定。小鼠禁食12h后，眼球取血后断颈处死,血液经离心后获得血清，用elisa法检测炎症细胞因子tnf-α、inf-γ、il-10和il-17水平。实验结束后，解剖小鼠，量取结肠长度。解剖留取结肠组织，10％甲醛液固定，石蜡包埋，常规苏木素一伊红染色，观察结肠组织病理学改变。
119.3.2小鼠造模
120.balb/c小鼠连续灌鼠柠檬酸杆菌6天后，模型组所有小鼠均出现进食量减小，活动减少，精神萎靡不振，毛色无光泽，竖毛拱背，水样稀便等现象，各组腹泻率均为100％，表明肠道菌群失调腹泻小鼠模型造型成功。
121.3.3透明质酸钠对小鼠体重的影响
122.记录各组小鼠给药后每天的体重重值，结果如8图所示。如图可知，透明质酸钠处理的小鼠体重稳定，模型组小鼠体重减轻7％左右。结果表明，透明质酸钠可以缓解鼠柠檬酸杆菌诱导小鼠结肠炎的体重下降，改善肠道炎症，帮助小鼠恢复体质。
123.3.4透明质酸钠对小鼠肠道生物菌群结构组成的影响
124.主要微生物区系成分在门的水平上的相对丰度如图9所示。通过群落条形图分析，健康小鼠在门的水平上其优势菌群主要为厚壁菌门(firmicutes)、拟杆菌门(bacteroidetes))。鼠柠檬酸杆菌感染后，小鼠变形菌门丰度增加。透明质酸处理后小鼠变形菌门相对丰度降低，疣微菌门(verrucomicrobia)的相对丰度显著增加。结果表明，透明质酸钠可以调节肠道菌群。
125.主要微生物区系成分在属的水平上的相对丰度如图10所示。毛螺旋菌科的lachnospiraceae_ucg-001菌属、ruminiclostridium菌属、ruminiclostridium_9菌属roseburia菌属、norank-f-ruminiococcaceca菌属与丁酸盐等短链脂肪酸的产生相关，丁酸盐不仅是上皮细胞的能量来源，可以通过组蛋白的高度乙酰化和抑制核因子-κb信号通路来作为肠黏膜促炎细胞因子表达的抑制剂，还可以促进黏蛋白和抗菌肽的产生来增强肠
屏障功能，通过直接提高紧密结合蛋白的表达来增强肠上皮细胞的完整性，影响细胞的功能和结肠的健康。肠道中低水平的akkermansia可能导致黏膜层的变薄，从而导致肠道屏障功能减弱，使肠道内的毒素更容易侵入人体。拟杆菌属(bacteroides)主要为脆弱拟杆菌，存在于肠道，其维护人体健康和调节免疫功能的作用已被广泛认可，属于条件致病菌。和感染鼠柠檬酸杆菌的小鼠相比，透明质酸处理后小鼠毛螺旋菌科的lachnospiraceae_ucg-001菌属、ruminiclostridium菌属、ruminiclostridium_9菌属、罗斯特菌属(roseburia)、艾克曼菌属(akkermansia)、拟杆菌属(bacteroides)、norank-f-ruminiococcaceca菌属的相对丰度增加，鼠柠檬酸杆菌相对丰度减少。结果表明，透明质酸钠可以改善菌群失调小鼠肠道菌群，保护肠道健康。
126.3.5透明质酸钠对小鼠组织学评估的影响
127.通过结肠组织病理组织图可以清晰的看到结肠组织的状态，准确判断小鼠肠道状况，结果如图12所示。结果显示与对照组相比，透明质酸处理组小鼠结肠组织更加光滑纹理清晰，无组织粘膜损伤和炎症细胞浸润现象。同时，透明质酸钠处理组小鼠组织损伤评分明显低于鼠柠檬酸杆菌组，这表明透明质酸钠干预后可缓解鼠柠檬酸杆菌造成的肠道组织损伤。结果表明，25kda透明质酸钠具有一定安全性，对小鼠肠道具有一定保护作用。
128.3.6透明质酸钠对小鼠结肠长度的影响
129.结肠长度是评价结肠炎症严重程度的另一重要参考指标，图11为两组小鼠的结肠长度对比数据。与模型组相比，透明质酸处理组小鼠结肠长度较长，即透明质酸钠能够显著改善鼠柠檬酸杆菌诱导引起的结肠长度变短以及充血、水肿等炎性症状。
130.3.7透明质酸钠对小鼠粪便中鼠柠檬酸杆菌含量的影响
131.小鼠粪便中鼠柠檬酸杆菌的含量如图13所示。与模型组比，透明质酸处理组小鼠粪便鼠柠檬酸杆菌排出量均减少。结果表明，25kda透明质酸钠减少鼠柠檬酸杆菌的定植，提高肠道对病原微生物的控制能力。
132.3.8透明质酸对小鼠炎症因子的影响
133.透明质酸对小鼠炎症因子的影响如图14所示。25kda透明质酸钠能够下调结肠组织中tnf-α、inf-γ、il-17，上调il-10。结果表明，25kda透明质酸钠可以和免疫受体特异性结合引发一系列信号传导，释放炎症因子，改善肠屏障功能和肠道环境。
134.tnf-α主要是由单核细胞、巨噬细胞和t细胞产生，它不仅能刺激巨噬细胞、平滑肌细胞、上皮细胞等分泌花生四烯酸代谢物、细胞因子和蛋白酶还能吞噬细胞产物和补体片段引发细胞坏死、间质中蛋白质破坏和水肿发生，从而促进胃肠细胞的组织损害。tnf-α可协同inf-γ改变肠上皮细胞的形态结构和屏障特性，导致黏膜通透性增加。另外tnf-α还可诱导结肠上皮细胞凋亡促进uc的发生。
135.在炎症反应方面，il-10能通过下调单核细胞表面主要组织相容性抗原ⅱ(classⅱmajorhistocompatibilitycomplex,mhcⅱ)的表达，降低其抗原呈递作用，下调t淋巴细胞活性,抑制炎性细胞的激活、迁移和粘附。白细胞介素-17(il-17)是细胞诱导的炎症反应的早期启动因子，可以通过促进释放前炎性细胞因子来放大炎症反应。
136.测试例4、以下通过临床实验对本发明实施例的功效进行验证
137.4.1样品
138.将美沙拉嗪(艾迪莎)、乳酸菌素片(药店购买)、透明质酸钠固体饮料(制备例1的
样品，透明质酸钠含量为80mg/袋)、透明质酸γ-氨基丁酸益生菌固体饮料(制备例4的样品，透明质酸钠含量为80mg/袋)进行调整肠炎患者肠道菌群改善肠炎的试验。
139.4.2受试对象
140.选取在某医院消化内科门诊及住院部就诊，符合诊断和排除标准的200例轻度uc患者作为研究对象，年龄18-60岁，性别不限。另选同期医院体检的45例健康志愿者作为对照组。排除标准：伴有其它消化道病变、心肝肾功能不全、恶性肿瘤、糖尿病、既往有腹部手术史者、妊娠或哺乳期妇女、试验前4周内曾服用影响本试验观察的食品/药品/保健品(抗生素、微生态制剂)、自身免疫性疾病及不能按期复诊及随访者。
141.将200例uc患者随机分为美沙拉嗪组、乳酸菌素组、透明质酸钠组、透明质酸钠组合物组，每组50人，治疗30天。具体如下：
[0142] 产品服用方法美沙拉嗪组美沙拉嗪肠溶片每日3次，每次2片乳酸菌素组乳酸菌素片每日3次，每次1片透明质酸钠组制备例1的样品每日2次，每次1袋透明质酸钠组合物组制备例4的样品每日2次，每次1袋
[0143]
4.3观察指标
[0144]
4.3.1临床疗效判定标准
[0145]
治愈：临床症状消失，结肠镜检查黏膜大致正常；显效：临床症状基本消失，结肠镜复查黏膜轻度炎症或假息肉形成；无效：经治疗后临床症状、内镜和病理检查无改善。总有效率＝(治愈+显效)/总例数
[0146]
4.3.2临床症状缓解时间
[0147]
试验期间记录受试者患者治疗后腹痛、腹泻、发热消失时间
[0148]
4.3.3肠道菌群数量
[0149]
选择肠球菌(en-terococcus，ec)、大肠杆菌(escherichia coli，emb)、双歧杆菌(bifidobacterium，bl)、乳杆菌(lactobacillus，lc)、梭状芽孢杆菌、拟杆菌(bacteroides，bd)、柔嫩梭菌(clostridium，cl)为代表菌。在受试者试食之前和试食2周后，均无菌采取受试者粪便，经培养后计数菌落数。检测下限是2
×
102cuf/g湿便，且所有菌落结果数据需取其对数lg n(cfu/g)后再记录，对比肠道菌群数量变化。
[0150]
4.4实验结果
[0151]
表1临床疗效比较
[0152][0153]
由表1可知，轻度uc患者治愈率美沙拉嗪组、乳酸菌素组、透明质酸钠组和透明质
酸钠组合物组分别为94％、58％、66％、80％，透明质酸钠组总有效率高于乳酸菌素组8％，透明质酸钠组合物组总有效改善率高于乳酸菌素组22％。结果表明，透明质酸钠改善uc患者效果优于乳酸菌素片，银耳多糖、γ-氨基丁酸、噬酸乳杆菌、双歧杆菌对改善肠道炎症具有协同增效的作用。
[0154]
表2临床症状缓解时间比较
[0155][0156]
由表2可知，轻度uc患者服用美沙拉嗪肠溶片后5-8天腹痛、腹泻症状消失，透明质酸钠组8-9天症状减轻或消失，透明质酸钠组合物组6-9天症状消失或改善，乳酸菌素组长达11-13天患者症状才消失或减轻，透明质酸钠改善uc患者腹痛、腹泻和发热症状的效果优于乳酸菌素产品。同时，银耳多糖、γ-氨基丁酸、噬酸乳杆菌、双歧杆菌可以协助透明质酸钠改善肠道炎症，患者腹痛腹泻、发热症状持续时间较只服用透明质酸减少2天。
[0157]
表3人肠道菌群数量变化(x
±
s，cfu/g)
[0158][0159]
从菌群数量可见，大肠杆菌、肠球菌此类有害菌在肠炎患者肠道类的数量均高于健康人群，肠道有益菌如乳杆菌、双歧杆菌和柔嫩梭菌的数量均低于健康人群，拟杆菌此类条件性致病菌在肠炎患者的数量略高于健康人群。患者肠道菌群结构相比健康人群发生较大变化，肠道有害菌群增加、有益菌群相对减少导致肠道菌群失调，这可能与炎症性肠病的发病机制密切相关。由表3可知，服用美沙拉嗪肠溶片的患者治疗后虽然大肠杆菌和肠球菌数量降低，但是双歧杆菌、乳杆菌的数量明显低于健康人群，这表明虽然美沙拉嗪肠溶片可以改善uc患者肠道炎症，但是并不能帮助肠道菌群失调患者恢复正常。而服用透明质酸钠和透明质酸钠组合物的患者乳杆菌、双歧杆菌和柔嫩梭菌数量上升，和服用乳酸菌素片和美沙拉嗪肠溶片的患者相比肠道菌群结构更接近健康人群，其中透明质酸组合物组粪便中双歧杆菌、乳杆菌的数量甚至高于健康人群。
[0160]
这可能是因为透明质酸钠可以作为有益菌的碳源和有益菌细胞壁主要成分肽聚糖的底物，促进益生菌的增殖，维护肠道微生态平衡。测试例3表明根据本发明的透明质酸可以调节肠炎小鼠肠道菌群结构，促进肠道内akkermansia菌属、毛螺旋菌科的
lachnospiraceae_ucg-001菌属、ruminiclostridium菌属、ruminiclostridium_9菌属、roseburia菌属、norank-f-ruminiococcaceca菌属等益生菌的增殖，增加肠道菌群的多样性。而且，透明质酸组合物产品成分复配了噬酸乳杆菌、双歧杆菌、银耳多糖、氨基丁酸。噬酸乳杆菌和双歧杆菌具有调整肠菌群失调的作用，银耳多糖到达后肠也作为双歧杆菌和乳杆菌的特异性营养物质，促进肠道理想微生物群的形成，γ-氨基丁酸可以缓解肠炎患者焦躁情绪，多种功效成分复配对uc患者肠道环境起到了多向调节的作用。
[0161]
尽管以上本发明的实施方案进行了描述，但本发明并不局限于上述的具体实施方案和应用领域，上述的具体实施方案仅仅是示意性的、指导性的，而不是限制性的。本领域的普通技术人员在本说明书的启示下和在不脱离本发明权利要求所保护的范围的情况下，还可以做出很多种的形式，这些均属于本发明保护之列。