基于网络药理学评价金莲清热制剂抗新型冠状肺炎的方法与流程

1.本发明属于医药技术领域，尤其涉及一种基于网络药理学评价金莲清热制剂抗新型冠状肺炎的方法。


背景技术：

2.新型冠状病毒肺炎（covid-19）是由新型冠状病毒（sars-cov-2）感染导致的以发热、咳嗽或干咳、腹泻为主要标志的急性呼吸道传染病，可影响胃肠道，以及神经和肝系统等。病程后期患者会出现高热、急性呼吸窘迫症以及炎性因子风暴等症，危及生命。国家卫健委及国家中医药管理局发布的《新型冠状病毒肺炎诊疗方案》中指出应推荐使用不同的复方中成药对症治疗。因此研究对症中药复方具有重要意义。金莲清热泡腾片由金莲花、苦杏仁、大青叶、玄参、地黄、知母和石膏组方而成，具清热解毒、止咳利咽、生津除痰之功效，临床常用于高热、咽干痛、咳嗽粘稠的患者，接受度较高。金莲清热泡腾片以《伤寒论》中白虎汤和增液汤二方整合优化而来，对病毒引发的高热的恢复以及提高巨噬细胞吞噬能力和淋巴细胞的活性具有良好的临床效果。
3.网络药理学基于系统生物学和多向药理学，能从整体水平考察“药物-靶点-疾病”的复杂关系，进而指导新药研发及探究机理过程。结合运用分子对接，能够快速筛选新药临床实验的成功率，节省药物研发的时间与资金成本。金莲清热泡腾片在2020年新冠疫情中被推荐用于辅助治疗新冠肺炎，但其作用药效物质基础和作用机理不清楚，针对该问题，本发明是以中药复方网络药理学“药物-成分-靶点-疾病”为基本思路，对金莲清热泡腾片治疗新型冠状病毒肺炎以及发热症的潜在活性成分、作用靶点以及相关通路进行了整合分析。


技术实现要素：

4.本发明是针对金莲清热制剂治疗新冠肺炎的药效物质基础和作用机理不清楚的问题通过网络药理学评价方法加以分析，初步阐明治疗新冠肺炎的分子机制以及预后对高热症状的作用机理，为临床使用提供参考。具体方法为：一种基于网络药理学评价金莲清热制剂抗新型冠状肺炎的方法，其特征在于，所述方法包含以下步骤：首先获取金莲清热制剂药效成分靶点及新冠肺炎作用靶点；构建金莲清热制剂抗新型冠状肺炎及其发热症的潜在作用靶点互作网络和潜在药效成分-作用靶点网络，找到潜在作用靶点蛋白互作关系；对靶点进行go分析和kegg富集分析，找出核心靶点；将核心靶点与活性成份进行分子对接，验证作用靶点及药效归属。
5.其中，所述步骤具体方法为：从tcmsp 数据库获取金莲清热制剂所含药材的化学成分，设置口服生物利用度大于30% 和类药性大于0.18 ，筛选并建立金莲清热制剂的药
效成分库；再利用pubchem 数据库获取药效成分的canonical smiles 序列并导入swisstargetprediction 数据库，设置种属为“homo sapiens”，取可能性分值大于0作为药效成分靶点；最后在genecards 数据库中以“covid-19”、“sars-cov-2”为关健词检索新型冠状病毒肺炎相关靶点，以“febrile”、“heat generation”为关键词检索发热相关靶点，将新型冠状病毒肺炎和发热相关检索项下相关性分数大于均值的相关靶点合并，共同作为二者的作用靶点。
6.其中，所述步骤具体方法为：使用tbtools对金莲清热制剂成分靶点与冠状病毒作用靶点进行映射并绘制韦恩图，得到金莲清热制剂抗冠状病毒感染的潜在作用靶点；将化合物及归属药材、靶点信息导入cytoscape 3.7.1 软件中构建金莲清热制剂抗冠状病毒感染的潜在作用靶点互作网络和潜在药效成分-作用靶点网络；再将映射后的靶点导入string数据库，得到潜在作用靶点蛋白互作关系，去除孤立节点，下载*.tsv格式原始数据格式文件导入cytoscape 3.7.1建立ppi，并使用network analyzer插件计算网络拓扑学参数。
7.其中，所述步骤具体方法为：将金莲清热制剂抗冠状病毒感染的潜在作用靶点上传至david 6.8 数据库，使用david对筛选靶点进行go分析和kegg富集分析；所述go分析分为bp、cc和mf三个途径。
8.其中，所述步骤具体方法为：将筛选得到的核心靶点与活性成分进行分子对接，所述分子对接是从uniprot数据库中检索获取对应各靶点的pdb id，从rcsb pdb数据库下载各靶点的x射线衍射3d高分辨结构文件，将受体导入autodock tools 1.5.6中，进行添加极性氢、计算电荷、赋值ad4原子类型等操作，与配体分别导出*.pdbqt格式文件。药物活性成分由open babel 批量转换为*.pdb格式文件，并导入autodock tools 转换为*.pdbqt格式文件。grid box尺寸设置尺寸及格点步长，再使用vina与python脚本进行批量半柔性分子对接。
9.具体的，所述grid box尺寸设置为126*126*126埃米大小，格点步长为1，再使用vina和python脚本进行批量半柔性分子对接。
10.其中，所述金莲清热制剂，按重量份计由以下原料制成：1500份金莲花、1500份大青叶、1125份石膏、750份知母、750份地黄、750份玄参、1125份炒苦杏仁；所述金莲清热制剂制备方法为：按重量配比称取金莲花、大青叶、石膏、知母、地黄、玄参、炒苦杏仁混合，加水煎煮二次，第一次加7～8倍量水，煎煮2小时；第二次 加5～6倍量水，煎煮1小时，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至相对密度50℃热测为1.05～1.40的清膏，真空干燥，粉碎成细粉，再根据需要加入一种或多种药学上可接受的辅料，制成药学上可接受的剂型。
11.优选的，金莲清热制剂剂型为胶囊剂、颗粒剂、片剂、溶液剂、丸剂、喷雾剂、直肠给药制剂、注射剂。
12.更优选的，金莲清热制剂剂型为泡腾片。
13.本发明的有益效果体现在：1、通过网络药理学分析评价，能快速找出金莲清热泡腾片治疗新型冠状肺炎及发热病的作用机理，为临床提供参考。
14.2、通过网络药理学分析评价，还能快速分析出中药治疗相应疾病的作用机理，为
临床提供参考。
15.附图说明
16.图1是金莲清热泡腾片治疗新型冠状肺炎及其发热症共有靶点映射条目韦恩图，其中，左图为金莲清热泡腾片治疗新型冠状肺炎潜在靶点图；右图为金莲清热泡腾片治疗新型冠状肺炎解热潜在靶点图；图2是金莲清热泡腾片潜在药效成分-作用靶点网络图；图3是金莲清热泡腾片治疗新型冠状肺炎及其发热症蛋白-蛋白相互作用网络图，其中左图：为金莲清热泡腾片治疗新型冠状病毒肺炎蛋白互作网络图；右图：为金莲清热泡腾片治疗新型冠状病毒肺炎解热作用蛋白互作网络图；图4 是金莲清热泡腾片抗新型冠状肺炎kegg通路富集分析结果图；图5 是ras信号通路模式图；图6是对接细节展示图。
17.具体实施方式
18.为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚明白，现结合具体实施例（金莲清热泡腾片抗新型冠状病毒肺炎发热症的网络药理学研究）及附图对本发明的技术方案作进一步的详细说明，该实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
19.1 分析方法1.1药效成分及相关靶点分析从tcmsp数据库（ https://tcmspw.com/tcmsp.php）中获取金莲花、苦杏仁、大青叶、玄参、地黄、知母的化学成分，石膏成分以caso4·
2h2o计。筛选条件设置口服生物利用度（oralbioavailability ， ob ） 大于30% 和类药性（drug-likeness，dl）大于0.18 建立金莲清热泡腾片的药效成分库。
20.利用pubchem 数据库（ https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/search/）获取药效成分的canonical smiles 序列并导入swisstargetprediction 数据库（http://www.swisstargetprediction.ch/），设置种属为“homo sapiens”，基于二维/三维结构相似性预测化合物靶点，取可能性分值大于0作为金莲清热泡腾片药效成分靶点。
21.利用genecards 数据库（ http://www.genecards.org/），以
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covid-19”、“sars-cov-2”为关键词检索新型冠状病毒肺炎相关靶点，以“febrile”、“heat generation”为关键词检索发热相关靶点；将新型冠状病毒肺炎和发热相关检索项下相关性分数大于均值的相关靶点合并，共同作为二者的作用靶点。
22.1.2 网络构建使用tbtools对金莲清热泡腾片成分靶点与冠状病毒作用靶点进行映射并绘制韦恩图，得到金莲清热泡腾片抗冠状病毒感染的潜在作用靶点。将化合物及归属药材、靶点信息导入cytoscape 3.7.1 软件中构建金莲清热泡腾片抗冠状病毒感染的潜在作用靶点互作网络和金莲清热泡腾片潜在药效成分-作用靶点网络。
23.映射后的靶点导入string数据库（https://stringdb.org/），得到潜在作用靶点蛋白互作关系。去除孤立节点，下载*.tsv格式原始数据格式文件导入cytoscape 3.7.1建立ppi，并使用network analyzer插件计算网络拓扑学参数。
24.1.3 富集分析金莲清热泡腾片抗新型冠状病毒感染的潜在作用靶点上传至david 6.8 数据库，使用david对筛选靶点进行go（gene ontology）分析和kegg富集分析。在go分析中，分为bp（biological process, 生物过程），cc（cell component, 细胞组分）和mf（molecular function, 分子功能）三个途径。
25.1.4 分子对接将筛选得到的核心靶点与相应的活性成分进行分子对接。从uniprot数据库中检索获取对应各靶点的pdb id，从rcsb pdb数据库（https://www.rcsb.org/）下载各靶点的x射线衍射3d高分辨结构文件。将受体导入autodock tools 1.5.6中，进行添加极性氢、计算电荷、赋值ad4原子类型等操作，与配体分别导出*.pdbqt格式文件。药物活性成分由open babel 批量转换为*.pdb格式文件，并导入autodock tools 转换为*.pdbqt格式文件。grid box尺寸设置为126*126*126埃米大小，格点步长为1，随即使用vina与python脚本进行批量半柔性分子对接。
26.2 试验结果2.1 金莲清热泡腾片的药效成分及相关靶点tcmsp数据库中得到金莲花、苦杏仁、大青叶、玄参、地黄、知母和石膏的化学成分，经ob和dl筛选过后得到的潜在有效成分62个。从genecards 数据库获取到新冠肺炎相关靶点334个，发热相关靶点2992个。使用tbtools映射后共获得22个金莲清热泡腾片抗新型冠状病毒肺炎的潜在作用靶点与16个金莲清热泡腾片发挥解热的作用靶点（图1）。共有靶点信息如表1。
27.表 1 金莲清热泡腾片治疗新型冠状病毒肺炎潜在靶点
commonnametargetuniprotidtargetclassegfr*epidermalgrowthfactorreceptorerbb1p17612kinasesigmar1*sigmaopioidreceptorq9hc97familyagprotein-coupledreceptorcoq8b*uncharacterizedaarfdomain-containingproteinkinase4q9hc97familyagprotein-coupledreceptorctsl*cathepsinlp10275nuclearreceptorprkaca*camp-dependentproteinkinasealpha-catalyticsubunitp14550enzymepitrm1presequenceprotease,mitochondrialq9hc97familyagprotein-coupledreceptorctsb*cathepsin(bandk)p10275nuclearreceptorace*angiotensin-convertingenzymep14550enzymerhoa*transformingproteinrhoaq9hc97familyagprotein-coupledreceptorhdac2*histonedeacetylase2p00915lyasetbk1*serine/threonine-proteinkinasetbk1q9hc97familyagprotein-coupledreceptorpabpc1polyadenylate-bindingprotein1q9hc97familyagprotein-coupledreceptorbrd4bromodomain-containingprotein4p14550enzymevegfa*vascularendothelialgrowthfactoraq9hc97familyagprotein-coupledreceptoril6*interleukin-6p00915lyasepola1dnapolymerasealphasubunitp17612kinasebrd2*bromodomain-containingprotein2p14550enzymeusp13ubiquitincarboxyl-terminalhydrolase13q9hc97familyagprotein-coupledreceptorcsnk2a2*caseinkinaseiialpha(prime)p10275nuclearreceptordpp4*dipeptidylpeptidaseivp17612kinasecomt*catecholo-methyltransferasep10275nuclearreceptor
agtr2angiotensiniireceptorp14550enzyme
注：带
*
号为金莲清热泡腾片解热作用靶点2.2 网络构建金莲清热泡腾片潜在药效成分-作用靶点示意图如图2，使用菱形节点代表所属药材，椭圆形节点代表活性成分，v形节点代表抗新型冠状病毒肺炎的潜在活性靶点（其中深色代表同时具有解热作用相关靶点），使用“边”建立节点之间的联系，发现金莲清热泡腾片的30个潜在活性化合物来自六种所属药材，与22个潜在作用靶点药效成分存在相关性（由于石膏靶点与covid-19未获取到映射靶点，因此为孤立节点）。该网络有57个节点、99条边，参数如下：平均相邻节点数3.474，特征路径长度3.168，网络密度0.062。
28.使用string数据库对金莲清热泡腾片抗新型冠状病毒感染的22个潜在靶点进行分析，得到潜在作用靶点蛋白互作关系。去除孤立节点后的原始数据格式文件导入cytoscape 3.7.1建立ppi，并使用network analyzer插件计算网络拓扑学参数，发现该网络il6（interleukin-6 ，degree: 9）、vegfa（vascular endothelial growth factor a，degree: 9）ace（血管紧张素转化酶，degree: 5）在网络中度值最高，为核心靶点。
29.2.3 go分析和kegg通路富集分析使用david对22个靶点进行go分析和kegg通路富集分析。
30.bp途径44条，和积极的调控细胞增殖、积极的监管rna聚合酶ii启动子的转录等相关；cc途径有9条，与细胞外体、细胞膜等相关；mf途径有14条，与蛋白结合、染色质绑定、蛋白激酶活性等关系密切。
31.kegg通路富集分析显示共有17条通路可能与金莲清热泡腾片抗新冠肺炎感染分子作用机制相关，其中信号通路主要集中于ras 信号通路、肾素-血管紧张素系统、肾素分泌、hif-1信号通路、wnt信号通路和rap1信号通路（图4）。其中肾素-血管紧张素系统是新冠肺炎后期干预炎性因子风暴的重要途径（图5），此外还和多种病毒感染性通路相关如单纯疱疹感染、朊病毒病、病毒性致癌相关。
32.3 分子对接验证解热相关靶点 综合ppi与富集分析结果，我们可以确定解热相关核心靶点为il6、vegfa、ace，为进一步探索各成分与核心镇咳相关靶点间的作用程度，在rcsb pdb数据库检索三个靶点的x射线高分辨晶体结构（pdb id依次为il6: 4cni；vegfa: 4zff；ace: 5amb，使用vina与python脚本进行批量半柔性分子对接，计算结合能，结合能的数值越低，表明预测的配体与受体结合越紧密，并根据每个活性成分的最优结合能之和进行排序。分子结合能之和前三的成分结合能见表2，对接细节图见图6，mol001677、mol002309、mol004908三个效优活性成分依次来自知母、大青叶、苦杏仁。
33.表 2 分子对接效优成分结合能（单位：kcal/mol）molid(il-6)4cnivegfa(4zff)ace(5amb)mol001677-6.6-6.3-8.7mol002309-8.3-7.8-8.7mol004908-8.6-8.6-9.0