归芪白术方保护肠道微生态平衡和肠粘膜损伤的新用途

1.本发明属于生物医药领域，涉及归芪白术方的新用途，具体涉及归芪 白术方在制备保护、预防和或治疗肠道损伤的制剂中的应用。


背景技术：

2.随着各类高科技产品的应运而生，核医学、放射医学诊疗技术的 不断提高及广泛应用，人们生活环境充满了各类辐射源，辐射会引起 机体组织及功能的损伤，影响非常之大，急性放射性损伤主要造成骨 髓型、脑型及肠型损伤，防治急性放射性损伤引起的并发症，是我们 临床上亟待解决的难题。x线是一种能量高、波长短的放射线，机体 绝大部分细胞都对放射线敏感，尤其是增殖活跃的细胞，肠隐窝富含 干细胞，亦属于放射敏感组织，因此x线诱发肠粘膜屏障损伤的现象 也越来越常见，在应用x线进行诊疗时，如何减轻x线对肠组织的损 伤也越来越热门。肠道粘膜作为吸收食物营养成分的主要场所，同时 也面临食物中病原微生物及毒素的严峻考验，其屏障系统在阻止致病 菌及毒素的入侵中起主要作用，主要包括机械屏障、化学屏障、免疫 屏障及微生物屏障，而微生物屏障是其中最重要的组成部分。
3.归芪白术方由明
·
朱棣编撰的《普济方》卷二七二之“黄芪汤
”ꢀ
变化而来，全方由黄芪、白术、当归、大黄(酒)、芍药(白芍)、陈 皮、甘草(炒)组成。方中黄芪味甘微温，如脾肺经，补益中气；白 术甘苦而温，归脾胃经，健脾运化，二者共为君药，取“有形之血不 能速生，无形之气急当所固”之理。血为气之母，营为卫之守。当归 甘辛而温，入肝心脾经，和血补血；白芍酸苦微寒，归肝脾经，和营 补血。二者共为臣药，一则可辅助黄芪、白术补气之功，二则兼顾邪 伤血分而调之。大黄苦寒，归脾胃大肠经，“荡涤胃肠、推陈致新”， 活血化瘀，促进毒邪排泄；陈皮辛苦而温，归脾肺经，理气行滞，醒 脾和胃，行气以助活血，反佐黄芪补气之偏盛而生瞋胀，共为佐药。 甘草甘平，归心肺脾胃经，解毒止痛、调和诸药、缓和诸药之性为使。
4.肠道共生菌，是一类对抗外来微生物定植的细菌的统称，其共同 作用于机体发挥防御功能的总和，称之为生物屏障。肠菌在肠道微空 间结构中发挥作用，与宿主形成了一个相互依存，共谋功能的微生态 系统。在一般情况下，肠道共生菌防止病原体入侵和定植，发挥了屏 障功能。当肠道微生态稳态失衡后，肠道对抗外界病原菌的定植抗力 下降，最终导致外菌入侵致病，甚至肠道中有潜在致病性的细菌开始 发挥其致病作用。肠道是体内微生态环境之首，具有体内最大的“储 菌库”，在产生大量内毒素的同时，对内毒素血症诱导的损伤具有增 效放大性，显著增加急危重症的病死率。而辐射就是引起肠道微生态 失衡的因素之一。在x射线辐射剂量达到6gy以上时，肠道菌群的总 体特征将会发生明显改变。
5.结肠蠕动缓慢的特性使得消化液在此流动减缓，氧化还原电位较 低，加之有大量上部消化道推送下来的食物残渣，导致结肠中菌群密 度和细菌种类都居于胃肠道的首位，因此细菌发挥的功能也集中位于 结肠部位。以结肠为抓手研究肠道菌群在防护辐射损伤中的作用势在 必行。
6.肠道菌群通过对中药的代谢作用，进一步影响着药效的发挥。同 时，药物反过来也对菌群有一定的影响。寻求中药方式解决辐射后肠 道菌群失调以及肠粘膜损伤，是本发明所要解决的问题。


技术实现要素：

7.为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供归芪白术方用 于保护、预防和或治疗肠道微生态平衡和肠道损伤的新用途。
8.本发明具体技术方案如下：
9.归芪白术方在制备保护、预防和或治疗肠道损伤的制剂中的应用。
10.上述肠道损伤是指由x射线照射导致的肠道损伤。
11.上述肠道损伤是指肠粘膜屏障和或微生物屏障损伤。
12.上述应用是通过调节肠道微生物表达水平和或微生物多样性来 改善肠道微生物屏障。
13.上述应用通过调节肠道菌群代谢产物来调节肠道微生物表达水 平和或微生物多样性以及肠道菌群代谢产物来来改善肠道微生物屏 障缓解肠道损伤。
14.上述应用是通过减轻肠道炎症反应来保护、预防和或治疗肠道损 伤。
15.上述应用是指肠道损伤引起的腹泻中的应用。
16.归芪白术方在制备和或治疗，辐射引起的免疫功能异常中的应用。
17.上诉归芪白术方由炙黄芪20重量份、炒白术10重量份、当归身 10重量份、生白芍15重量份、生甘草10重量份、陈皮6重量份、 酒大黄6重量份经常规方法制备而成。
18.上述归芪白术方购买于甘肃中医药大学附属医院(以智能免煎颗 粒形式购买)。
19.本发明的优点和有益效果：
20.归芪白术方的作用特点符合辐射损伤的中医病机，该方结合病证 特点，具有攻补兼施、扶正祛邪、健脾益气、祛湿化瘀之功效。相比 于常用的细胞因子等药物，归芪白术方成本低、副作用小。
21.针对辐射损伤的病机，该方结合病证特点，一方面提高机体自身 正气来预防辐射这一邪气带来的损伤，另一方面改善作为人类第二基 因组的肠道菌群的生活状态从而对辐射损伤起到保护作用。最终证明 归芪白术方对x线诱发肠道菌群失调及肠粘膜屏障损伤有保护作用。
附图说明
22.图1为gqbzd对辐射大鼠生活质量评分和腹泻水平的影响的分析图
23.图2为gqbzd对辐射大鼠微生物群落多样性影响的分析图
24.图3为gqbzd对辐射大鼠肠道菌群属水平影响的分析图
25.图4为gqbzd对辐射大鼠肠道菌群代谢产物影响的分析图
26.图5为gqbzd对辐射大鼠肠道he结果的分析图
27.图6为gqbzd对辐射大鼠肠道炎症因子影响的分析图
具体实施方式：
28.下面结合具体的实施方式来进一步阐述本发明。这些实施方式仅 用于说明本发明而不是用来限制本发明的范围。下面实施中所使用的 实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
29.一、动物分组及饲养
30.60只sd大鼠购自甘肃中医药大学，分为空白组(ctrl)、x射线 辐照组(ir)、归芪白术方中剂量组即纯药组(durg)、x射线辐照+ 归芪白术方低剂量组(ld)、x射线辐照+归芪白术方中剂量组(md)、 x射线辐照+归芪白术方高剂量组(hd)，每组10只，雌雄各半。
31.分别对除空白组、纯药组以外的各组大鼠进行全身x射线照射， 照射剂量为6gy，辐射总吸收剂量为6gy，辐射剂量率为92.26 cgy/min，距离皮源为70cm，辐射第3天，麻醉后心脏采血脱颈椎处 死大鼠，取材检测相应指标。
32.二、实验药物
33.2.1.归芪白术方(以下简称gqbzd)的方药组成及来源
34.药物组成：炙黄芪20g、炒白术10g、当归身10g、生白芍15g生 甘草10g、陈皮6g、酒大黄6g。
35.归芪白术方是购买于甘肃中医药大学附属医院的归芪白术方智 能免煎颗粒。其中智能免煎颗粒药物及配药仪器均来自于广东一方制 药有限公司。
36.2.2.归芪白术方动物用药
37.按照临床用量换算成各组大鼠的用药量分别是：
38.纯药组：8.2g/kg归芪白术方
39.低剂量组：4.1g/kg归芪白术方
40.中剂量组：8.2g/kg归芪白术方
41.高剂量组：16.4g/kg归芪白术方
42.实际的制备方法如下：
43.高剂量组用药：取归芪白术方智能免煎颗粒102.3g，用300ml 开水融化并金属浴加热5分钟，待药液温度降至40℃左右，每次2ml 灌胃给药。
44.中剂量组和低剂量组用药依次按等比例稀释，中剂量组，取配好 的高剂量药液100ml，加100ml开水稀释；低剂量组，取配好的高剂 量药液100ml，加300ml开水稀释。
45.三、gqbzd改善辐射大鼠的生活质量
46.3.1生存质量评分
47.观察大鼠精神状态、活动度、反应快慢、被毛光泽和清洁度、进 食水量、大便情况以及大鼠体重的改变。依据文献“化学成分与药理 作用研究综述”和“养阴抗毒胶囊对放射损伤大鼠肾组织热休克蛋白 70与糖皮质激素受体表达的影响”的记载，结合本实验具体情况进 行生存质量评分并进行比较。
48.饲养大鼠过程中，在x射线辐射前，每两天称重一次剩余食水状 况，并将饲料添加至300g，饮水添加至500g，计算辐射前平均每日 的进食水量。每5天测一次体重。辐射后每天清晨称重剩余食水量及 体重，每天对精神状态及反应速度进行评估。具体评估情况如下：每 天饮食量在15
‑
20g评分2分，10
‑
15g评分1分，5
‑
10g评分0分； 每天体重升高大于等于5g评分4分，升高或降低不超过5g评分3 分，下降不超过10g评分2分，下降不超过20g评分
1分，下降超 过20g评分0分；反应迅速，精神状态好，触碰鼠笼有活动者评分3 分，反应较慢，精神状态一般，触碰鼠笼不活动者评分2分，反应慢， 精神状态差，抓握有反抗者评分1分，反应极慢，精神状态极差，抓 握无反抗者评分0分。
49.3.2腹泻状况观察
50.依据文献，观察腹泻情况，结合本实验实际情况，计算腹泻强度 指数并统计分析，间接判断肠道损伤情况。
51.腹泻级：反映稀便的程度。以稀便污染肛周皮毛形成污迹的范围 大小定级。分为5级，标准：肛周无污染，抓取刺激后排出正常成 型便，定为0级；肛周无污染，抓取刺激后排出稀便，定为1级；肛 周污染仅限于肛门处，定为2级；肛周污染较重，范围在生殖器官范 围以内定为3级；肛周污染严重，范围波及下腹部定为4级。于辐射 后第三天取材前称重时对每一只进行评价，级别数即为评分数。公式 如下：
52.腹泻率＝腹泻的动物数/该组动物总数
×
100％
53.腹泻强度指数＝腹泻率
×
腹泻级评分数
54.大鼠生活质量评分和腹泻水平评分检测实验结果见表1、表2，附 图1由表1、表2的数据制作而来。
55.附图1所示，其中图1a为生活质量评分、图1b为腹泻强度评分。 从图1的数据结论可知，x光辐射显著降低了生活质量评分，腹泻强 度增加。gqbzd治疗减轻x射线辐射引起的大鼠生活质量评分降低、缓 解腹泻水平评分(p<0.05)，说明gqbzd能改善辐射大鼠的腹泻和生活 质量。
56.表1各组大鼠生存质量评分
[0057][0058]
注：*为与正常组相比，p<0.05；#为与模型组相比，p<0.05
[0059]
表2腹泻强度指数比较
[0060][0061]
四、gqbzd对辐射大鼠肠道菌群多样性的影响
[0062]
开腹后分离结肠组织，截取盲肠下4cm距离范围内的结肠组织， 沿纵轴剪开结肠，取出粪团块，装入2ml冻存管。若粪质不成形甚至 粪质清稀，则用止血钳夹闭盲肠下端及盲肠下4cm处，剪断，对准 2ml冻存管管口，松开止血钳，让内容物流入到冻存管。
‑
80℃冰箱 冻存待检。冻存粪便室温融化，将粪便标本储存试剂盒中的无菌棉签 取出，蘸取粪便样品少许，再将棉签在试剂瓶中轻轻摇晃，使粪便进 入细菌裂解液中，盖紧瓶盖，标记，送杭州谷禾信息技术有限公司检 测16srrna检测。
[0063]
我们通过对细菌16srrna测序(n＝6)进一步确定了粪便微生物群 组成，结果见附图2。根据各样本特征值确定的空间位置上来看β多 样性，模型组与空白组和纯药组样本位置距离遥远，而归芪白术方各 用药组样本处于未辐照组和辐照组之间，说明归芪白术方能在一定程 度上逆转照射后菌群发生的改变。
[0064]
五、gqbzd对辐射大鼠肠道菌群属水平的影响
[0065]
通过对16srrna检测结果的分析可知，每组中的总微生物组成在 属水平上不同详见表3、表4和附图3。在属水平上，比例最高的前13 种物种的相对丰度。对有总体差异的8种进行比较分析，发现 parabacteroides菌x线照射后相对丰度下降，和归芪白术方干预无关； lactobacillus菌相对丰度仅模型组升高，归芪白术方可以逆转其增 殖；anaerotruncus菌相对丰度随着归芪白术方的剂量增加而增多， 和x线照射关系不大；bacteroides菌相对丰度x线辐照后升高，纯药 组下降，归芪白术方各组对其照射后的增殖有不同程度的抑制作用； lachnoclostridium菌、phascolarctobacterium菌相对丰度在x线辐 照后下降，纯药组亦下降，但归芪白术方各组对其照射后的丰度下降 有不同程度的逆转作用；desulfovibrio菌x线照射后相对丰度升高， 和归芪白术方干预无关；roseburia菌相对丰度x线照射后下降，无论 照射与否，使用药物组比未使用药物组相对丰度有所升高。
[0066]
通过辐射后小鼠结肠内容物16srrna检测，发现gqbzd能够改善 辐射大鼠肠道微生物群门水平的表达。
[0067]
表3各组大鼠肠道parabacteroides菌、lactobacillus菌、 anaerotruncus菌、bacteroides菌比较
[0068][0069]
注：*为与正常组相比，p<0.05；#为与模型组相比，p<0.05
[0070]
表4各组大鼠肠道lachnoclostridium菌、desulfovibrio菌、 roseburia菌、phascolarctobacterium菌比较
[0071][0072]
注：*为与正常组相比，p<0.05；#为与模型组相比，p<0.05
[0073]
六、gqbzd对辐射大鼠肠道微生物代谢产物的影响
[0074]
取肠道内容物进行高效液相分析，通过液相分析检测肠道菌群代 谢产物。其中，辐射显著降低了肠道中乙酸、丙酸和丁酸的含量。gqbzd 提高肠道中乙酸、丙酸和丁酸的含量，详见附图4和表5。
[0075]
说明辐射大鼠肠道微生物代谢产物有影响，gqbzd能够通过调节 肠道菌群代谢产物来缓解肠道损伤。
[0076]
表5乙酸、丙酸和丁酸的表达量
[0077][0078]
注：*为与正常组相比，p<0.05；#为与模型组相比，p<0.05
[0079]
七、gqbzd对辐射大鼠肠道炎症反应的影响
[0080]
开腹后分离结肠组织，以盲肠为标志，盲肠下0.5cm处开始截取 1.5cm结肠组织，剖开肠道，清洗后，置于50ml装有4％多聚甲醛的平 底离心管中固定，送检。结合本次实验观察进行结肠病理评分，每组 取4只大鼠结肠标本，制作4张病理切片，镜下观察，每张取5个200 倍受损严重的视野采集图像，按照结肠损伤程度分为5级。由轻到重 依次评为1分：正常结肠结构；2分：粘膜上皮轻度受损，极少炎细胞 浸润；3分：粘膜上皮不完整，较多炎细胞浸润、腺体轻微扩张；4 分：粘膜上皮脱落、炎细胞明显浸润，间质血管扩张，腺体扩张明显、 有个别红细胞渗出；5分：粘膜上皮大片脱落甚至坏死，炎细胞大量 浸润，间质血管扩张明显，腺体扩张显著，有大量红细胞渗出。结果 见表6和附图5。
[0081]
表6各组大鼠结肠病理积分比较
[0082][0083]
elisa法检测il
‑
4、il
‑
6、il
‑
10、tnf
‑
α等的含量。结果见表7 和附图6。
[0084]
表7各组大鼠细胞因子比较
[0085][0086]
表7和附图6结果显示，x射线照射显著降低白细胞介素
‑
4、白细 胞介素
‑
10、白细胞介素
‑
6、肿瘤坏死因子
‑
α的表达(p<0.05)(图 6a
‑
6d)。与照射组相比，gqbzd治疗改变了白细胞介素
‑
4、白细胞介 素
‑
10、白细胞介素
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6、肿瘤坏死因子
‑
α的表达降低(p<0.05)，表明 gqbzd治疗减轻了x光照射引起的炎症反应(图6a
‑
6d)。说明gqbzd能够 减轻x射线辐射诱发的肠道炎症因子的表达，进而减轻x射线辐射诱发 的肠道炎症反应。