一种用于治疗化疗诱发的外周神经病变的组合物及其应用的制作方法

1.本发明属于医药领域，具体涉及一种用于治疗化疗诱发的外周神经病变的组合物及其应用。


背景技术：

2.肿瘤是一个严重危害人类健康的疾病，它的治疗是非常困难的。虽然有一些靶向性药物的治疗，但是化疗仍然是治疗恶性肿瘤最常用的手段之一。令人遗憾的是，化疗往往会带来严重的副作用，比如疼痛、呕吐、头晕和脱发。尤其是疼痛，会让病人变得更加焦虑甚至抑郁，这会严重影响病人的精神状态，最终妨碍肿瘤的治疗。在肿瘤的副作用中，化疗导致的外周围神经病变(chemotherapy
‑
induced peripheral neuropathy，cipn)是一种令人非常痛苦的反应，主要表现为感觉异常，尤其是产生冷触觉超敏和机械学超敏这类疼痛，并且这种疼痛的感觉有时候十分强烈以至于化疗病人不得不降低化疗药物的剂量来缓解疼痛，严重妨碍了化疗的治疗效果。有报道称，大约有30％～40％的病人会出现cipn，因此探讨cipn的相关机制及治疗措施具有重要的临床价值和社会意义。
3.现有的研究治疗cipn的药物主要是对针神经保护和缓解疼痛症状，“治标不治本”，如神经保护性药物有谷胱甘肽、钙和镁、维生素b、维生素e、乙酰左旋肉碱等，可减轻神经损伤，改善感觉异常的症状；神经性疼痛对症治疗药物包括三环类抗抑郁药物、5
‑
ht和去甲肾上腺素再摄取抑制剂(snri)、抗癫痫药物等，长期使用此类药物会出现胃肠道不良反应，如恶心、口干、便秘，心血管不良反应(如体位性低血压)，中枢神经系统毒性(如失眠、焦虑、头痛)等。根据美国临床肿瘤学会最新指南(asco2020)，由于缺乏高质量的、一致性证据，不推荐使用任何药物用于化疗引起的外周神经病变的预防，对于因cipn导致疼痛的患者，临床医生可使用度洛西汀治疗，其推荐证据质量为中等，推荐强度为中等。因此到目前为止，还没有明确有效的方法来防止cipn，降低化疗药物使用剂量、终止化疗药物的使用仍是目前治疗cipn的主要方法。由于cipn的机制复杂以及现存治疗药物的局限性，寻找新的治疗药物成为了临床上亟待解决的问题。


技术实现要素：

4.为了解决上述问题，本发明提供了一种用于治疗化疗诱发的外周神经病变的组合物及其应用。本发明的组合物治疗cipn的效果良好，且组合物的成分为天然成分，安全无毒副作用。
5.为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
6.本发明提供了一种用于治疗化疗诱发的外周神经病变的组合物，包括人参皂苷rg1和岩藻多糖。
7.优选的，所述人参皂苷rg1和岩藻多糖的质量比为1:1～1:5。
8.本发明提供了上述技术方案中的组合物在制备治疗化疗诱发的外周神经病变的药物中的应用。
9.本发明提供了上述技术方案中的组合物在制备改善微循环障碍的药物中的应用。
10.本发明提供了上述技术方案中的组合物在制备降低组织因子的表达的药物中的应用。
11.本发明提供了上述技术方案中的组合物在制备抑制化疗诱发的外周神经病变的坐骨神经炎症因子的表达的药物中的应用。
12.本发明提供了上述技术方案中的组合物在制备降低高迁移率族蛋白b1的表达的药物中的应用。
13.本发明提供了上述技术方案中的组合物在制备升高化疗诱发的外周神经病变的机械痛阈的药物中的应用。
14.有益效果：
15.本发明提供了一种用于治疗化疗诱发的外周神经病变的组合物，包括人参皂苷rg1和岩藻多糖。本发明的组合物可显著抑制tnf
‑
α、il
‑
1β和il
‑
6等促炎因子的表达，从而对外周神经产生抗炎促修复，增强抵抗力的作用；另外，本发明的组合物还可以显著改善微循环障碍，通过sr
‑
a介导的信号通路增强巨噬细胞对hmgb1(高迁移率族蛋白b1)的吞噬与清除的能力，抑制tf(组织因子)的过表达，多靶点多机制缓解化疗药物引发的微循环障碍与神经疼痛，从根本上抑制cipn的发展，从而达到安全有效的治疗目的，为临床提供一种新的治疗策略。实施例的结果表明：本发明提供的组合物可显著提高奥沙利铂诱导的cipn模型小鼠的机械痛阈，显著改善cipn模型小鼠的微循环障碍情况，对cipn的治疗具有显著作用。
附图说明
16.图1为实施例3中各处理组对小鼠足底痛阈值的影响；
17.图2为实施例3中各处理组对小鼠足底微循环的影响，其中a为激光多普勒血流图，b为激光多普勒血流图统计图；
18.图3为实施例3中各处理组对小鼠体内炎症因子的影响，其中a为各处理组对il
‑
1βmrna水平的影响；b为各处理组对il
‑
6il
‑
6mrna水平的影响；c为各处理组对tnf
‑
αmrna水平的影响；d为各处理组血浆中hmgb1表达情况的数据统计图；##p<0.01，###p<0.001，表示与对照组相比具有显著性差异；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，表示与奥沙利铂组相比具有显著性差异；
19.图4实施例4中各处理组对小鼠痛阈值及足底血流情况的影响，其中a为各处理组对小鼠足底痛阈值的影响；b为各处理组对小鼠足底微循环的影响；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，表示与对照组相比具有显著性差异；#p<0.05，##p<0.01，###p<0.001，表示与奥沙利铂组相比具有显著性差异；
20.图5实施例4中各处理组对小鼠血浆中hmgb1及tf的影响，其中a为各处理组对小鼠血浆中hmgb1的影响；b为各处理组对小鼠血浆中tf的影响；*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，表示与对照组相比具有显著性差异；#p<0.05，##p<0.01，###p<0.001，表示与奥沙利铂组相比具有显著性差异；&p<0.05，&&p<0.01，表示与奥沙利铂+岩藻多糖组相比具有显著性差异。
具体实施方式
21.本发明提供了一种用于治疗化疗诱发的外周神经病变的组合物，包括人参皂苷rg1和岩藻多糖。本发明对人参皂苷rg1和岩藻多糖的来源没有特殊要求，采用本领域普通市售产品即可。在本发明中，人参皂苷rg1和岩藻多糖均采购于sigma公司，所述人参皂苷rg1和岩藻多糖的质量比优选为1:1～1:5。人参皂苷rg1与岩藻多糖复合物属于天然化合产物，毒性低，应用广，制备简单，安全有效；应用于cipn小鼠模型中，不仅可以消退神经炎症，还可以改善足底血流，缓解微循环障碍，更可以促进巨噬细胞对机体有害物质的吞噬与清除能力，从而多方面多角度有效缓解cipn，产生强大的叠加效应，为化疗诱导的神经痛这一亟待解决的临床问题以及广大遭受神经痛折磨的患者提供一种新的有效治疗手段。
22.本发明提供了上述技术方案中的组合物在制备治疗化疗诱发的外周神经病变的药物中的应用。本发明提供的组合物可显著提高化疗诱导的cipn模型小鼠的机械痛阈，显著改善cipn模型小鼠的微循环障碍情况，对cipn的治疗具有显著作用。
23.本发明提供了上述技术方案中的组合物在制备改善微循环障碍的药物中的应用。本发明提供的组合物可显著改善由化疗诱导的cipn的循环障碍，对cipn的治疗具有显著作用。
24.本发明提供了上述技术方案中的组合物在制备降低组织因子表达的药物中的应用。本发明提供的组合物可显著降低组织因子(tf)的表达，对cipn的治疗具有显著作用。
25.本发明提供了上述技术方案中的组合物在制备抑制化疗诱发的外周神经病变的坐骨神经炎症因子的表达的药物中的应用。本发明提供的组合物可显著抑制坐骨神经炎症因子tnf
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α、il
‑
1β和il
‑
6的累积，对cipn的治疗具有显著作用。
26.本发明提供了上述技术方案中的组合物在制备降低高迁移率族蛋白b1(hmgb1)的表达的药物中的应用。本发明提供的组合物可显著降低hmgb1的表达，对cipn的治疗具有显著作用。
27.本发明提供了上述技术方案中的组合物在制备升高化疗诱发的外周神经病变的机械痛阈的药物中的应用。本发明的组合物可显著升高化疗诱发的外周神经病变的机械痛阈，缓解cipn的神经疼痛，对cipn的治疗具有显著作用。
28.本发明对上述技术方案中所述的药物的辅料及剂型没有特殊要求，采用本领域常规的辅料及剂型即可；也可以不加辅料，以人参皂苷rg1和岩藻多糖的混合物直接作为治疗药物应用。
29.为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的用于治疗化疗诱发的外周神经病变的组合物及其应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
30.实施例1
31.一种用于治疗化疗诱发的外周神经病变的组合物，由人参皂苷rg1和岩藻多糖组成，人参皂苷rg1纯度≥95％，岩藻多糖纯度≥95％，颗粒和直径无特殊要求。人参皂苷rg1和岩藻多糖的质量比为1：1。
32.制备方法：将40mg人参皂苷rg1粉末和40mg岩藻多糖粉末溶于5ml无菌水中，震荡涡旋，使其混匀并完全溶解。
33.实施例2
chemotherapy
‑
induced peripheral neuropathy.int j cancer.2020 may15；146(10):2810
‑
2821.doi:10.1002/ijc.32652.epub 2019 sep 14.pmid:31465111。纤维丝测痛仪是由20根vonfreyhairs纤毛机械刺激针组成，主要用于评估皮肤的触觉，它可提供0.008g～300g的von frey hairs刺激力。von frey hairs尼龙丝的粗细及伸出长度决定提供刺激力的大小。实验时，根据实际情况选定粗细得当的von frey hairs纤毛机械刺激针，垂直地刺激皮肤，可通过调节更换von frey hairs纤毛机械刺激针调整刺激力大小，直到von frey hairs纤毛机械刺激针弯曲。当啮齿类动物的爪受到一个机械刺激，会有缩回反射，可应用于大、小鼠的足底。
46.本发明根据上述方法每天进行小鼠右爪的痛阈测量。在安静环境下，将小鼠置于金属铁丝网上的透明隔间中，自由活动适应20min。待小鼠的探索行为停止后并且四肢均接触铁丝网时进行检测，以不同折力的von
‑
fery纤维垂直刺激小鼠后足足底皮肤，逐渐加压至细丝微微弯曲，维持4s，观察小鼠是否有缩足反应，小鼠出现缩足、舔足等动作视为阳性反应，记录引起小鼠缩足反应的最大压力为机械性刺激缩足反射阈值。每次测量间隔3min，采用序贯法计算50％机械性刺激缩足反射阈值，测量3次取平均值，检测结果见图1。
47.(3)多普勒血流测定：通过超声多普勒血流仪测量血液流速和流量，位置固定的超声探头发射超声波，被血液中的红细胞接收，然后把红细胞作为波源，超声探头接收红细胞的反射波，利用超声波的发射波和反射波的频率差，根据多普勒效应公式即可计算血液的流速。本发明将小鼠下半身去除毛发，进行多普勒血流测定，以观察小鼠后爪为主，监测其微循环障碍情况，相同对比度下，红色越深代表血流丰富，蓝色越深，代表有一定的微循环障碍情况，血流受阻，检测结果见图2。
48.(4)实时定量聚合酶链式反应(qpcr)检测il
‑
1β、il
‑
6和tnf
‑
α的mrna水平。
49.a.提取rna：细胞给药处理后，用trizol试剂按照操作要求抽提rna，并进行浓度测定。
50.b.逆转录反应：该过程选用hiscript ii q rt supermix试剂盒进行，反应体系为：2μl的5
×
hiscript iiq rt supermix，500ng的模板rna，最后加入rnase free ddh20补足体积至总反应体系为10μl；pcr仪设定反应程序，按50℃，15min
→
85℃，5s进行逆转录反应得到cdna样本。
51.c.qpcr反应：将cdna样本稀释5倍，反应体系为：分别将2μl上游引物，2μl下游引物，1μl稀释后的cdna模板和5μl2
×
sybr qpcr master mix加入八连管，使总反应体积为10μl，涡旋混匀，各引物如表1。
52.反应条件如下：95℃，30s；40个循环，95℃，10sec；60℃，30s。溶解曲线为95℃，15s；60℃，60s；95℃，15s。
53.获得的ct值作为结果进行分析，计算公式为：2
‑
δδct，δct＝ct gene
‑
ctactin，δδct＝δct
–
control组δct均值，采用相对定量法与内参actin比较。
54.表1各引物序列统计表
[0055][0056]
(5)western blot检测hmgb1的蛋白表达水平。
[0057]
①
动物样本制备：小鼠cipn造模7天后，取小鼠血浆，每个样本加入190μl含磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂pmsf的ripa裂解液。加入10ul血浆样本，于冰上静置30min，bca法测定组织样本中的蛋白浓度后，按比例加入5
×
loading buffer，涡旋混匀，煮沸5min使蛋白变性；样本保存于
‑
20℃。
[0058]
②
电泳与转膜：取总蛋白量30μg血浆样本样本，用8％，10％或15％的胶进行sds
‑
page电泳，待蛋白分离适当，停止电泳；切胶转印至pvdf膜上，恒流300ma进行转膜，转膜时间由目的蛋白分子量决定。
[0059]
③
封闭与抗体孵育：10％全脂奶粉(tbst溶解)或者5％bsa+5％奶粉溶液室温封闭2h；按1：1000的比例稀释β
‑
actin抗体、hmgb1抗体，将条带置于一抗稀释液中于4℃孵育16h。待孵育完毕后，tbst洗膜3次，每次10min。按1:5000的稀释比例配制二抗溶液，将条带分别与其一抗相对应的二抗于室温下摇床孵育2h，孵育结束后，tbst洗膜4次，每次10min。
[0060]
④
显色：ecl化学发光试剂盒中a液和b液按1:1的比例配制显影液，将条带置于凝胶成像仪的曝光台，膜表面均匀铺上显影液，孵育1
‑
2min，运行设定的程序进行曝光成像。
[0061]
⑤
数据分析：使用gel pro或者image j软件扫描各组数据图像灰度，用excel进行数据统计与分析，结果见图3。
[0062]
图1为各处理组对小鼠痛阈值的影响。由图1的结果可知，人参皂苷rg1与岩藻多糖组合物可明显升高小鼠机械痛阈，于第10天开始，组合给药相比于两者单给药逐渐体现出优势，持续到21天，组合给药缓解小鼠机械痛阈的效果显著优于两者单给药。在2017年有相关文献报道，使用奥沙利铂建立cipn模型，用10、30、60mg/kg三个浓度的度洛西汀予以治疗，使用von frey filament tests进行小鼠机械痛阈的测量。使用0.4g的弯曲力度刺激小鼠后爪皮肤10次，以小鼠双爪退缩反应记为阳性，以总次数为100％计算。结果显示，10mg/kg的度洛西汀对于缓解小鼠机械痛并无显著效果，30mg/kg的剂量可缓解约20％小鼠的疼痛，60mg/kg的剂量可改善约40％小鼠的疼痛，但该剂量会引发部分小鼠嗜睡(文献：kim w,chung y,choi s,min bi,kim sk.duloxetine protects against oxaliplatin
‑
induced neuropathic pain and spinal neuron hyperexcitability in rodents.int j mol sci.2017 dec 5；18(12):2626.doi:10.3390/ijms18122626.pmid:29206213；pmcid:pmc5751229.)，存在严重的不良反应。本发明的组合物能显著提高小鼠机械痛阈，且无不良
副反应。
[0063]
图2为各处理组对小鼠足底微循环的影响，由图2的结果可知，给予奥沙利铂(l
‑
ohp)组小鼠，微循环障碍情况严重，单给人参皂苷rg1组小鼠，血流状况并没有得到显著改善，但给予岩藻多糖组小鼠，血流状况改善显著，联合给药组，进一步改善了微循环障碍情况，其中，奥沙利铂+岩藻多糖+人参皂苷rg1(1:2.5)组效果最为显著。
[0064]
图3为各处理组对小鼠体内炎症因子的影响，主要考察岩藻多糖人参皂苷联合给药可显著抑制炎症因子的表达以及hmgb1的积累。其中a为各处理组对il
‑
1βmrna水平的影响；b为各处理组对il
‑
6mrna水平的影响；c为各处理组对tnf
‑
αmrna水平的影响；d为各处理组血浆中hmgb1表达情况的数据统计图。由图3可知，人参皂苷岩藻多糖联合给药组可显著降低小鼠血液中炎症因子il
‑
1β、tnf
‑
α和il
‑
6的表达水平，减少hmgb1的过度累积，其中，奥沙利铂+岩藻多糖+人参皂苷rg1(1:2.5)组效果最为显著，能够显著缓解cipn。
[0065]
实施例4
[0066]
试验方案：本试验分为5个处理组，分别为对照组、奥沙利铂组(模型组)、奥沙利铂+岩藻多糖组、sr
‑
a敲除+奥沙利铂组、sr
‑
a敲除+奥沙利铂+岩藻多糖组，以上n＝6，其中，对照组、奥沙利铂组和奥沙利铂+岩藻多糖组采用c57bl/6j小鼠，sr
‑
a敲除+奥沙利铂组、sr
‑
a敲除+奥沙利铂+岩藻多糖组采用sa
‑
a敲除小鼠，奥沙利铂+岩藻多糖组和+sr
‑
a敲除+奥沙利铂+岩藻多糖组提前7天开始予以小鼠岩藻多糖(200mg/kg)，于第8天开始给予奥沙利铂组、奥沙利铂+岩藻多糖组、sr
‑
a敲除+奥沙利铂组和sr
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a敲除+奥沙利铂+岩藻多糖组小鼠腹腔注射奥沙利铂(3mg/kg)，连续五天以进行cipn动物模型的制备，期间治疗组伴随给药，第6天停止给予奥沙利铂，治疗组仍然持续给药至14d。从小鼠造模起每天进行行为学测定，并于造模后14d进行足底多普勒血流测定，考察微循环障碍情况和western blot检测各因子的表达水平，结果见图4～5。
[0067]
图4为体内试验中各处理组对小鼠痛阈以及微循环障碍的影响，其中a为各处理组对小鼠痛阈的影响，b为各处理组对循环障碍的影响。由图4的结果可知，岩藻多糖可显著降低奥沙利铂+岩藻多糖组的痛阈以及促进小鼠微循环作用，但对sr
‑
a敲除+奥沙利铂+岩藻多糖组没有太大的改善，说明岩藻多糖对cipn小鼠的阵痛作用和缓解微循环的作用依赖于sr
‑
a受体，sr
‑
a
‑
/
‑
完全取消了岩藻多糖的镇痛作用和缓解微循环的作用，即岩藻多糖缓解化疗痛的机制为sr
‑
a介导了岩藻多糖的镇痛作用以及增加小鼠足部血流灌注的作用。
[0068]
图5为体内试验中处理组对hmgb1、tf表达的影响，其中a为各处理组对hmgb1表达的影响，b为各处理组对tf表达的影响。由图5结果可知，岩藻多糖可显著降低奥沙利铂+岩藻多糖组的hmgb1以及tf，但对sr
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a敲除+奥沙利铂+岩藻多糖组没有太大的改善，说明岩藻多糖对cipn小鼠的hmgb1与tf抑制作用依赖于sr
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a受体，sr
‑
a
‑
/
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完全取消了岩藻多糖对hmgb1与tf的抑制作用，即岩藻多糖缓解化疗痛的机制为岩藻多糖通过sr
‑
a信号通路减少了小鼠血浆中hmgb1的累积和tf的表达。
[0069]
由上述实施例的结果可知，本发明提供的人参皂苷rg1与岩藻多糖组合物可显著提高奥沙利铂诱导的cipn模型小鼠的机械痛阈，显著改善cipn模型小鼠的微循环障碍情况，对cipn的治疗具有显著作用，且安全可靠，毒性低，易受人群广，为临床提供了一种新的治疗策略。
[0070]
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，
而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其它实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。