桧烯在制备杀灭或预防寄生虫病药物中的应用的制作方法

[0001]
本发明属于药物技术领域，具体涉及植物挥发油中单萜类化合物桧烯在制备杀灭或预防寄生虫病药物中的应用。


背景技术：

[0002]
弓形虫病是一种全球性的人兽共患寄生虫病，是由顶复门、孢子虫科、弓形虫属的刚第弓形虫(toxoplasma gondii)寄生于宿主中有核细胞内引起的一种孢子虫病。研究表明，猫科动物为终末宿主，人、畜、禽等100多种动物属于中间宿主，在家畜中对猪、羊的危害最大，且多为隐性感染。猫科动物感染弓形虫后会导致其死亡，而孕妇感染后会导致早产、流产等症状。弓形虫病严重影响畜牧业的健康发展和人类健康，带来严重的经济损失。目前，用于治疗弓形虫病的药物主要为化学合成药物，如乙胺嘧啶、磺胺嘧啶和叶酸联合应用等，此类药物能控制弓形虫病的发展，但治疗常伴有副作用，且预后不好，易复发。
[0003]
桧烯(sabinene，bicyclo[3.1.0]hexane,4-methylene-1-(1-methylethyl)-)为单萜类化合物，该化合物广泛分布在鼠尾草(salvia officinalis)、阳荷(zingiber striolatum)、全叶青兰(dracocephalum integrifolium)等多种植物挥发油中，可以通过超临界萃取或水蒸气蒸馏等方法提取植物挥发油，而后通过溶剂提取及制备薄层层析等方法分离提取，也可以通过生物发酵或化学合成得到。桧烯获得方便，且成本较低。桧烯是一种重要的高密度燃料前体，可以作为航空燃料的添加剂，在医药、食品、能源等领域中，桧烯都具有重要的应用前景，近年来受到人们越来越多的关注。研究表明，桧烯具有抗菌、除草和杀灭节肢动物等活性，例如发明专利(cn201910847090.0)公开了一种天然单萜类化合物桧烯在制备除草剂中的应用，该化合物在较低浓度5μl/ml下应用，可杀灭单双子叶植物狗尾草，并对双子叶植物反枝苋和苜蓿有明显的抑制作用，将该化合物配制成不同浓度，在苗前或苗期单独或与其它农药混合使用，可自然降解，对环境无污染，可作为除草剂进行使用。发明专利(cn201710293058.3)公开了再现白莲花香味的香料组合物，具体涉及在利用spme法分析出白莲花香味成分的十五烷、对苯二甲醚、十七烷、桧烯、柠檬烯、月桂烯、α-松油醇等中添加2-苯乙醇来再现具有优异的偏好性的白莲花香味的香料组合物。发明专利(cn201811348112.0)公开了一种抗菌除螨去异味的水溶液，至少包括茶树精油、雪松精油、芳枸叶精油、迷迭香精油、薰衣草精油、香叶醇、α蒎烯、β蒎烯、月桂烯、桧烯、柏木油、龙脑、薄荷脑、麝香草酚等成分。具有很好的抗菌、除臭及收敛的作用，不但对除臭有清除的作用，同时对异味的释放源还有很好的控制效果和抗病毒的作用。发明专利(cn201310594690.3)本发明公开了一种诱集桃蛀螟的引诱剂及诱芯，该引诱剂由化合物α-蒎烯、莰烯、桧烯和β-蒎烯混合而成，各化合物均是桃蛀螟主要寄主植物(板栗)田间释放的挥发性活性化合物。该引诱剂以具有引诱桃蛀螟作用的挥发性活性化合物混配而成，可以诱集大量的桃蛀螟雌蛾和少量雄蛾，可以应用于栗园桃蛀螟种群发生动态监测和防治。但是，本领域还没有技术方案公开桧烯对寄生虫的作用。
[0004]
发明人在研究过程中意外的发现，桧烯能够显著降低弓形虫i型虫株(rh-2f)速殖
子的存活率，且具有出良好的抗弓形虫孢内增殖活性，显著减少细胞内虫体、降低体内胞囊数；抑制弓形虫的入侵活性，扩大了桧烯的用途。


技术实现要素：

[0005]
针对上述技术问题，本发明公开了桧烯的一种新用途，其第一目的是提供桧烯及其药学上可接受的盐在制备杀灭或预防寄生虫病药物中的应用。
[0006]
本发明的第二目的是提供桧烯及其药学上可接受的盐在制备杀灭或预防细胞内寄生虫病药物中的应用。
[0007]
优选地，所述的寄生虫病包括弓形虫病。
[0008]
本发明的第三目的是提供一种杀灭或预防寄生虫病的药物组合物，所述药物组合物的包括桧烯及其他药学上可接受的辅料。
[0009]
优选地，所述药物组合物中桧烯的有效浓度为90.76μg/ml。
[0010]
优选地，所述的药物组合物可配制为散剂、片剂、胶囊剂、丸剂、滴丸剂、注射剂、乳剂、混悬剂或酊剂中的任意一种剂型。
[0011]
本发明的第四目的是提供一种抑制寄生虫宿主细胞药物组合物，所述的药物组合物包括桧烯及其他药学上可接受的辅料，所述组合物中桧烯的有效浓度为221.5μg/ml。
[0012]
优选地，所述的药物组合物可制备成外用制剂。
[0013]
本发明的第五目的是提供桧烯和其他抗虫药物联合用药用于治疗寄生虫病的应用
[0014]
本发明的第六目的是提供所述的药物组合物在制备动物饲料中的应用。
[0015]
本发明的有益效果是：本发明提供了桧烯的一种新用途，具体提供了桧烯在制备杀灭或预防寄生虫病药物中的应用，实验结果显示，
①
桧烯对弓形虫i型虫株(rh-2f)速殖子的半数抑制浓度为90.76μg/ml，能够显著降低弓形虫的存活率；
②
桧烯有较强的抗弓形虫增殖活性，可以防止弓形虫在细胞内的增殖，从而预防或治疗弓形虫病；
③
桧烯对弓形虫具有较强的抗入侵活性，可以防止细胞外的弓形虫入侵宿主细胞；且本发明所述的桧烯在治疗弓形虫病方面具有安全、有效、毒性小等特点，制备工艺简单，成本低，可制备成各种制剂，且容易降解，不会对环境造成任何污染。
附图说明
[0016]
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0017]
图1：桧烯对弓形虫i型虫株(rh-2f)的抑制作用
[0018]
图2：免疫荧光实验中桧烯对细胞内弓形虫的抗增殖作用
[0019]
图3：桧烯对弓形虫ii型虫株(pru)胞内的抗增殖作用
[0020]
图4：桧烯对细胞外弓形虫的抗入侵作用
[0021]
图5：桧烯对vero细胞的细胞毒性
具体实施方式
[0022]
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的结果在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0023]
以下实施例所述的vero细胞是非洲绿猴肾细胞，是一种异倍体细胞，经猕猴肾细胞培养衍化后产生的一种常用的细胞系。
[0024]
以下实施例所述的细胞爬片，是指让玻片浸在细胞培养基内，细胞在玻片上生长，主要用于组织学，免疫组织化学，冰冻切片，细胞涂片，原位杂交等。
[0025]
以下实施例所述的giemsa染色法，mgg由may-grunwald染料和giemsa染料组成。前者化学名为曙红亚甲基蓝ⅱ，对胞质着色较好；后者对胞核着色较好。因此mgg染色，可兼两者的优点，常用于细胞涂片染色。
[0026]
以下实施例所述的dapi，即4',6-二脒基-2-苯基吲哚，是一种能够与dna强力结合的荧光染料，常用于荧光显微镜观测。因为dapi可以透过完整的细胞膜，它可以用于活细胞和固定细胞的染色。
[0027]
以下实施例所述的cck-8试剂中含有wst
–
8:化学名:2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2h-四唑单钠盐，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯(1-methoxy pms)的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲臜产物(formazan)。生成的甲臜物的数量与活细胞的数量成正比。
[0028]
用酶联免疫检测仪在450nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。该方法已被广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞增殖试验、细胞毒性试验以及药敏试验等。
[0029]
以下实施例所述的dpbs，全称dulbecco's phosphate-buffered saline即杜氏磷酸盐缓冲液，是用于短期维持哺乳动物细胞活性的一种平衡盐溶液。它可以在有限时间内维持离体细胞结构和生理学上的完整性。其中钙镁离子的存在会降低胰蛋白酶活力，因此消化细胞时一般添加edta，用于螯合可能存在的钙镁离子。但是edta不能被血清中和，所以使用edta处理细胞后，一定要用不含钙镁离子的dpbs。dpbs一般用于细胞游离前的清洗、细胞或组织运输、细胞计数稀释、溶液配制、容器和细胞用品的清洗等。
[0030]
以下实施例所述的胞囊是指低等植物和原生动物在休止状态或外界环境条件改变时，身体外围分泌一种蛋白质的膜，以度过恶劣环境。原生动物的身体构造一般都很简单，繁殖能力强。在寄生性的原生动物当中，能够看到形成胞囊的一些特殊现象。胞囊包有一层非常坚实的膜，即便被排出体外，也可以生存很长的时间。具有这种状态的称之为抵抗型或感染型。本发明特质弓形虫的胞囊。
[0031]
实施例一、桧烯对弓形虫i型虫株(rh-2f)的抑制作用
[0032]
1.实验细胞及试剂来源
[0033]
vero细胞：购自中国科学院细胞库；
[0034]
弓形虫rh-2f：购自atcc；
[0035]
弓形虫rh和pru：由中国农业科学院兰州兽医研究所朱兴全惠赠；
[0036]
桧烯：购自上海源叶生物科技有限公司；
[0037]
检测试剂：购自普洛麦格北京生物技术有限公司；
[0038]
一抗和二抗：购自abcam；
[0039]
2.实验过程
[0040]
从vero细胞中收获新鲜活力强的弓形虫i型虫株(rh-2f)速殖子，血细胞计数板计数，调整弓形虫rh-2f的浓度为1
×
105个/ml。以此配制不同浓度的桧烯，加入96孔板中，以0.25％dmso为对照组，只含培养基的为空白组。培养12h后加入检测试剂，作用30min后于光度计中检测发光值。计算弓形虫rh-2f存活率，绘制曲线和计算ic
50
。
[0041]
3.实验结果
[0042]
实验结果如图1所示，随着桧烯药物浓度的增加，弓形虫i型虫株(rh-2f)的存活率下降，并得到弓形虫i型虫株(rh-2f)的ic
50
为90.76μg/ml。说明桧烯对弓形虫i型虫株(rh-2f)具有抑制作用。
[0043]
实施例二、桧烯对细胞内弓形虫的抗增殖作用(免疫荧光法)
[0044]
1.实验过程
[0045]
本实施例实验过程中所使用的细胞及试剂来源与实施例一公开的一样。
[0046]1×
105个/ml的vero细胞接种于12孔板中的细胞爬片中，12h后将1
×
105个/ml的弓形虫i型虫株(rh-2f)速殖子接种于单层vero细胞中，待入侵8h后，加入桧烯作用48h，0.25％dmso为对照组，乙酰嘧啶(10μg/ml)作为阳性对照。之后用4％多聚甲醛固定，抗原修复，10％山羊血清封闭，0.2％triton x-100通透，选择用兔抗弓形虫多克隆抗体对弓形虫进行标记，二抗为山羊抗兔lgg h&l，dapi染核。染色封片后于共聚焦显微镜下观察拍照。
[0047]
2.实验结果
[0048]
实验结果如图2所示，48h时，桧烯对弓形虫i型虫株(rh-2f)的抗增殖效果明显，视野中只有少数虫体存在。阳性对照乙酰嘧啶虽也能减少孢内虫体，但活性低于桧烯，抗增殖效果低于桧烯。综上所述，桧烯有较强的抗弓形虫增殖活性。
[0049]
实施例三、桧烯对细胞内弓形虫ii型虫株(pru)的抗增殖作用
[0050]
1.实验过程
[0051]
本实施例实验过程中所使用的细胞及试剂来源与实施例一公开的一样。
[0052]
6孔板接种浓度为2
×
105个/ml的vero细胞培养12h后，单层细胞中加入浓度为3
×
105个/ml的弓形虫ii型虫株(pru)速殖子。入侵24h后用dpbs洗去未入侵的速殖子，并加入浓度为80μg/ml的桧烯，以0.25％dmso为对照组。培养48h时giemsa染色观察结果。
[0053]
2.实验结果
[0054]
实验结果如图3所示，48h时对照组视野中已被胞囊占据，桧烯组未见虫体。研究结果表明，桧烯有较强的抗弓形虫增殖活性。
[0055]
实施例四、桧烯对细胞外弓形虫的抗入侵作用
[0056]
1.实验过程
[0057]
本实施例实验过程中所使用的细胞及试剂来源与实施例一公开的一样。
[0058]1×
105个/ml的vero细胞接种于12孔板中的细胞爬片中，12h后将含有各浓度桧烯的1
×
105个/ml的弓形虫i型虫株(rh-2f)速殖子接种于单层vero细胞中，0.25％dmso为对照组。入侵2h后尽量用pbs将未入侵细胞外的速殖子洗去。固定、抗原修复和封闭后用小鼠抗弓形虫单克隆抗体对细胞外的弓形虫进行标记，二抗为山羊抗小鼠lgg h&l。通透后选择用兔抗弓形虫多克隆抗体对细胞内的弓形虫进行标记，二抗为山羊抗兔lgg h&l，dapi染
核。染色封片后于共聚焦显微镜下随机选择十个视野观察拍照并计数。
[0059]
2.实验结果
[0060]
实验结果如图4所示，桧烯对弓形虫i型虫株(rh-2f)的抗入侵作用呈剂量依赖。40μg/ml时入侵率为80.70％，120μg/ml时入侵率为19.30％。综上所述，桧烯对弓形虫具有较强的抗入侵活性。
[0061]
实施例五、桧烯对vero细胞的细胞毒性
[0062]
1.实验过程
[0063]
采用cck-8法测定桧烯的对vero细胞的毒性。vero细胞调整细胞浓度为1
×
105个/ml，每孔100μl接种于96孔板，培养12h后，加入各浓度的桧烯。以0.25％dmso为对照组，只含培养基的为空白组。培养24h后加入cck-8试剂，作用1h后于450nm的酶标仪内测定各孔od值。按以下公式计算细胞存活率，并绘制曲线和计算ic
50
。
[0064]
2.实验结果：
[0065]
桧烯128μg/ml时vero细胞的存活率为93.63％，64μg/ml时对vero有促进增殖的作用，细胞存活率达到106.90％，桧烯对vero细胞的ic
50
为221.5μg/ml，说明桧烯对宿主细胞的毒性低，可以用于制备治疗弓形虫病。
[0066]
综上所述，本发明公开了桧烯的新用途，具体公开了桧烯对弓形虫i型虫株(rh-2f)速殖子的半数抑制浓度为90.76μg/ml，能够显著降低弓形虫的存活率；同时桧烯有较强的抗弓形虫增殖活性，可以抑制弓形虫的增殖；同时，桧烯对弓形虫还具有较强的抗入侵活性；且本发明所述的桧烯在治疗弓形虫病方面具有安全、有效、毒性小等特点，制备工艺简单，成本低，可制备成各种制剂，且容易降解，不会对环境造成任何污染。
[0067]
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。