新型sting激动剂复合物的制备、组成及其在抗肿瘤药物中的应用
技术领域：
：1.本发明属于生物医药
技术领域：
：，具体涉及一类新型sting激动剂复合物的制备、组成及其在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术：
：：2.肿瘤是一类严重危害人类生命健康的重大疾病之一。据who统计，全球范围内每年癌症病例可能增加到2400万。目前用于治疗肿瘤的手段主要是手术、放疗和化疗。化疗是目前用于治疗恶性肿瘤的主要手段。化疗药物的最大优点是能够快速抑制肿瘤增殖与转移，在短时间内可将病情控制。顺铂类抗肿瘤药物因其独特的作用机制、广泛的抗癌谱成为目前临床治疗恶性肿瘤最为有效的药物之一。但其毒副作用大，耐药性或交叉耐药性、靶向性不明确等问题,成为了限制其扩大临床应用的障碍。化疗药物对人体正常细胞、组织和器官的毒副作用是限制化疗药物进一步使用的最大障碍和弊端。此外，化疗并不能逆转体内肿瘤组织，当化疗停止一段时间后，肿瘤可能会重新复发导致病情恶化。因此，如何寻求临床治疗过程中，具有更高效、更低毒性的顺铂金属配合物类药物成为人们迫切需要解决的问题。因此，基于单功能顺铂金属配合物，使其具有靶向、复合功能，又能增效减毒，该类创新抗癌铂金属配合物物的研究成为一个国际热点。3.肿瘤免疫治疗是指近几年学术界和医学界发展最为迅速的治疗肿瘤的手段。肿瘤免疫治疗是指通过激活人体免疫系统和免疫细胞，依靠自身的免疫机能，对肿瘤细胞和组织进行杀灭的疗法。与传统的手术、化疗、放疗不同，肿瘤免疫治疗的直接作用靶标不是肿瘤组织，而是人体自身的免疫系统。人体免疫系统复杂而精密，众多免疫细胞各司其职，通过不同的机制保护机体健康。免疫治疗利用人体自身的免疫功能，对肿瘤细胞进行攻击，不会产生传统化疗及放疗的副作用，也不会产生耐药性，并控制肿瘤的发展及转移。但是，由于肿瘤在癌变之前难于被免疫监视系统发现；另一个方面，肿瘤发生发展中，免疫细胞功能通过免疫检查站受到抑制，因此，利用自身免疫抗肿瘤是几十年来难于实现的梦想。能让自身免疫抗肿瘤梦想成真的两个关键点是：(1)通过免疫通路激活剂/激动剂，增强天然免疫能力；(2)破坏免疫检查站对免疫细胞的抑制。人为提高机体对抗肿瘤的免疫反应成为癌症治疗中最令人振奋的科学进展。随着这类药物在临床上的推广应用，其抗肿瘤疗效逐渐得到了临床的认可。利用免疫系统治疗肿瘤，有望成为继手术，化疗，放疗，靶向治疗后肿瘤治疗领域的一场革新。肿瘤免疫治疗已被证明是具有显著临床治疗效果、极具优势的抗肿瘤疗法，目前在临床工作中免疫疗法已被成功应用于黑色素瘤、淋巴瘤、乳腺癌、肺癌、白血病等多种肿瘤的治疗。4.叶酸是一种重要的b族水溶性维生素，又称维生素m，1941年从菠菜中分离而出，又名喋酰谷氨酸。由于叶酸在膳食中的重要性逐渐被认识，特别是叶酸与出生缺陷、心血管病及肿瘤的研究逐步深入，叶酸已成为极其重要的微量营养素。叶酸在嘌呤与嘧啶的合成、氨基酸的相互转化作用以及某些甲基化的反应中都发挥着重要作用。叶酸也常被用作靶向癌细胞表面叶酸受体的靶向试剂，而被应用于制备各种各样的抗癌药物靶向制剂材料。5.在感染的哺乳动物细胞中微生物和病毒dna能通过刺激干扰素分泌诱导內源强有力的免疫应答。内质网(er)受体蛋白(sting)对胞质dna的免疫应答是必需的因素。最近的研究表明，环化cgmp-amp二核苷酸合成酶(cgas)在结合dna后的活化条件下，内源性地催化cgamp的合成。cgamp是一种胞质dna传感器，它作为第二信使通过sting刺激inf-β的感应，介导tbk1和irf-3的活化，进而启动inf-β基因的转录。cgamp作为二级信使分子通过内质网膜上的sting蛋白通路诱导干扰素ifn-β和其他细胞因子的产生，调节下游蛋白质表达，诱导细胞生长停滞和凋亡，产生抗病毒效应。sting通路可以调节免疫原性肿瘤的先天免疫识别，促进干扰素的抗肿瘤作用。cgamp是cgas-cgamp-sting-irf3介导的先天免疫反应的关键刺激物，是sting的内源性激动剂/激活剂，因此，cgamp具有促进抗肿瘤免疫应答的作用。6.本发明研究制备了一类新型天然免疫sting激动剂与叶酸/或叶酸铂金属配合物组成的稳定复合物。该类新型复合物将主动免疫sting激动剂和叶酸或叶酸铂金属配合物组合形成一体，具有靶向、复合功能，又能增效减毒。相比于单独使用免疫sting激动剂/或叶酸铂金属配合物，该类新型sting激动剂复合物抗肿瘤药效显著提高，又能显著降低顺铂金属配合物的毒副作用，是一种理想的创新复合物抗肿瘤药物，具有潜在的抗肿瘤临床应用前景。技术实现要素：7.本发明报道了一类新型sting激动剂复合物，该新型复合物由sting激动剂与叶酸或叶酸铂金属配合物通过氢键和分子间作用力形成的稳定复合体。该类新型sting激动剂复合物可以有效抑制实体肿瘤的生长、肿瘤转移，抗肿瘤药效显著优于单一使用sting激动剂或叶酸铂金属配合物。该sting激动剂与叶酸铂金属配合物复合物抗肿瘤药效明显好于叶酸铂金属配合物，也明显优于奥沙利铂，特别是能显著降低顺铂金属配合物抗肿瘤药物的毒副作用。具体
发明内容包括：8.1、新型sting激动剂复合物的组成。其特征为：新型sting激动剂复合物由先天免疫通路sting激动剂和叶酸或含叶酸配体的顺铂配合物组成。具体特征为：(1)先天免疫通路sting激动剂是指天然免疫通路(cgas-sting-cgamp-irf3通路)sting的激动剂，包括但不限于环二核苷酸(如2’3’-cgamp)及其各种衍生物。(2)叶酸是一种水溶性b类维生素，分子式是c19h19n7o6，又名喋酰谷氨酸；(3)叶酸铂配合物是含有叶酸配体的顺铂金属配合物，包括但不限于环己二胺叶酸合铂(ii)、二氨叶酸合铂(ii)等叶酸顺铂金属配合物；(4)新型免疫激动剂复合物的组成特征为：sting激动剂与叶酸或含叶酸的铂金属配合物通过氢键和分子间相互作用紧密结合成稳定一体复合物；9.2、该类新型sting激动剂复合物的制备方法，其特征在于，将sting激动剂(如2’3’-cgamp)与叶酸或含有叶酸的铂配合物按1:1摩尔比混合溶于水中，调ph＝8，加热(60度)搅拌4小时，过滤加乙醇后在冷藏冰箱放置过夜，析出固体，过滤，干燥，得到新型sting激动剂复合物。10.3、该类新型sting激动剂复合物在制备抗肿瘤药物中的应用。该类复合物药物应用于治疗各种肿瘤，包括但不限于结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、睾丸癌、肺癌、鼻咽癌、食道癌、肾癌、胶质瘤、黑色素瘤、恶性淋巴瘤、头颈部癌、甲状腺癌及成骨肉瘤等多种实体肿瘤。11.4、该类新型sting激动剂复合物在制备抗肿瘤转移药物中的应用，肿瘤转移包括但不限于肺转移、肝转移、淋巴转移、脑转移等。12.5、该类新型sting激动剂复合物药物，包含不同规格的单位制剂及药学上可接受的药物制剂，包括但不限于静脉注射、肌肉注射、皮下注射、静脉滴注、鼻腔滴注、口服等中的一种或多种，进行上述相关疾病的预防或治疗。具体实施方式13.下面通过实施例具体说明本发明的内容。在本发明中，以下所述的实施例是为了更好地阐述本发明，并不是用来限制本发明的范围。14.实施例1：新型sting激动剂复合物的制备与表征15.(1)sting激动剂的制备。环二核苷酸2’3’-cgamp按文献方法在结合dna后的活化条件下，由环化二核苷酸合成酶(cgas)催化合成，纯度在98％以上(lip.w，etal.,immunity,2013,39(6),1019-1031)。16.(2)环己二胺叶酸合铂(ii)金属配合物的制备与表征17.化学试剂均为分析纯，购于sigma公司。环己二胺叶酸合铂(ii)金属配合物的具体合成步骤如下：四氯铂酸钾(1mmol)和碘化钾(8mmol)在20毫升纯净水中搅拌溶解后，滴加环己二胺(dach，2mmol)，继续搅拌反应1小时，产生黄色沉淀，过滤，用水洗涤，得到黄色粉末，干燥，将该黄色粉末与硝酸银混合溶解在50毫升水中，搅拌反应过夜，过滤除掉灰绿色沉淀agi，向滤液中滴加叶酸的氢氧化钠水溶液(2mmol),加热回流反应2天，过滤，滤液浓缩，放置4度冷藏过夜，过滤，得到棕黄色微晶粉末，干燥，得到环己二胺叶酸合铂(ii)金属配合物，产率为70％。环己二胺叶酸合铂(ii)金属配合物经质谱、元素分析、铂金属含量分析验证为[pt(环己二胺)(叶酸)2]。质谱分析正谱最高核质比峰值为1190，与目标产物分子量1189相对应。元素分析及铂金属含量分析结果如下：实测值％(理论值％)。[0018]c：16.78(16.40)；h：43.89(44.41)；n：4.36(4.20)；pt:19.26(18.84)。[0019](3)新型sting激动剂复合物制备与表征[0020]将sting激动剂2’3’-cgamp分别与叶酸或环己二胺叶酸合铂(ii)金属配合物按1:1摩尔比混合溶于水中，调ph＝8，加热(60度)搅拌4小时，过滤后的滤液加等体积乙醇后在冷藏冰箱放置过夜，析出固体粉末，过滤，干燥，得到新型sting激动剂复合物。[0021]实施例中制备的新型sting激动剂复合物如下：[0022]复合物i：sting激动剂叶酸复合物：「2’3’-cgamp：fa」[0023]复合物ii：sting激动剂叶酸铂配合物的复合物：「(2’3’-cgamp)2：[pt(dach)(fa)2]」[0024](4)sting激动剂复合物亲合常数测定[0025](a)仪器：等温滴定微量热仪microcalitc200(ge)[0026](b)实验条件参数：syringe转速1000rpm；仪器温度25℃；参比热量10μcal/s；第一滴样品0.4μl，此后每滴样品2μl，滴数位15滴；进样时间2s；平衡时间90s。[0027](c)样品准备：(1)sting激动剂cgamp(2mm)；(2)叶酸(20mm)；(3)环己二胺叶酸合铂(ii)配合物(20mm)。溶剂均为tris-hcl缓冲液ph8.0。[0028](d)实验步骤：用手动注射器分别吸取20mm叶酸溶液(300μl)(或环己二胺叶酸合铂(ii)配合物)，缓慢注入到itc样品池(cell)中(禁止产生气泡)，随后操作仪器，使进样(syringe)吸取2mmcgamp溶液，操作完成后将syringe与cell连接，实验参数设置完成后仪器开始滴定。[0029](e)实验数据分析：利用microcalitc200分析软件中的onesetofbindingsites模式拟合等温线并删除第一滴的滴定误差，数据处理完成后得到反应复合物亲和力的解离常数(kd＝1/k)。解离常数如下：复合物i(kd＝5.1μm)；复合物ii(kd＝4.3μm)。[0030]实施例2：采用荷瘤鼠模型进行检测新型sting激动剂复合物的抗肿瘤作用[0031]动物种属、品系、性别、体重、来源、合格证[0032]balb/c普通小鼠、c57bl/6普通小鼠，雄性，体重20－22g，7-8周龄，spf级，购于南方模式生物科技有限公司。[0033]饲养条件[0034]所有小鼠均自由觅食和饮水，在室温(23±2)℃下饲养。饲料及水均经高压灭菌处理，全部实验饲养过程为spf级。[0035]剂量设置[0036]尾静脉注射小鼠，sting激动剂复合物均设置1个剂量组：10mg/kg[0037]试验对照[0038]阴性对照：生理盐水溶液[0039]阳性对照：(1)cgamp，剂量10mg/kg；(2)叶酸，剂量10mg/kg[0040](2)环己二胺叶酸合铂(ii)金属配合物，剂量10mg/kg；[0041]给药方法[0042]给药途径：尾静脉注射给药[0043]给药体积：100微升/只[0044]给药次数：每天1次，连续21天[0045]每组动物数：10只[0046]肿瘤细胞株[0047]小鼠结直肠癌细胞株ct26，小鼠乳腺癌细胞株4t1，小鼠肺癌细胞株ll/2，均购自中国科学院细胞库。[0048]试验主要步骤[0049]肿瘤模型鼠的建立与干预[0050]细胞培养，传代，在细胞对数期收集细胞，做成浓度为(1.0×107)每毫升的细胞悬液，小鼠右前肢腋下注射0.2ml细胞悬液(细胞数目为2.0×106个/只)，8天左右致瘤成功，随机均分为6组。6组分别为a：阴性对照组(生理盐水组)、b：阳性对照cgamp组(10mg/kg)、c：叶酸对照组(10mg/kg)、d：环己二胺叶酸合铂(ii)金属配合物(10mg/kg)、e：复合物i(sting激动剂叶酸复合物)(10mg/kg)、f:复合物ii(sting激动剂叶酸铂配合物的复合物)(10mg/kg)。每天给药1次，连续给药21天。21天后，处死小鼠并称瘤体重量，抑瘤率＝[1-实验组平均瘤重(b、c、d、e、f组为实验组)/a组平均瘤重]]×100％。[0051]分别制备小鼠结直肠癌细胞株ct26，移植到balb/c普通小鼠，小鼠乳腺癌细胞株4t1，移植到balb/c普通小鼠,小鼠肺癌lewis瘤株ll/2，移植到c57bl/6小鼠，观察不同药物抗肿瘤效果。[0052]统计分析[0053]数据用x±s表示，利用spss10.0软件进行处理，采用单因素方差分析(one-wayanova)检验比较各组瘤重差异的显著性，显著性水平a＝0.05。[0054]实验结果[0055]小鼠皮下接种肿瘤细胞后制备成功皮下移植瘤模型，新型sting激动剂复合物复合物均可明显抑制肿瘤生长，给药21天后的瘤重均显著低于阴性对照组，新型sting激动剂复合物抑瘤效果均优于单独使用sting激动剂cgamp或环己二胺叶酸合铂(ii)金属配合物单独用药，表明新型sting激动剂复合物药物具有显著提高的抗肿瘤作用。具体结果见下表。[0056]表1.新型sting激动剂复合物对balb/c鼠结直肠癌细胞ct26皮下移植瘤的作用[0057](n＝10，mean±sd)[0058][0059]表2新型免疫激动剂复合物对小鼠肺癌lewis瘤株ll-2皮下移植瘤的抑制作用[0060](n＝10，mean±sd)[0061][0062]表3.新型免疫激动剂复合物对balb/c鼠乳腺癌4t1皮下移植瘤的抑制作用[0063](n＝10，mean±sd)[0064][0065]实施例3新型sting激动剂复合物抗小鼠乳腺癌4t1－luc肿瘤转移的作用[0066](n＝10，mean±sd)[0067]动物种属、品系、性别、体重、来源、合格证[0068]balb/c普通小鼠，雄性，体重20－22g，7-8周龄，spf级，购于南方模式生物科技有限公司。[0069]饲养条件[0070]所有小鼠均自由觅食和饮水，在室温(23±2)℃下饲养。饲料及水均经高压灭菌处理，全部实验饲养过程为spf级。[0071]剂量设置[0072]尾静脉注射小鼠，sting激动剂复合物均设置1个剂量组：10mg/kg[0073]试验对照[0074]阴性对照：生理盐水溶液[0075]阳性对照：(1)cgamp，剂量10mg/kg；(2)叶酸，剂量10mg/kg[0076](2)环己二胺叶酸合铂(ii)金属配合物，剂量10mg/kg；[0077]给药方法[0078]给药途径：尾静脉注射给药[0079]给药体积：100微升/只[0080]给药次数：每天1次，连续30天[0081]每组动物数：10只[0082]肿瘤细胞株[0083]小鼠乳腺癌细胞株4t1－luc(荧光素酶标记肿瘤细胞)，由浙江大学医学院赠送。4t1－luc小鼠乳腺癌细胞在balb/c小鼠中的生长与转移特性与人体中的乳腺癌十分相近。这种肿瘤是人vi期乳腺癌的动物模型。4t1－luc自发产生高转移肿瘤，可转移到肺，肝，淋巴结和大脑，同时在注射部位形成始发灶。荧光素酶(luciferase)是生物体内催化荧光素(luciferin)或脂肪醛(fireflyaldehyde)氧化发光的一类酶的总称，来自于自然界能够发光的生物。[0084]试验主要步骤[0085]1.肿瘤模型鼠的建立与干预[0086]细胞培养，传代，在细胞对数期收集细胞，做成浓度为(1.0×106)每毫升的细胞悬液，小鼠右前肢腋下注射0.2ml细胞悬液(细胞数目为2.0×105个/只)，接种乳腺癌细胞后第二天开始给药，每天一次，随机均分为6组。6组分别为a：阴性对照组(生理盐水组)、b：阳性对照cgamp组(10mg/kg)、c：叶酸组(10mg/kg)、d：环己二胺叶酸合铂(ii)金属配合物(10mg/kg)、e：复合物i(sting激动剂叶酸复合物)(10mg/kg)、f:复合物ii(sting激动剂叶酸铂配合物的复合物)(10mg/kg)。每天给药1次，连续给药30天。[0087]2、不同药物抗乳腺癌肿瘤转移检测方法[0088]小鼠乳腺癌肿瘤转移情况使用小动物活体光学成像系统(perkinelmer,ivisluminaxrmsseriesiii)检测(在复旦大学上海医学院完成)，分别在给药后的第5天、10天、30天检测。观察不同药物抗乳腺癌肿瘤转移的效果总结如下：[0089]表4、不同药物抗乳腺癌肿瘤转移随时间变化情况表[0090][0091]实验结果表明，新型sting激动剂复合物抗balb/c鼠乳腺癌4t1－luc肿瘤转移的作用显著优于单独使用sting激动剂及叶酸铂金属配合物。该类新型复合物药物具有抗肿瘤转移的潜在临床应用价值。[0092]实施例4新型sting激动剂复合物降低铂金属配合物的毒副作用[0093](n＝10，mean±sd)[0094]动物种属、品系、性别、体重、来源、合格证[0095]balb/c普通小鼠，雄性，体重20－22g，7-8周龄，spf级，购于南方模式生物科技有限公司。[0096]饲养条件[0097]所有小鼠均自由觅食和饮水，在室温(23±2)℃下饲养。饲料及水均经高压灭菌处理，全部实验饲养过程为spf级。[0098]剂量设置[0099]尾静脉注射小鼠，sting激动剂复合物均设置1个剂量组：10mg/kg[0100]试验对照[0101]阴性对照：生理盐水溶液[0102]阳性对照：(1)奥沙利铂5mg/kg；(2)环己二胺叶酸合铂(ii)金属配合物，剂量10mg/kg；[0103]给药方法[0104]给药途径：尾静脉注射给药[0105]给药体积：100微升/只[0106]给药次数：每天1次，连续21天[0107]每组动物数：10只[0108]小鼠随机均分为5组。5组分别为a：正常组；b，阴性对照组(生理盐水组)、c：阳性对照奥沙利铂组(5mg/kg)、d：环己二胺叶酸合铂(ii)金属配合物(10mg/kg)、e：复合物ii(sting激动剂叶酸铂配合物的复合物)(10mg/kg)。每天给药1次，连续给药21天。[0109]结果分析：[0110](1)新型复合物对小鼠体重和生存率的影响[0111]小鼠给药21天，小鼠体重下降百分数和生存率总结于表5.[0112]table5.小鼠体重下降百分数和生存率[0113]小鼠分组体重下降(％)生存率(％)a，正常鼠————b，生理盐水对照————c，奥沙利铂40(14天)0(14天全死亡)d，环己二胺叶酸合铂配合物2080e，复合物ii6100[0114]表5结果显示，新型免疫激动剂复合物(ii)显著降低了铂金属配合物的毒副作用。奥沙利铂给药组14天全部死亡，体重下降了40％；环己二胺叶酸合铂(ii)配合物比奥沙利铂毒性小很多，但是仍然具有明显毒副作用，小鼠体重下降了20％；新型复合物给药组生存率100％，体重基本没有明显变化。[0115](2)新型复合物对小鼠血液系统的影响[0116]在临床上，含有铂的药物，如oxaliplatin会产生患者血液系统损伤的毒副作用，呈现出贫血、血小板和中性粒细胞减少等症状。因此，在实验中，我们对新型复合物给药与阳性对照组(奥沙利铂和环己二胺叶酸合铂配合物组)的小鼠进行外周血的采集，用于血常规检测并与正常组对照，以此来评估药物对小鼠血液系统的影响。机体出现贫血症状体现在两方面：第一，红细胞数目(redbloodcells，rbc)减少；第二，血红蛋白(hemoglobin)含量降低。我们对实验各组的这两项指标进行了统计总结，见表6(table6)。[0117]table6.theroutinebloodtests[0118][0119]表6结果显示，阳性药oxaliplatin组的红细胞数目和血红蛋白含量分别与正常组比较明显低于正常值。环己二胺叶酸合铂配合物各组的红细胞数目和血红蛋白含量均比奥沙利铂组好，但是仍然在正常值边沿。新型复合物给药组的血液检测指标明显优于阳性对照组，血常规指标均在正常范围，与正常组数据一致。[0120](3)新型复合物对小鼠肝肾的影响[0121]我们对实验各组小鼠血清中丙氨酸氨基转移酶(alt)和肌酐(creatinine)含量进行了统计(table7)。数据显示，在肝功能指标上，与正常组相比，阳性药oxaliplatin组alt的含量明显超出了正常值，环己二胺叶酸合铂配合物给药组处在最高正常参考值的边缘。oxaliplatin组creatinine的含量明显偏高；环己二胺叶酸合铂配合物组与正常组含量略有偏高。新型复合物给药组与正常组含量基本一致，没有呈现明显的变化。根据实验结果，oxaliplatin对小鼠的肝脏和肾脏产生了损伤，环己二胺叶酸合铂配合物组的alt和creatinine指标均比奥沙利铂好很多，但仍然有些毒性影响。新型复合物对小鼠产生的肝肾副作用极小，免疫激动剂复合物显著降低了顺铂药物的毒副作用。[0122]table7.summaryofbiochemicalmarkersinserum[0123][0124]实施例5新型sting激动剂复合物的急性毒性研究[0125]实验材料[0126]icr小鼠20只(购于南方模式生物科技有限公司)，雌雄各半，体重18～22g，动物以颗粒饲料喂养，自由摄食和饮水。[0127]实验方法[0128]icr小鼠按体重分别单次尾静脉注射2g/kg的sting激动剂复合物(i，ii)药物，观察给药后小鼠14天内的毒性反应及死亡情况。结果发现，小鼠单次尾静脉注射给药后，小鼠活动正常。给药后14天内，小鼠未出现死亡，第15天，全部小鼠处死，解剖，肉眼检查各脏器，均未见明显病变。[0129]实验结果[0130]上述急性毒性实验结果表明，静脉注射给药最大耐受量mtd不低于2g/kg，说明新型sting激动剂复合物(i，ii)药物的急性毒性低。当前第1页12当前第1页12