一种含有金诺芬和巯基化合物的抗癌组合物及其应用

1.本发明属于药用组合物领域，具体涉及一种含有金诺芬和巯基化合物的抗癌组合物及其应用。


背景技术：

2.以顺铂为代表的金属药物是重要的临床抗癌药物，但许多肿瘤对铂类药物具有先天耐药性或随着使用剂量增大而产生的耐药性，而且在使用过程中患者容易产生较强的不良反应(如骨髓抑制、胃肠道反应、肾脏毒性、神经毒性、过敏反应、电解质紊乱及肝功能损害)，因此，其实际应用受到了极大的限制。
3.金诺芬为一种口服抗风湿药，主要用于活动性类风湿性关节炎治疗。在早期研究中，金诺芬可以有效延长接种了急性淋巴白血病细胞p388的小鼠的寿命。然而，后续研究表明，在几种实体瘤模型中，金诺芬(通过腹腔注射给药)既不能延长老鼠寿命，也不能抑制肿瘤生长。
4.因此，进一步验证并探究金诺芬是否具有稳定的抗癌活性，以及其抗癌效果的机制。而且金诺芬与其他药物的联合抗癌效果也尚未有公开，对于其药物联用发挥抗癌效果的机制对于抗癌药物的研发具有重要意义。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种组合物；
6.本发明的另一目的在于提供一种药物；
7.本发明的另一目的在于提供一种细胞增殖抑制剂；
8.本发明的另一目的在于提供上述组合物在制备抗癌活性药物中的应用；
9.本发明的另一目的在于提供上述组合物在制备细胞增殖抑制剂中的应用；
10.本发明的另一目的在于提供上述组合物在制备trxr酶抑制剂中的应用；
11.本发明的另一目的在于提供巯基化合物作为金诺芬的增效剂在制备trxr酶抑制剂中的应用。
12.本发明所采取的技术方案是：
13.本发明的第一个方面，提供：
14.一种组合物，该组合物含有金诺芬和巯基化合物。
15.由于金诺芬在进入人体后会迅速与人血清白蛋白(human serum albumin，hsa)结合(细胞膜上的硫醇蛋白会与金离子结合)，使金离子的有效摄取量降低，降低了金诺芬的细胞毒性，使其无法发挥有效的癌症抑制效果。本发明中的组合物中含有巯基化合物，可以抑制体内金诺芬与血液蛋白中的巯基结合，以此增强金诺芬的细胞摄取，进而调控金诺芬的体内抗癌活性。
16.利用金诺芬的配体交换性质以及与巯基的高亲和性质，通过加入特定的含巯基化合物，可以恢复金诺芬的体内抗癌活性，证明与含有巯基的亲脂性小分子联用时，金诺芬具
备更高的抗癌活性。
17.巯基化合物包括结构式如式i所示的化合物或式i所示化合物的盐；其中，式i结构式如下：
18.r
‑
sh
19.式i；
20.r选自任意基团；
21.进一步地，上述式i所示化合物的盐为金属盐；
22.更进一步地，上述巯基化合物为β
‑
巯基乙醇、巯基乙胺、甲硫基咪唑、丙硫氧嘧啶、二硫苏糖醇、n
‑
乙酰半胱氨酸、谷胱甘肽、硫代硫酸钠、硫代磷酸钠、二乙基二硫代氨基甲酸钠或1
‑
硫代
‑
β
‑
d
‑
葡萄糖四乙酸酯中的一种或多种。
23.当然，可以根据实际需求，上述金诺芬的乙酰化的巯基糖配体还可以包括巯基甘露糖、巯基葡萄糖、巯基蔗糖或其他巯基糖类修饰的金诺芬配体。
24.更进一步地，上述巯基化合物的添加量需在无毒剂量范围内。
25.本发明的第二个方面，提供：
26.一种药物，该药物含有上述组合物。
27.本发明中的药物中含有巯基化合物，可以抑制体内金诺芬与血液蛋白中的巯基结合，以此增强金诺芬的细胞摄取，进而调控金诺芬的体内抗癌活性。
28.本发明的第三个方面，提供：
29.一种细胞增殖抑制剂，该细胞增殖抑制剂含有上述组合物。
30.发明人发现，在单独给药金诺芬或者含巯基化合物时，均不能抑制肿瘤的生长，而当金诺芬和含巯基化合物联合应用时，显示出极强的肿瘤生长抑制效果。
31.进一步地，上述细胞包括结肠癌细胞、肝癌细胞、肺癌细胞、胃癌细胞、宫颈癌细胞和乳腺癌细胞。
32.更进一步地，上述结肠癌细胞为人结肠癌细胞；
33.更进一步地，上述肝癌细胞为人肝癌细胞
34.更进一步地，上述肺癌细胞为人肺癌细胞
35.更进一步地，上述乳腺癌细胞为人乳腺胞癌细胞。
36.本发明的第四个方面，提供：
37.上述组合物在制备抗癌活性药物中的应用。
38.进一步地，上述癌包括结肠癌、肝癌、肺癌、胃癌细胞、宫颈癌细胞和乳腺癌。
39.本发明的第五个方面，提供：
40.上述组合物在制备细胞增殖抑制剂中的应用。
41.进一步地，上述细胞为癌细胞；所述癌细胞包括结肠癌细胞、肝癌细胞、肺癌细胞、胃癌细胞、宫颈癌细胞和乳腺癌细胞。
42.本发明的第六个方面，提供：
43.上述组合物在制备trxr酶抑制剂中的应用。
44.本发明的第七个方面，提供：
45.巯基化合物作为金诺芬的增效剂在制备trxr酶抑制剂中的应用。
46.巯基化合物为含有巯基的化合物。
47.进一步地，上述巯基化合物包括巯基化合物包括β
‑
巯基乙醇、巯基乙胺、甲硫基咪唑、丙硫氧嘧啶、二硫苏糖醇、n
‑
乙酰半胱氨酸、谷胱甘肽、硫代硫酸钠、硫代磷酸钠、二乙基二硫代氨基甲酸钠或1
‑
硫代
‑
β
‑
d
‑
葡萄糖四乙酸酯中的一种或多种。
48.本发明的有益效果是：
49.本发明发现，金诺芬在正常生理条件下不能高效抑制hct116人结肠癌细胞、a549人肺癌细胞、mcf
‑
7人乳腺胞癌细胞和hepg
‑
2人肝癌细胞的增殖(ic
50
值大于30μm)；而当加入无毒剂量的含巯基化合物(β
‑
巯基乙醇，1
‑
硫代
‑
β
‑
d
‑
葡萄糖四乙酸酯等)时，金诺芬则对上述4种癌细胞均表现出优异的抑制作用，其中包括抑制trxr和肿瘤细胞增殖。小鼠体内肿瘤模型实验也表明，在联合含巯基化合物时，金诺芬可以很好地抑制肿瘤的生长，表明金诺芬和巯基化合物联用可作为抗癌药物组合进行应用。此外，由于可以调节本发明所述巯基化合物的种类，进而调节金诺芬在肿瘤组织的吸收，从而在体内抗癌上具有较好的选择性。
附图说明
50.图1为金诺芬联用各种巯基化合物对trxr酶活性抑制效果示意图；
51.图2为金诺芬联用tgta在小鼠体内肿瘤模型中的对肿瘤体积的影响；
52.图3为金诺芬联用tgta在小鼠体内肿瘤模型中的对小鼠体重影响；
53.图4为金诺芬联用tgta在小鼠体内肿瘤模型中的实际效果，其中，a为肿瘤的图像，b为小鼠的图像；
54.图5为金诺芬联用β
‑
巯基乙醇在小鼠体内肿瘤模型中的对肿瘤体积的影响；
55.图6为金诺芬联用β
‑
巯基乙醇在小鼠体内肿瘤模型中的对小鼠体重的影响；
56.图7为金诺芬联用β
‑
巯基乙醇在小鼠体内肿瘤模型中的肿瘤的图像。
具体实施方式
57.为了使本发明的发明目的、技术方案及其技术效果更加清晰，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明。
58.所使用的实验材料和试剂，若无特别说明，均为常规可从商业途径所获得的耗材和试剂。
59.金诺芬联用各种巯基化合物对多种癌细胞的抑制活性的影响
60.(1)癌细胞的培养
61.取培养有实验所需癌细胞的培养瓶，弃原培养液，用2ml pbs清洗三遍，加入1ml胰酶消化30s，加2ml培养基终止消化。将细胞转移到离心管，1000转离心3min，弃上清，加2ml培养液吹打10次混匀。取10μl细胞悬液到细胞计数中，计数；铺96孔板，按每孔种5000个细胞，每个化合物3个复孔计算需要细胞量与细胞孔量，通过细胞计数计算所需细胞悬液量，培养基稀释所需细胞数量，每孔5000个细胞，100μl培养基铺板，吸打混匀，利用排枪种细胞，置于培养箱培养，做好标记。
62.(2)取步骤(1)中培养完成的细胞，弃去原有培养基，将金诺芬母液稀释为终浓度分别为0、0.78125、1.5625、3.125、6.25、12.5、25、50、100μm的稀释液，混合均匀，利用排枪(使用其中3个孔)每孔吸取100μl稀释液，倾斜96孔板，往标记好的相应的3个孔加入稀释液
(防止戳伤细胞)，每个浓度稀释液依次加入，加入后吹吸3次左右混匀，各个化合物依次类推，做好标记，左右前后轻晃3次，放入co2培养箱培养。
63.加入金诺芬培养1小时后，将含巯基化合物母液稀释成1m，混合均匀，利用排枪(使用其中3个孔)每孔吸取20μl稀释液，倾斜96孔板，往标记好的相应的3个孔加入稀释液(防止戳伤细胞)，依次加入不同巯基化合物，加入后吹吸3左右混匀，放回培养箱继续培养。
64.(3)mtt比色法检测癌细胞增殖抑制效果
65.加入不同巯基化合物作用细胞24小时后，用排枪每孔加20μl mtt至96孔板中(mtt浓度为5mg/ml在pbs里)；37℃孵育4小时，孵育时间结束后，吸掉mtt混合液，利用排枪按130μl/孔加入dmso；水平摇床摇10min，待甲瓒(formazan)充分溶解，用酶标仪在490nm波长下检测吸光度，按要求计算细胞在各浓度药物下存活率，作散点图，得到金诺芬联用各化合物(含10％fbs或40mg/ml bsa)对癌细胞增殖的ic50结果如表1和2所示，其中，以单独使用金诺芬(不含bsa/fbs)作为对照组，单独使用金诺芬的ic50结果如表3所示。
66.表1金诺芬联用各化合物(含10％fbs)对癌细胞增殖的抑制效果
[0067][0068]
其中，“+”表示添加。
[0069]
表2金诺芬联用200μm各化合物(含40mg/ml bsa)对癌细胞增殖的抑制效果
[0070][0071]
其中，“+”表示添加。
[0072]
表3单独使用金诺芬(不含bsa/fbs)对癌细胞增殖的抑制效果
[0073][0074]
其中，“+”表示添加。
[0075]
根据表1
‑
2的结果，进一步对金诺芬联用各化合物(含30％fbs)对hct116人结肠癌
细胞杀伤效果和金诺芬
‑
tgta(50μm)联用时对其他癌细胞(肺癌、结肠癌、乳腺癌、肝癌、宫颈癌和胃癌细胞)的杀伤效果进行检测，检测方法采用上述方法。
[0076]
结果如表4和表5所示。
[0077]
表4金诺芬联用各化合物(含30％fbs)对hct116人结肠癌细胞的杀伤效果
[0078][0079]
表5金诺芬和tgta(50μm)分别以及联用对不同细胞系的细胞存活率影响
[0080][0081]
由表1
‑
5的结果可知，在正常生理条件(在空培养基中加入fbs或者bsa可模拟生理条件下的高巯基环境)下，金诺芬对hct116人结肠癌细胞、a549人肺癌细胞、mcf
‑
7人乳腺胞癌细胞、pc9人肺癌细胞、hela人宫颈癌细胞、mgc803人胃癌和hepg
‑
2人肝癌细胞的抑制作用不明显；而当加入无毒剂量的含巯基化合物，金诺芬则对上述7种癌细胞均表现出优异的抑制作用。
[0082]
巯基化合物对金诺芬trxr酶活性抑制效果的强化
[0083]
检测步骤如下：
[0084]
以hepg2细胞为试验对象。
[0085]
将细胞以2
×
105个/孔接种在6孔板中，孵育24小时。
[0086]
孵育结束后，将细胞培养基换成含30％fbs，模拟正常生理条件下的高浓度巯基环境。不加入任何试剂作为对照组，实验组加入金诺芬0.5μm，37℃孵育30min。加入巯基化合物(dedt、β
‑
巯基乙醇或巯基乙胺)孵育30min(体系中dmso的终浓度≤1％)。将孵育后的细胞用pbs洗涤3次，加入100μl冰冷的裂解缓冲液(含有50mm ph 7.4的磷酸盐缓冲液，1mm edta和0.1％triton
‑
x 100)，在冰上进行细胞裂解5分钟，收集细胞裂解液。
[0087]
在收集的细胞裂解液(10μg蛋白)中加入100μl缓冲液(含有50mm ph 7.4的磷酸钾、1mm edta和0.2mm nadph)中，加入5,5'
‑
二硫代双(2
‑
硝基苯甲酸)(dtnb，终浓度为3mm)引发反应，trxr活性可根据10分钟内的od值增加量(od值检测波长为410nm)得到。其中，单独给药金诺芬为阳性对照样品，空白组为阴性性对照。
[0088]
结果如表6和图1所示。
[0089]
表6各试验组对trxr酶活性的抑制效果
[0090][0091]
由表6可知，在不含fbs条件(即模拟体外条件)下，金诺芬可以将细胞内trxr酶活抑制到15.9％；然而在30％fbs条件(模拟体内条件)下，金诺芬抑制酶活的能力降低，只能将细胞内trxr酶活抑制到63.6％。但是，当加入含巯基化合物，即使在30％fbs条件下，金诺芬抑制酶活的能力有了很大提高；相对于没加入含巯基化合物，金诺芬抑制酶活能力提高3倍多。
[0092]
金诺芬联用各种巯基化合物对金诺芬细胞吸收的影响
[0093]
检测步骤如下：
[0094]
以hepg2细胞为试验对象。
[0095]
将细胞以2
×
105个/孔接种在6孔板中，孵育24小时。
[0096]
孵育结束后，将细胞培养基换成含30％fbs，模拟正常生理条件下的高浓度巯基环境。
[0097]
不加入任何试剂作为对照组，实验组加入3μm金诺芬，37℃孵育10min。加入巯基化合物(dedt、β
‑
巯基乙醇或巯基乙胺)孵育1h(体系中dmso的终浓度≤1％)。将孵育后的细胞立即用pbs洗涤3次，每孔加入500μl超纯水破裂细胞，15min后，收集细胞裂解液。
[0098]
在收集的细胞裂解液中加入王水溶解，之后用超纯水稀释到适当比例。采用电感
耦合等离子体质谱(inductively coupled plasma mass spectrometry，icp
‑
ms)进行金元素检测。以不含fbs条件下的3μm金诺芬细胞吸收率作为对照。
[0099]
结果如表7所示。
[0100]
表7各试验组对金诺芬细胞吸收率的影响
[0101][0102]
其中，上述吸收量为细胞内每g蛋白含有的金含量(mg)。
[0103]
由表7可知，在不含fbs条件下，金诺芬为参照，金的吸收量达到728mg/g蛋白。可是，当提高培养基中fbs的浓度后，金的吸收迅速降低；当加入巯基化合物后(β
‑
巯基乙醇，dedt)，金诺芬的吸收有了很大提高。这说明，加入巯基化合物以后，金诺芬在细胞内的吸收得到了提高。
[0104]
金诺芬联用各种巯基化合物在小鼠体内肿瘤模型中的实际抑制效果
[0105]
检测步骤如下：
[0106]
建立小鼠肿瘤模型：将悬浮于pbs中的200万个结肠癌细胞hct116细胞皮下注射到5
‑
7周龄的雌性balb/cann nu(nude)小鼠背侧，建立异种移植模型。
[0107]
当肿瘤体积达到约50mm3(肿瘤接种后3
‑
4天)时，将小鼠随机分为对照组(使用玉米油)和治疗组，治疗组用金诺芬(3mg/kg小鼠体重/day)联用不同巯基化合物(β
‑
巯基乙醇或tgta，40mg/kg小鼠体重/day)进行治疗，每天腹腔注射一次，当肿瘤体积长到1000mm3后，麻醉小鼠然后脱颈椎处死小鼠。
[0108]
结果如图2
‑
7所示。
[0109]
对照组、单独给药金诺芬组或者单独给药巯基化合物组，其肿瘤的生长并未得到有效抑制；当金诺芬和巯基化合物联合应用时，肿瘤的生长被很大程度抑制。
[0110]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。