云南娃儿藤的抗衰老新用途

1.本发明涉及医药领域，具体地涉及中草药云南娃儿藤的抗衰老新用途。


背景技术：

2.衰老是一个复杂和渐进的生物学过程，伴随着生物功能的受损、细胞或机体对代谢等应激反应能力的降低，并产生衰老相关疾病，如糖尿病、肿瘤、心血管疾病、神经退行性疾病、易跌倒等。在过去的几十年里，通过抗衰老药物延缓衰老、提高健康水平、降低衰老相关疾病发病率是最有效的干预措施。当前所报道的抗衰老分子大多为化学药物，以中草药为基础开发抗衰老药物具有广阔前景。
3.中草药作为中华民族的瑰宝，有着灿烂的文化背景，蕴含着深刻的健康养生理念，是千百年医疗实践的结晶。基于中草药库筛选和发现安全性高、活性好的抗衰老中草药，并进一步开发单一抗衰老中药、抗衰老植物提取物、抗衰老活性分子具有广阔前景和重要意义。
4.云南娃儿藤主要化学成分为娃儿藤生物碱，娃儿藤生物碱有显著地抑制肿瘤生长活性和抗炎、抗过敏、平喘作用。目前，未见其抗衰老报道。
5.因此本领域迫切需要开发一种能够有效抗衰老的中草药。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于开发一种能够有效抗衰老的中草药。具体地，本发明涉及中草药云南娃儿藤在制备抗衰老的药物或保健品中的应用。
7.在本发明的第一方面，提供了一种中草药云南娃儿藤的用途，用于制备一种组合物或制剂，所述组合物或制剂用于抗衰老。
8.在另一优选例中，所述组合物或制剂用于选自下组的一种或多种应用：
9.(i)延长线虫的寿命
10.(ii)提高机体的健康水平，或改善健康生理参数；
11.(iii)提高或改善身体摆动能力；
12.(iiii)延缓或逆转正常体细胞的衰老；
13.(iiiii)减少sa-β-gal表达量；
14.在另一优选例中，所述组合物或制剂还含有额外的抗衰老活性成分。
15.在另一优选例中，所述的组合物或制剂被施用于哺乳动物、或线虫。
16.在另一优选例中，所述的哺乳动物包括：灵长动物；更佳地所述的哺乳动物为人。
17.在另一优选例中，所述的抗衰老包括皮肤抗衰老。
18.在另一优选例中，所述组合物为药物组合物、化妆品组合物、膳食补充剂、食品组合物、保健品组合物。
19.在另一优选例中，所述组合物或制剂含有：
20.(a)云南娃儿藤全株、地上部分、地下部分、根、茎、叶、花的水提取物或有机溶剂提
取物作为活性成分；
21.(b)药学上可接受的载体或赋形剂。
22.在另一优选例中，所述有机溶剂选自下组：乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇或其组合。
23.在另一优选例中，所述组合物或制剂含有以云南娃儿藤全株、地上部分、地下部分、根、茎、叶、花的水提取物或有机溶剂提取物经制备分离得到的某段或某几段组分作为活性成分。
24.在另一优选例中，所述药物组合物为注射用药或口服药物。
25.在另一优选例中，所述药物组合物的剂型选自下组：片剂、胶囊剂、颗粒剂、混悬剂、丸剂、溶液剂、糖浆剂、注射剂、或其组合。
26.在本发明的第二方面，提供了一种化妆品组合物或产品，所述化妆品组合物或产品含有云南娃儿藤全株、地上部分、地下部分、根、茎、叶、花的水提取物或有机溶剂提取物作为抗衰老的有效成分。
27.在本发明的第三方面，提供了一种用于抗衰老的药物组合物，所述的药物组合物含有：
28.(a1)云南娃儿藤全株、地上部分、地下部分、根、茎、叶、花的水提取物或有机溶剂提取物作为活性成分；
29.(a2)额外的抗衰老活成分，所述的额外抗衰老活成分选自下组：二甲双胍、白藜芦醇、雷帕霉素、阿卡波糖、达沙替尼、槲皮素、姜黄素、虾青素、熊果苷；
30.(b)药学上可接受的载体或赋形剂。
31.在本发明的第四方面，提供了一种抗衰老方法，给需要的对象施用云南娃儿藤全株、地上部分、地下部分、根、茎、叶、花的水提取物或有机溶剂提取物作为抗衰老活性成分。
32.应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
33.图1显示了在实施例6、7、8、9、10中，云南娃儿藤地下部分石油醚提取物的分离制备色谱图。
34.图2显示了在实施例6中，云南娃儿藤地下部分石油醚提取物fr.1的色谱图。
35.图3显示了在实施例7中，云南娃儿藤地下部分石油醚提取物fr.2的色谱图。
36.图4显示了在实施例8中，云南娃儿藤地下部分石油醚提取物fr.3的色谱图。
37.图5显示了在实施例9中，云南娃儿藤地下部分石油醚提取物fr.4的色谱图。
38.图6显示了在实施例10中，云南娃儿藤地下部分石油醚提取物fr.5的色谱图。
39.图7显示了在实施例11中，云南娃儿藤全株75％乙醇提取物(200μg/ml)显著性延长线虫寿命(****p《0.0001)。
40.图8显示了在实施例12中，云南娃儿藤全株75％乙醇提取物(200μg/ml)提高线虫的身体摆动能力(第八天，****p《0.0001)。
41.图9显示了在实施例13中，云南娃儿藤地上部分75％乙醇提取物(200μg/ml,400μ
g/ml)显著性延长线虫寿命(****p《0.0001,*p《0.05)。
42.图10显示了在实施例14中，云南娃儿藤地上部分石油醚提取物(200μg/ml,400μg/ml)显著性延长线虫寿命(****p《0.0001,*p《0.05)。
43.图11显示了在实施例15中，云南娃儿藤地上部分乙酸乙酯提取物(200μg/ml,)显著性延长线虫寿命(**p《0.01)。
44.图12显示了在实施例16中，云南娃儿藤地上部分水提取物(200μg/ml,)显著性延长线虫寿命(**p《0.01)。
45.图13显示了在实施例17中，云南娃儿藤地下部分75％乙醇提取物(200μg/ml,400μg/ml)显著性延长线虫寿命(****p《0.0001,*p《0.05)。
46.图14显示了在实施例18中，云南娃儿藤地下部分石油醚提取物(200μg/ml,400μg/ml)显著性延长线虫寿命(p＝0.0543,****p《0.0001)。
47.图15显示了在实施例19中，云南娃儿藤地下部分石油醚提取物(400μg/ml)显著性提高线虫身体摆动能力，(第16天，***p《0.001)。
48.图16显示了在实施例20中，云南娃儿藤地下部分石油醚提取物(0.5μg/ml，1μg/ml)显著性降低人胚肺细胞(mrc-5)的衰老率(*p《0.05，**p《0.01)，阳性药二甲双胍(100μm)显著性降低细胞的衰老率(**p《0.01)
49.图17显示了在实施例21中，云南娃儿藤地下部分正丁醇提取物(200μg/ml,)显著性延长线虫寿命(*p《0.05)。
50.图18显示了在实施例22中，云南娃儿藤地下部分水提取物(200μg/ml,)显著性延长线虫寿命(***p《0.001)。
51.图19显示了在实施例23中，云南娃儿藤地下部分石油醚提取物fr.1(200μg/ml,)显著性延长线虫寿命(****p《0.0001)。
52.图20显示了在实施例24中，云南娃儿藤地下部分石油醚提取物fr.2(50μg/ml,)显著性延长线虫寿命(**p《0.01)。
53.图21显示了在实施例25中，云南娃儿藤地下部分石油醚提取物fr.3(200μg/ml,)显著性延长线虫寿命(**p《0.01)。
54.图22显示了在实施例26中，云南娃儿藤地下部分石油醚提取物fr.4(200μg/ml,)显著性延长线虫寿命(***p《0.001)。
55.图23显示了在实施例27中，云南娃儿藤地下部分石油醚提取物fr.5(200μg/ml,400μg/ml)显著性延长线虫寿命(****p《0.0001,**p《0.01)。
具体实施方式
56.本发明人经过广泛而深入地研究，首次意外发现云南娃儿藤具有抗衰老的作用，在此基础上完成了本发明。
57.具体地，本发明发现云南娃儿藤的全株经过75％乙醇提取、地上部分过75％乙醇、石油醚、乙酸乙酯、水提取，地下部分经75％乙醇、石油醚、正丁醇、水提取的提取物可以有效的延长寿命。并且，云南娃儿藤全株75％乙醇提取物可以提高身体摆动能力。因此娃儿藤提取物可以被用于制备抗衰老的药物或保健品。
58.术语
59.云南娃儿藤
60.云南娃儿藤(tylophora yunnanensis schltr.)为萝藦科娃儿藤属植物，又名野辣椒、金线包、小白薇、白龙须、老妈妈针线包、野辣子、水辣子、蛇辣子、山辣子。主要产于云南、贵州和四川，云南分布较为广泛，在大理、楚雄、昆明等均有分布。生长于海拔2000米以下山坡、向阳旷野及草地上。花期5-8月，果期8-11月。研究表明云南娃儿藤主要化学成分为娃儿藤生物碱，已经分离得到异去羟基娃儿藤宁、新白前酮、新白前醇、香荚兰酸、没食子酸、阿魏酸、β-甾醇、胡萝卜苷等。在云南民间，根可药用，具有消炎解毒、退热截疟、祛风湿的功效；种毛外用可止血。
61.衰老和抗衰老
62.如本文所用，“衰老(aging)”指随时间增加，有机体在构成物质、组织结构、生理功能等方面发生的丧失和退化过程。在本发明中，衰老指生物学衰老。
63.如本文所用，“抗衰老”是指延缓、阻滞、减少、停止和/或逆转衰老效果或进程。
64.细胞衰老是这样的现象，其导致单独细胞无法持续分裂，使其在数次分裂之后停滞。为了检测细胞衰老，一般使用细胞染色测试，其检测衰老相关的标志物(如β-半乳糖苷酶活性)。衰老的细胞可以干扰整个有机体的重要功能和从而导致某些障碍。整个有机体的衰老伴随着某些障碍(比如疾病、并发症和症状)增加的风险。
65.一些代表性的衰老细胞标记物或标志包括(但并不限于)：sa-β-半乳糖苷酶(其表达量上升提示衰老程度增加)、细胞增殖能力(其下降提示衰老程度增加)。
66.秀丽隐杆线虫
67.本发明实施例所用的线虫为秀丽隐杆线虫，这是一种经典的模式生物，具有生命周期短、易于观察、遗传背景清晰等特点。除此之外，线虫基因与人类很多重要功能基因高度同源并且具有相似的信号传导通路，使其在病理学研究、新靶点发现以及药物筛选中受到越来越多的关注。
68.秀丽隐杆线虫是抗衰老研究的重要模式生物之一，已被用于抗衰老物质的筛选和抗衰老的机理研究。
69.药物组合物及施用方法
70.本发明还提供了含有云南娃儿藤的组合物或制剂或产品，所述组合物或制剂或产品可用于抗衰老。代表性的组合物或制剂或产品包括抗衰老的药物、保健品、和化妆品。
71.一种优选的组合物是药物组合物，它含有有效量的云南娃儿藤或其提取物和药学上可接受的载体。
72.如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性(即抗衰老功能)的且可被人和/或动物所接受的量。
73.如本文所用，术语“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。
74.本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明的活性成分以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物的剂型为注射剂、口服制剂(片剂、胶囊、口服液)、透皮剂、缓释剂。例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方
法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。
75.本发明所述的活性成分的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的活性成分的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常，当本发明的活性成分每天以约1mg-5g/kg动物体重(较佳的1mg-1g/kg动物体重)的剂量给予，能得到令人满意的效果。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。
76.典型地，当以口服方式给予云南娃儿藤时，一个60kg体重的对象(人)，日平均剂量通常为10-500mg，较佳地20-300mg，更佳地50-250mg。所述日剂量可以分一次、二次或多次服用。
77.本发明所述的药学上可接受的载体包括(但不限于)：水、盐水、脂质体、脂质、肽类物质、纤维素、纳米凝胶、或其组合。载体的选择应与给药方式相匹配，这些都是本领域的普通技术人员所熟知的。
78.本发明的主要优点在于：
79.(a)首次发现了云南娃儿藤可有效抗衰老，其中云南娃儿藤地上部分75％乙醇提取物在200μg/ml的浓度下甚至可以延长线虫的寿命达36.62％。
80.(b)首次发现了云南娃儿藤全株75％乙醇提取物可以提高线虫的身体摆动能力。
81.(c)首次发现了云南娃儿藤地下部分石油醚提取物可以提高线虫的身体摆动能力。
82.(d)首次发现了云南娃儿藤地下部分石油醚提取物可以降低哺乳动物细胞衰老率。
83.(e)用水以及各种其他有机溶剂提取的云南娃儿藤提取物均能够有效延长线虫寿命，这表明云南娃儿藤的应用条件简单，具有广泛的药用价值。
84.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(new york:cold spring harbor laboratory press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
85.实施例1：云南娃儿藤全株75％乙醇提取物的制备
86.将云南娃儿藤植物全株自然阴干，称取91.5g，粉碎到30目，用75％乙醇在95℃条件下回流提3次，每次2h，提取液合并，减压浓缩提取液得浸膏20.5g，计算得率为22.4％。
87.实施例2：云南娃儿藤地上部分75％乙醇提取物的制备
88.将云南娃儿藤植物全株自然阴干，取地上部分305g，粉碎到30目，用75％乙醇在超声辅助条件下提取3次，提取时间分别为30min、30min、1h，提取液合并，减压浓缩提取液得浸膏37.4g，计算得率为12.2％。
89.实施例3：云南娃儿藤地上部分石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取物及萃余水相的制备
90.将实施例2中所得浸膏用蒸馏水分散后，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，各
萃取5次，每次4h；分别得石油醚部位1.8g(萃取率5.4％)、乙酸乙酯部位3.9g(萃取率11.9％)、正丁醇部位9.5g(萃取率27.5％)和萃余水相17.2g。
91.实施例4：云南娃儿藤地下部分75％乙醇提取物的制备
92.将云南娃儿藤植物全株自然阴干，取地上部分307g，粉碎到30目，用75％乙醇在超声辅助条件下提取3次，提取时间分别为30min、30min、1h，提取液合并，减压浓缩提取液得浸膏32.0g，计算得率为10.4％。
93.实施例5：云南娃儿藤地下部分石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取物及萃余水相的制备
94.将实施例4中所得浸膏用蒸馏水分散后，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，各萃取5次，每次4h；分别得石油醚部位1.4g(萃取率4.4％)、乙酸乙酯部位3.5g(萃取率11.1％)、正丁醇部位6.8g(萃取率21.4％)和萃余水相16.8g。
95.实施例6云南娃儿藤地下部分石油醚提取物fr.1的分离制备
96.取0.9g云南娃儿藤地下部分石油醚提取物，使用waters 2767自动纯化系统和unitray c18(250
×
20mm i.d.,10.0μm,华谱新创科技有限公司)，在0-10min 10％乙腈，10-20min 30％乙腈，20-40min 90％乙腈，流速20ml/min，检测波长254nm的色谱条件下，进行分离制备，如图1所示。取0-10min段出峰样品为云南娃儿藤地下部分石油醚提取物fr.1，浓缩后得22mg样品。采用waters alliance 2695高效液相色谱和unitray c18(150
×
4.6mm i.d.,5.0μm,华谱新创科技有限公司)，在0-30min 10-90％乙腈，30-40min 90％乙腈，流速1ml/min，检测波长254nm的色谱条件下，对云南娃儿藤地下部分石油醚提取物fr.1进行分析，谱图如图2所示。
97.实施例7云南娃儿藤地下部分石油醚提取物fr.2的分离制备
98.取0.9g云南娃儿藤地下部分石油醚提取物，使用waters 2767自动纯化系统和unitray c18(250
×
20mm i.d.,10.0μm,华谱新创科技有限公司)，在0-10min 10％乙腈，10-20min 30％乙腈，20-40min 90％乙腈，流速20ml/min，检测波长254nm的条件下，进行分离制备，如图1所示。取10-14min段样品为云南娃儿藤地下部分石油醚提取物fr.2，浓缩后得1.7mg样品。采用waters alliance 2695高效液相色谱和unitray c18(150
×
4.6mm i.d.,5.0μm,华谱新创科技有限公司)，在0-30min 10-90％乙腈，30-40min 90％乙腈，流速1ml/min，检测波长254nm的色谱条件下，对云南娃儿藤地下部分石油醚提取物fr.2进行分析，谱图如图3所示。
99.实施例8云南娃儿藤地下部分石油醚提取物fr.3的分离制备
100.取0.9g云南娃儿藤地下部分石油醚提取物，使用waters 2767自动纯化系统和unitray c18(250
×
20mm i.d.,10.0μm,华谱新创科技有限公司)，在0-10min 10％乙腈，10-20min 30％乙腈，20-40min 90％乙腈，流速20ml/min，检测波长254nm的条件下，进行分离制备，如图1所示。取14-20min段样品为云南娃儿藤地下部分石油醚提取物fr.3，浓缩后得18.8mg样品。采用waters alliance 2695高效液相色谱和unitray c18(150
×
4.6mm i.d.,5.0μm,华谱新创科技有限公司)，在0-30min 10-90％乙腈，30-40min 90％乙腈，流速1ml/min，检测波长254nm的色谱条件下，对云南娃儿藤地下部分石油醚提取物fr.3进行分析，谱图如图4所示。
101.实施例9云南娃儿藤地下部分石油醚提取物fr.4的分离制备
102.取0.9g云南娃儿藤地下部分石油醚提取物，使用waters 2767自动纯化系统和unitray c18(250
×
20mm i.d.,10.0μm,华谱新创科技有限公司)，在0-10min 10％乙腈，10-20min 30％乙腈，20-40min 90％乙腈，流速20ml/min，检测波长254nm的条件下，进行分离制备，如图1所示。取20-23min段样品为云南娃儿藤地下部分石油醚提取物fr.4，浓缩后得9.5mg样品。采用waters alliance 2695高效液相色谱和unitray c18(150
×
4.6mm i.d.,5.0μm,华谱新创科技有限公司)，在0-30min 10-90％乙腈，30-40min 90％乙腈，流速1ml/min，检测波长254nm的色谱条件下，对云南娃儿藤地下部分石油醚提取物fr.4进行分析，谱图如图5所示。
103.实施例10云南娃儿藤地下部分石油醚提取物fr.5的分离制备
104.取0.9g云南娃儿藤地下部分石油醚提取物，使用waters 2767自动纯化系统和unitray c18(250
×
20mm i.d.,10.0μm,华谱新创科技有限公司)，在0-10min 10％乙腈，10-20min 30％乙腈，20-40min 90％乙腈，流速20ml/min，检测波长254nm的条件下，进行分离制备，如图1所示。取23-40min段样品为云南娃儿藤地下部分石油醚提取物fr.5，浓缩后得205mg样品。采用waters alliance 2695高效液相色谱和unitray c18(150
×
4.6mm i.d.,5.0μm,华谱新创科技有限公司)，在0-30min 10-90％乙腈，30-40min 90％乙腈，流速1ml/min，检测波长254nm的色谱条件下，对云南娃儿藤地下部分石油醚提取物fr.5进行分析，谱图如图6所示。
105.实施例11云南娃儿藤全株75％乙醇提取物的线虫寿命实验
106.野生型秀丽隐杆线虫(n2)购自caenorhabditis genetics center(cgc)。同步化后的线虫在l4期转移至空白对照组和云南娃儿藤全株75％乙醇提取物处理组(200μg/ml)的线虫生长培养基(ngm)上，每组约90条线虫，每3天更换一次培养基，于20℃条件下培养。每天记录存活线虫数量，将死亡的线虫移出培养皿，直至线虫全部死亡。汇总数据，用graph pad绘制生存曲线，并计算显著性差异(log-rank test)。
107.寿命实验数据如表1所示，生存曲线如图7所示，云南娃儿藤全株75％乙醇提取物在200μg/ml下显著性延长线虫寿命，与对照组相比，延长线虫寿命22.49％，****表示p《0.0001。
108.表1.云南娃儿藤全株75％乙醇提取物线虫寿命实验数据
[0109][0110]
实施例12云南娃儿藤全株75％乙醇提取物的线虫摆动实验
[0111]
为进一步评价云南娃儿藤全株75％乙醇提取物对线虫健康参数的影响，我们对线虫的身体摆动能力进行测试。依照线虫寿命实验的方法培养线虫，在线虫成年的第3，8，13天，对照组和云南娃儿藤全株75％乙醇提取物组(200μg/ml)分别挑20至30条线虫，分别记录每条线虫30秒在缓冲溶液(m9)中的身体摆动次数。实验结束后，统计数据，用graph pad
计算显著性差异(two-way anova,sidak multiple comparisons test)，误差棒标识的是平均数标准误差(sem)。
[0112]
实验结果如图8所示，云南娃儿藤全株75％乙醇提取物提高线虫的身体摆动能力，在第8天有显著性差异，****表示p《0.0001。
[0113]
实施例13云南娃儿藤地上部分75％乙醇提取物的线虫寿命实验
[0114]
同步化后的线虫在l4期转移至空白对照组和云南娃儿藤地上部分75％乙醇提取物处理组(200μg/ml,400μg/ml)的线虫生长培养基(ngm)上，每3天更换一次培养基，于20℃条件下培养。每天记录存活线虫数量，将死亡的线虫移出培养皿，直至线虫全部死亡。汇总数据，用graph pad绘制生存曲线，并计算显著性差异(log-rank test)。
[0115]
寿命实验数据如表2所示，生存曲线如图9所示，云南娃儿藤地上部分75％乙醇提取物在200μg/ml下显著性延长线虫寿命，与对照组相比，延长线虫寿命36.62％，****表示p《0.0001；在400μg/ml下显著性延长线虫寿命，与对照组相比，延长线虫寿命8.43％，*表示p《0.05。
[0116]
表2.云南娃儿藤地上、地下部分不同溶媒提取物线虫寿命实验数据
[0117][0118]
实施例14云南娃儿藤地上部分石油醚提取物的线虫寿命实验
[0119]
同步化后的线虫在l4期转移至空白对照组和云南娃儿藤地上部分石油醚提取物处理组(200μg/ml,400μg/ml)的线虫生长培养基(ngm)上，每3天更换一次培养基，于20℃条件下培养。每天记录存活线虫数量，将死亡的线虫移出培养皿，直至线虫全部死亡。汇总数据，用graph pad绘制生存曲线，并计算显著性差异(log-rank test)。
[0120]
寿命实验数据如表2所示，生存曲线如图10所示，云南娃儿藤地上部分石油醚提取
物在200μg/ml下显著性延长线虫寿命，与对照组相比，延长线虫寿命16.35％，****表示p《0.0001；在400μg/ml下显著性延长线虫寿命，与对照组相比，延长线虫寿命12.67％，*表示p《0.05。
[0121]
实施例15云南娃儿藤地上部分乙酸乙酯提取物的线虫寿命实验
[0122]
同步化后的线虫在l4期转移至空白对照组和云南娃儿藤地上部分乙酸乙酯提取物处理组(200μg/ml)的线虫生长培养基(ngm)上，每3天更换一次培养基，于20℃条件下培养。每天记录存活线虫数量，将死亡的线虫移出培养皿，直至线虫全部死亡。汇总数据，用graph pad绘制生存曲线，并计算显著性差异(log-rank test)。
[0123]
寿命实验数据如表2所示，生存曲线如图11所示，云南娃儿藤地上部分乙酸乙酯提取物在200μg/ml下显著性延长线虫寿命，与对照组相比，延长线虫寿命11.92％，**表示p《0.01。
[0124]
实施例16云南娃儿藤地上部分水提取物的线虫寿命实验
[0125]
同步化后的线虫在l4期转移至空白对照组和云南娃儿藤地上部分水提取物处理组(200μg/ml)的线虫生长培养基(ngm)上，每3天更换一次培养基，于20℃条件下培养。每天记录存活线虫数量，将死亡的线虫移出培养皿，直至线虫全部死亡。汇总数据，用graph pad绘制生存曲线，并计算显著性差异(log-rank test)。
[0126]
寿命实验数据如表2所示，生存曲线如图12所示，云南娃儿藤地上部分水提取物在200μg/ml下显著性延长线虫寿命，与对照组相比，延长线虫寿命12.71％，**表示p《0.01。
[0127]
实施例17云南娃儿藤地下部分75％乙醇提取物的线虫寿命实验
[0128]
同步化后的线虫在l4期转移至空白对照组和云南娃儿藤地下部分75％乙醇提取物处理组(200μg/ml,400μg/ml)的线虫生长培养基(ngm)上，每3天更换一次培养基，于20℃条件下培养。每天记录存活线虫数量，将死亡的线虫移出培养皿，直至线虫全部死亡。汇总数据，用graph pad绘制生存曲线，并计算显著性差异(log-rank test)。
[0129]
寿命实验数据如表2所示，生存曲线如图13所示，云南娃儿藤地下部分75％乙醇提取物在200μg/ml下显著性延长线虫寿命，与对照组相比，延长线虫寿命20.22％，****表示p《0.0001；在400μg/ml下显著性延长线虫寿命，与对照组相比，延长线虫寿命10.46％，*表示p《0.05。
[0130]
实施例18云南娃儿藤地下部分石油醚提取物的线虫寿命实验
[0131]
同步化后的线虫在l4期转移至空白对照组和云南娃儿藤地下部分石油醚提取物处理组(200μg/ml,400μg/ml)的线虫生长培养基(ngm)上，每3天更换一次培养基，于20℃条件下培养。每天记录存活线虫数量，将死亡的线虫移出培养皿，直至线虫全部死亡。汇总数据，用graph pad绘制生存曲线，并计算显著性差异(log-rank test)。
[0132]
寿命实验数据如表2所示，生存曲线如图14所示，云南娃儿藤地下部分石油醚提取物在200μg/ml下延长线虫寿命，与对照组相比，延长线虫寿命7.28％，；在400μg/ml下显著性延长线虫寿命，与对照组相比，延长线虫寿命24.76％，****表示p《0.0001。
[0133]
实施例19云南娃儿藤地下部分石油醚提取物的身体摆动实验
[0134]
为进一步评价云南娃儿藤地下部分石油醚提取物对线虫健康参数的影响，我们对线虫的身体摆动能力进行测试。依照线虫寿命实验的方法培养线虫，在线虫成年的第4，10，16天，对照组和云南娃儿藤地下部分石油醚提取物组(400μg/ml)分别挑15条线虫，分别记
录每条线虫30秒在缓冲溶液(m9)中的身体摆动次数。实验结束后，统计数据，用graph pad计算显著性差异(two-way anova,sidak multiple comparisons test)，误差棒标识的是平均数标准误差(sem)。
[0135]
实验结果如图15所示，云南娃儿藤地下部分石油醚提取物提高线虫的身体摆动能力，在第16天有显著性差异，***表示p《0.001。
[0136]
实施例20云南娃儿藤地下部分石油醚提取物的sa-β-gal染色实验
[0137]
绝大多数正常细胞被认为仅有有限的分裂能力，在不能分裂后就进入衰老状态，衰老细胞通常体积变大，并且有高活性的β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)，可用细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒(碧云天)对β-gal进行染色，评价细胞衰老程度。在本实施例中，以sa-β-gal作为衰老细胞标志物，用化学试剂x-gal对其染色，使其呈蓝绿色。
[0138]
将人胚肺细胞(mrc-5，采购于中科院细胞库)在mem培养基中(含10％fbs，1％丙酮酸钠，1％非必需氨基酸，1％双抗)培养。经培养至第28代(p28)，经预实验检测细胞衰老程度，细胞衰老率在60％左右可进行实验。实验设置对照组、云南娃儿藤地下部分石油醚提取物组(0.5μg/ml，1μg/ml)和二甲双胍组(100μm，阳性药组)，药物与细胞共孵育2天，可用β-半乳糖苷酶染色试剂盒对细胞进行染色，还需用dapi(sigma)对细胞核进行染色，统计衰老细胞个数与总细胞数，计算细胞衰老率。用graph pad计算显著性差异(unpaired t-test)，误差棒标识的是平均数标准误差(sem)。
[0139]
实验结果如图16所示。与对照组相比，云南娃儿藤地下部分石油醚提取物(0.5μg/ml，1μg/ml)显著性降低细胞的衰老率(*p《0.05，**p《0.01)，阳性药二甲双胍(100μm)显著性降低细胞的衰老率(**p《0.01)。
[0140]
实施例21云南娃儿藤地下部分正丁醇提取物的线虫寿命实验
[0141]
同步化后的线虫在l4期转移至空白对照组和云南娃儿藤地下部分正丁醇提取物处理组(200μg/ml)的线虫生长培养基(ngm)上，每3天更换一次培养基，于20℃条件下培养。每天记录存活线虫数量，将死亡的线虫移出培养皿，直至线虫全部死亡。汇总数据，用graph pad绘制生存曲线，并计算显著性差异(log-rank test)。
[0142]
寿命实验数据如表2所示，生存曲线如图17所示，云南娃儿藤地下部分正丁醇提取物在200μg/ml下显著性延长线虫寿命，与对照组相比，延长线虫寿命6.62％，*表示p《0.05。
[0143]
实施例22云南娃儿藤地下部分水提取物的线虫寿命实验
[0144]
同步化后的线虫在l4期转移至空白对照组和云南娃儿藤地下部分水提取物处理组(200μg/ml)的线虫生长培养基(ngm)上，每3天更换一次培养基，于20℃条件下培养。每天记录存活线虫数量，将死亡的线虫移出培养皿，直至线虫全部死亡。汇总数据，用graph pad绘制生存曲线，并计算显著性差异(log-rank test)。
[0145]
寿命实验数据如表2所示，生存曲线如图18所示，云南娃儿藤地下部分水提取物在200μg/ml下显著性延长线虫寿命，与对照组相比，延长线虫寿命15.62％，***表示p《0.001。
[0146]
实施例23云南娃儿藤地下部分石油醚提取物fr.1的线虫寿命实验
[0147]
同步化后的线虫在l4期转移至空白对照组和云南娃儿藤地下部分石油醚提取物fr.1处理组(200μg/ml)的线虫生长培养基(ngm)上，每3天更换一次培养基，于20℃条件下培养。每天记录存活线虫数量，将死亡的线虫移出培养皿，直至线虫全部死亡。汇总数据，用graph pad绘制生存曲线，并计算显著性差异(log-rank test)。
[0148]
寿命实验数据如表3所示，生存曲线如图19所示，云南娃儿藤地下部分石油醚提取物fr.1在200μg/ml下显著性延长线虫寿命，与对照组相比，延长线虫寿命24.02％，****表示p《0.0001。
[0149]
表3.云南娃儿藤地下石油醚提取物fr.1～5线虫寿命实验数据
[0150][0151]
实施例24云南娃儿藤地下部分石油醚提取物fr.2的线虫寿命实验
[0152]
同步化后的线虫在l4期转移至空白对照组和云南娃儿藤地下部分石油醚提取物fr.2处理组(50μg/ml)的线虫生长培养基(ngm)上，每3天更换一次培养基，于20℃条件下培养。每天记录存活线虫数量，将死亡的线虫移出培养皿，直至线虫全部死亡。汇总数据，用graph pad绘制生存曲线，并计算显著性差异(log-rank test)。
[0153]
寿命实验数据如表3所示，生存曲线如图20所示，云南娃儿藤地下部分石油醚提取物fr.2在50μg/ml下显著性延长线虫寿命，与对照组相比，延长线虫寿命16.57％，**表示p《0.01。
[0154]
实施例25云南娃儿藤地下部分石油醚提取物fr.3的线虫寿命实验
[0155]
同步化后的线虫在l4期转移至空白对照组和云南娃儿藤地下部分石油醚提取物fr.3处理组(200μg/ml)的线虫生长培养基(ngm)上，每3天更换一次培养基，于20℃条件下培养。每天记录存活线虫数量，将死亡的线虫移出培养皿，直至线虫全部死亡。汇总数据，用graph pad绘制生存曲线，并计算显著性差异(log-rank test)。
[0156]
寿命实验数据如表3所示，生存曲线如图21所示，云南娃儿藤地下部分石油醚提取物fr.3在200μg/ml下显著性延长线虫寿命，与对照组相比，延长线虫寿命15.30％，**表示p《0.01。
[0157]
实施例26云南娃儿藤地下部分石油醚提取物fr.4的线虫寿命实验
[0158]
同步化后的线虫在l4期转移至空白对照组和云南娃儿藤地下部分石油醚提取物fr.4处理组(200μg/ml)的线虫生长培养基(ngm)上，每3天更换一次培养基，于20℃条件下培养。每天记录存活线虫数量，将死亡的线虫移出培养皿，直至线虫全部死亡。汇总数据，用
graph pad绘制生存曲线，并计算显著性差异(log-rank test)。
[0159]
寿命实验数据如表3所示，生存曲线如图22所示，云南娃儿藤地下部分石油醚提取物fr.4在200μg/ml下显著性延长线虫寿命，与对照组相比，延长线虫寿命16.27％，***表示p《0.001。
[0160]
实施例27云南娃儿藤地下部分石油醚提取物fr.5的线虫寿命实验
[0161]
同步化后的线虫在l4期转移至空白对照组和云南娃儿藤地下部分石油醚提取物fr.5处理组(200μg/ml,400μg/ml)的线虫生长培养基(ngm)上，每3天更换一次培养基，于20℃条件下培养。每天记录存活线虫数量，将死亡的线虫移出培养皿，直至线虫全部死亡。汇总数据，用graph pad绘制生存曲线，并计算显著性差异(log-rank test)。
[0162]
寿命实验数据如表3所示，生存曲线如图23所示，云南娃儿藤地下部分石油醚提取物fr.5在200μg/ml下显著性延长线虫寿命，与对照组相比，延长线虫寿命19.05％，****表示p《0.0001；在400μg/ml下显著性延长线虫寿命，与对照组相比，延长线虫寿命13.15％，**表示p《0.01。
[0163]
综上所述，本发明经线虫寿命实验，结果表明，本发明所述的云南娃儿藤全株75％乙醇提取物、云南娃儿藤地上部分75％乙醇提取物、云南娃儿藤地上部分石油醚提取物、云南娃儿藤地上部分乙酸乙酯提取物、云南娃儿藤地上部分水提取物、云南娃儿藤地下部分75％乙醇提取物、云南娃儿藤地下部分石油醚提取物、云南娃儿藤地下部分正丁醇提取物、云南娃儿藤地下部分水提取物能显著性延长线虫的寿命；本发明经健康参数评价实验证实，云南娃儿藤全株75％乙醇提取物可提高线虫身体摆动能力。所以，云南娃儿藤在抗衰老领域具有高度利用价值。
[0164]
在本发明提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。