基于透明质酸的靶向铂纳米团簇及其制备方法和应用与流程

1.本发明属于新材料领域，特别是指基于透明质酸的靶向铂纳米团簇及其制备方法和应用。


背景技术：

2.2018年最新的全球肿瘤统计结果显示，全球范围内癌症的发病率排行第一位的是肺癌，占癌症总发病人口的11.6%。其中，非小细胞肺癌（nsclc）约占所有新诊断肺癌的 85％，目前，nsclc的临床治疗方式主要包括手术、放射和药物治疗等。然而由于筛查计划不足和临床症状出现较晚，大多数患者被诊断为晚期肺癌，只有25％～30％的nsclc患者具有手术指征。因此，研究非小细胞肺癌的早期鉴别、诊断具有重大意义。由几个至几百个原子组成的铂纳米团簇材料在被用于新型铂基抗肿瘤药物过程中，基于其自身的尺寸依赖荧光特性，无须结合其他荧光标记物（量子点、荧光素等）即可实现“标定
‑
治疗”多功能化，在癌症临床诊疗上展现出巨大的应用前景。透明质酸分子与cd44之间的相互作用可以引发胞内多条信号通路，导致肿瘤细胞的粘附、迁移、侵袭和生长，已被作为包括胃癌、头颈癌、乳腺癌、淋巴瘤等早期分子诊断指标。
3.专利cn201910078873.7，公开了一种用于肺癌诊断的t1
‑
t2双模态靶向成像造影剂及制备方法，利用纳米载体的自组装过程，将疏水性磁性纳米颗粒包裹在聚合物载体的疏水内核中，疏水性纳米颗粒包括超顺磁珠纳米颗粒和二氧化锰纳米颗粒，然后并将靶向肽cngqgeqc偶联在亲水性链末端的马来酰亚胺基团上，保证胶束形成后靶向肽位于胶束的外壳层，合成本发明t1
‑
t2双模态靶向性造影剂spio
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peg
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mno2
‑
cngqgeqc，使其具备肺癌细胞主动靶向识别以及t1加权像、t2加权像的显影效果。现有的具有靶向识别的荧光标记物大多是需要与靶向肽结合，实现靶向的功能。
4.专利201410170073.5、专利201911041680.0和专利201410474210.4中，虽然都公开了利用透明质酸制备具有靶向功能的物质，但是透明质酸与不同的物质相复合制备的产物的功能大相径庭，毫无规律可言，而本课题组，利用用透明质酸修饰铂纳米团簇构建一种靶向
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荧光双功能性抗肿瘤铂纳米团簇药物体系，不仅能靶向定位不同肺癌细胞实现区别化成像，而且能有效定位于病变部位抑制特定肺癌细胞的增殖，还可以为设计和开发多功能、高活性且低毒副作用的抗非小细胞肺癌的化疗药物，提供了新思路。


技术实现要素：

5.为解决上述技术问题，本发明提出一种基于透明质酸的靶向铂纳米团簇及其制备方法和应用。不仅能靶向定位不同肺癌细胞实现区别化成像，而且能有效定位于病变部位抑制特定肺癌细胞的增殖，为非小细胞肺癌的定位和识别提供了一种新思路。
6.本发明的技术方案是这样实现的：基于透明质酸的靶向铂纳米团簇的制备方法，步骤如下：向透明质酸溶液中加入1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐（edc）溶液，充分混合后，加入n
‑
羟基琥珀酰
‎
亚胺（nhs）溶液充分混合，将上述混合溶液加入铂纳米团簇溶液，于37℃振荡混匀1
‑
24h后超速离心，最后透析1
‑
2天，即得靶向铂纳米团簇。
7.优选的，所述透明质酸溶液的浓度为0.5
‑
20 g/l，1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐溶液的浓度为1
‑
50 g/l，n
‑
羟基琥珀酰
‎
亚胺溶液的浓度为1
‑ꢀ
50 g/l。
8.优选的，所述透明质酸溶液、1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐溶液和n
‑
羟基琥珀酰
‎
亚胺溶液的体积比为（5
‑
10）:3:2。
9.优选的，所述室温混合的温度为25
‑
37℃、时间为1
‑
12h。
10.优选的，所述透析采用透析袋，透析袋的型号为m
w
co=1000 d。
11.上述制备方法所制备的靶向铂纳米团簇，所述靶向铂纳米团簇为胺类聚合物配体包裹铂纳米团簇。
12.上述的靶向铂纳米团簇在制备靶向识别肺癌细胞的荧光标记或荧光成像试剂中的应用。
13.优选的，所述肺癌细胞为人非小细胞肺癌细胞h1299、人小细胞肺癌细胞h446或人胚肺成纤维细胞hfl1。
14.本发明具有以下有益效果：1、本申请合成的透明质酸靶向铂纳米团簇，能够靶向识别非小细胞肺癌。将透明质酸靶向铂纳米团簇加入含有不同肺部细胞（可以是人非小细胞肺癌细胞h1299、人小细胞肺癌细胞h446、人胚肺成纤维细胞hfl1）的培养液中共同培养，基于细胞膜表面cd44表达的差异性，共聚焦显微镜下呈现强弱不同的荧光成像。
15.2、本发明透明质酸靶向铂纳米团簇的制备方法具有以下特点：团簇尺寸较小（小于2 nm）、粒径均匀、具有优异的荧光性能；通过edc/nhs酰胺实现铂纳米团簇溶液和透明质酸溶液的充分反应，制备出透明质酸铂纳米团簇粗产物，超速离心及透析后，最终得到靶向透明质酸铂纳米团簇。本申请制备方法简单、容易操作、重现性好、可以实现大规模生产；构建新型靶向铂纳米团簇化疗药物，赋予其多功能性——荧光和抗肿瘤性能，实现对非小细胞肺癌、小细胞肺癌以及正常肺部细胞的选择性靶向荧光成像，以及区别化抑制非小细胞肺癌增殖，为非小细胞肺癌的早期诊疗提供一条新思路。
附图说明
16.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
17.图1为本发明实施例中荧光铂纳米团簇的结构示意图；其中：1
‑
为铂纳米团簇，2
‑
为胺类聚合物配体，3
‑
为透明质酸分子。
18.图2为非小细胞肺癌细胞h1299的荧光成像。
19.图3为人小细胞肺癌细胞h446的荧光成像。
20.图4为人胚肺成纤维细胞hfl1的荧光成像。
具体实施方式
21.下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
22.实施例1本实施例的基于透明质酸的靶向铂纳米团簇的制备方法，步骤如下：在10 ml 水中加入0.01 g透明质酸，混合均匀后加入3 ml的10 g/l的edc溶液，充分混合20 min后，加入2 ml的10 g/l nhs溶液，37℃恒温振荡1 h，将上述粗产物超速离心、并用型号为m
w
co=1000 d透析袋进行透析1d后，用超滤离心两次，得到最终的靶向铂纳米团簇。
23.实施例2本实施例的基于透明质酸的靶向铂纳米团簇的制备方法，步骤如下：在10 ml 水中加入0.02 g透明质酸，混合均匀后加入3 ml的30 g/l的edc溶液，充分混合20 min后，加入2 ml的30 g/l nhs溶液，37℃恒温振荡12 h，将上述粗产物超速离心、并用型号为m
w
co=1000 d透析袋进行透析2d后，用超滤离心两次，得到最终的靶向铂纳米团簇。
24.实施例3本实施例的基于透明质酸的靶向铂纳米团簇的制备方法，步骤如下：在5 ml 水中加入0.2 g透明质酸，混合均匀后加入3 ml的50 g/l的edc溶液，充分混合20 min后，加入2 ml的50 g/l nhs溶液，37℃恒温振荡5 h，将上述粗产物超速离心、并用型号为m
w
co=1000 d透析袋进行透析后，用超滤离心两次，得到最终的靶向铂纳米团簇。
25.实施例4本实施例的基于透明质酸的靶向铂纳米团簇的制备方法，步骤如下：在10 ml 水中加入0.005 g透明质酸，混合均匀后加入3 ml的1 g/l的edc溶液，充分混合50 min后，加入2 ml的1 g/l nhs溶液，30℃恒温振荡1h，将上述粗产物超速离心、并用型号为m
w
co=1000 d透析袋进行透析1d后，用超滤离心两次，得到最终的靶向铂纳米团簇。
26.实施例5本实施例的基于透明质酸的靶向铂纳米团簇的制备方法，步骤如下：透明质酸靶向铂纳米团簇的制备方法：在10 ml 水中加入0.01 g透明质酸，混合均匀后加入3 ml的1 g/l的edc溶液，充分混合20 min后，加入2 ml的5 g/l nhs溶液，37℃恒温振荡24 h，将上述粗产物超速离心、并用型号为m
w
co=1000 d透析袋进行透析1.5d后，用超滤离心两次，得到最终的靶向铂纳米团簇。
27.实施效果例区别标定肺部细胞：取10 μl的实施例1最后得到的靶向铂纳米团簇，加入到含有不同肺部细胞的无菌rpmi
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1640培养液（含10 %血清）中，在37 ℃无菌环境纯净空气（5% co2）的条件下，共培养4 h后，用4 %多聚甲醛固定悬浮细胞。pbs清洗细胞后，滴加甘油 (50 % ，v/v)后，进行共聚焦显微镜细胞成像检测。成像结果如图2
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4所示，图2为h1299细胞在含
fbs的培养基中孵育4h后的共聚焦显微镜图像，细胞核经dapi染色后发出蓝色荧光，基于透明质酸的靶向铂纳米团簇呈绿色荧光，比例尺为20
µ
m；图3为h446细胞在含fbs的培养基中孵育4h后的共聚焦显微镜图像，细胞核经dapi染色后发出蓝色荧光，基于透明质酸的靶向铂纳米团簇呈绿色荧光，比例尺为20
µ
m；图4为hfl1细胞在含fbs的培养基中孵育4h后的共聚焦显微镜图像，细胞核经dapi染色后发出蓝色荧光，基于透明质酸的靶向铂纳米团簇呈绿色荧光，比例尺为20
µ
m。
28.以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。